一種多價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗各型特異性糖含量的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種多價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗各型特異性糖含量的檢測方法，所述方法，步驟如下：步驟一：將各型單價(jià)莢膜多糖蛋白結(jié)合物按糖濃度配制成一定濃度的溶液；步驟二：取肺炎球菌結(jié)合疫苗，第一份不加步驟一的結(jié)合物溶液，從第二份開始，加入步驟一的結(jié)合物溶液，加入的體積依次遞增，全部樣品用溶劑稀釋至同樣體積；步驟三：每份中加入堿解吸附，再用酸中和，作為定標(biāo)品；步驟四：定標(biāo)品與檢測試劑反應(yīng)，以加入的結(jié)合物溶液的糖含量為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；步驟五：將標(biāo)準(zhǔn)曲線外推至含量軸，在含量軸上的截距，即為肺炎球菌結(jié)合疫苗中單價(jià)結(jié)合物的糖含量。
【專利說明】
-種多價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗各型特異性糖含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種生物制品檢測方法，具體設(shè)及一種多價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗各型特 異性糖含量的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在多價(jià)疫苗的質(zhì)量控制中，對(duì)各組分的定量檢測是重要的項(xiàng)目之一。目前，多價(jià)疫 苗中各組分的定量檢測方法包括：
[0003] 化學(xué)顯色
[0004] 疫苗中某些組分在特定波長范圍內(nèi)具有光吸收，或經(jīng)化學(xué)處理后，形成具有光吸 收的物質(zhì)，其光吸收程度與含量有相關(guān)關(guān)系，可用于含量檢測。例如，A群C群腦膜炎球菌多 糖結(jié)合疫苗中的C群多糖，唾液酸是其有效成分之一，采用間苯二酪對(duì)C群腦膜炎球菌多糖 中唾液酸抽提后，在585nm處有最大吸光值。該法的局限性在于，大部分多價(jià)疫苗中的各組 分化學(xué)性質(zhì)相近，尋找針對(duì)其中一個(gè)組分的化學(xué)處理方法比較困難。
[0005] 色譜分析
[0006] 陰離子色譜法用于多種單糖、雙糖、寡糖、多糖的分析。例如，A群C群腦膜炎球菌多 糖疫苗中的A群多糖，經(jīng)酸水解處理后，產(chǎn)生6-憐酸甘露糖胺單體，采用高效陰離子交換色 譜-脈沖安培檢測法測定其含量。該法的局限性在于，實(shí)現(xiàn)多價(jià)疫苗中各組分的基線分離困 難，色譜條件復(fù)雜，對(duì)試劑和環(huán)境要求高。
[0007] 酶聯(lián)免疫吸附
[000引雙抗體夾屯屯LISA法常用于抗原的定量檢測。A、C、W135和Y群四價(jià)腦膜炎球菌多糖 疫苗中各血清群多糖蛋白結(jié)合物含量檢測采用雙抗體夾屯、定量化ISA法。此方法需要制備 各群多糖特異性單抗作為捕獲抗體。單抗制備成本較高，產(chǎn)量較低，很難適應(yīng)規(guī)模化檢測需 要。
[0009] 免疫火箭電泳
[0010] 免疫火箭電泳通過參照已知濃度的多糖在相同凝膠中的遷移率，對(duì)待測的不同濃 度的多糖的遷移速率進(jìn)行線性回歸分析，可W初步計(jì)算多糖含量。該法操作過程復(fù)雜，是粗 略測定多糖含量的一種方法。
[00川速率比濁
[0012] 速率比濁法是一種免疫化學(xué)方法，用于多價(jià)疫苗各型特異性糖含量的檢測。該方 法W多糖作為抗原，在抗體過量存在的條件下，形成抗原抗體復(fù)合物聚集體的速率與體系 中存在的抗原量成一定的比例關(guān)系。利用該原理可檢測混合物中某一多糖抗原的含量。速 率比濁法操作簡便快捷，自動(dòng)化程度高，不同的多糖可采用相同參數(shù)設(shè)置進(jìn)行檢測，可適應(yīng) 規(guī)模化檢測的需要。
[0013] 常規(guī)的特異性糖含量檢測，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，在抗原量充足的條件下，可W得到很 好的檢測結(jié)果，如23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗各型特異性糖含量的檢測即采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。但 當(dāng)抗原量較少，且反應(yīng)體系成分較復(fù)雜時(shí)，容易造成反應(yīng)靈敏度降低、檢測結(jié)果波動(dòng)較大的 問題。
[0014] 多價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗，如：屯價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗，包括7種血清型（4、6B、9V、 14、18C、19F和23F)，13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗等均為為已經(jīng)上市的疫苗，其中每個(gè)型多糖含 量遠(yuǎn)低于肺炎球菌多糖疫苗，而且含有侶佐劑成分，若采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，則檢測效率降低， 對(duì)檢測試劑要求提高。若采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，則可W有效地解決W上問題，并且W待檢測的疫 苗作為定標(biāo)物質(zhì)，消除了定標(biāo)品與檢品之間的成分差異，更具合理性。因此，肺炎球菌結(jié)合 疫苗各型特異性糖含量的檢測采用標(biāo)準(zhǔn)加入法是非常有效的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有的肺炎球菌結(jié)合疫苗各型特異性糖含量檢測方法靈敏 度低、檢測結(jié)果波動(dòng)大的問題，而提供一種肺炎球菌結(jié)合疫苗各型芙膜多糖蛋白結(jié)合物中 多糖含量的檢測方法。
[0016] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的策略為：W待測結(jié)合疫苗為定標(biāo)品，通過梯度添 加待測型別單價(jià)結(jié)合物的方式，獲得測定曲線，進(jìn)而獲得待測物含量。
[0017] 多價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗的組成為多種單價(jià)肺炎球菌芙膜多糖蛋白結(jié)合物混合組 成的疫苗，其中的肺炎球菌芙膜多糖為但不限于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、 19A、19F、23F型肺炎球菌芙膜多糖，蛋白為載體蛋白，選自但不限于白喉類毒素、破傷風(fēng)類 毒素等。多糖和蛋白的結(jié)合采用但不限于CDAP法。
[0018] 多價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗的效價(jià)是W肺炎球菌芙膜多糖的含量計(jì)算的，為對(duì)疫苗的 效價(jià)進(jìn)行評(píng)定，需要對(duì)肺炎球菌芙膜多糖的含量進(jìn)行檢測，而現(xiàn)有技術(shù)的檢測方法存在多 種缺陷。
[0019] 為此，本發(fā)明提供一種多價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗中各型芙膜多糖的糖含量的檢測方 法，所述方法，步驟如下：
[0020] 步驟一:將各型單價(jià)芙膜多糖蛋白結(jié)合物按糖濃度配制成一定濃度的溶液；
[0021 ]步驟二:取肺炎球菌結(jié)合疫苗，第一份不加步驟一的結(jié)合物溶液，從第二份開始， 加入步驟一的結(jié)合物溶液，加入的體積依次遞增，全部樣品用溶劑稀釋至同樣體積；
[0022] 步驟每份中加入堿解吸附，再用酸中和，作為定標(biāo)品；
[0023] 步驟四：定標(biāo)品與特異性血清反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為1.5-10分鐘，W加入的結(jié)合物溶液 的糖含量為橫坐標(biāo)，W散射光增加值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0024] 步驟五:將標(biāo)準(zhǔn)曲線外推至含量軸，在含量軸上的截距，即為肺炎球菌結(jié)合疫苗中 單價(jià)結(jié)合物的糖含量；
[0025] 所述步驟二中，每份肺炎球菌結(jié)合疫苗加入單價(jià)芙膜多糖蛋白結(jié)合物的體積不大 于總體積的10 %。每份肺炎球菌結(jié)合疫苗的體積均不小于總體積的90 %。每份樣品用稀釋 液稀釋至相同的體積，總體積不小于10化L。
[0026] 所述步驟S中，用于解吸附的堿為氨氧化鋼，配制成0.1M-10M的水溶液，堿的用量 是樣品量的0.001-1倍。所述步驟=中，用于中和的酸為巧樣酸，配制成0.1M-5M的溶液，用 酸調(diào)節(jié)抑值至檢品初始抑值。
[0027] 所述步驟四中反應(yīng)體系為：緩沖液體積為0-30化L，樣品量為3-75化、特異性血清 量為3-23扣L、反應(yīng)時(shí)間為1.5-10分鐘，所述緩沖液為:含有表面活性劑的憐酸緩沖生理鹽 水，其中憐酸緩沖生理鹽水為O. OIM-O. IM的溶液，所述表面活性劑為非離子型表面活性劑， 配制成0.05 %的溶液。
[00%]本發(fā)明的方法，W欲測組份的純物質(zhì)為內(nèi)標(biāo)品，即W組成多價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗 的各型單價(jià)結(jié)合物為內(nèi)標(biāo)品。W經(jīng)解吸附處理的檢品和相應(yīng)對(duì)照品的混合物為定標(biāo)品，繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即W肺炎球菌結(jié)合疫苗和各型單價(jià)結(jié)合物的混合物，經(jīng)解吸附處理后制備為 定標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0029] 本發(fā)明的方法，每個(gè)型別的糖含量檢測取用的肺炎球菌結(jié)合疫苗不少于兩份。
[0030] 本發(fā)明的方法，分別在若干份相同體積結(jié)合疫苗中加入不等量的對(duì)照品，且有一 份結(jié)合疫苗中加入的對(duì)照品為零，W加入對(duì)照品的糖含量為橫坐標(biāo)，反應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線，用外推法(延長標(biāo)準(zhǔn)曲線和橫坐標(biāo)相交的數(shù)的絕對(duì)值)得到檢品中對(duì)應(yīng)單價(jià)結(jié)合 物的糖含量。本發(fā)明的方法，所述步驟=中，用于解吸附的堿為堿性物質(zhì)配制的溶液，選自 無機(jī)堿或有機(jī)堿，可W采用一種堿或多種堿的混合物。無機(jī)堿是指堿金屬及堿±金屬的氨 氧化物(包括氨氧化錠），優(yōu)選氨氧化鋼，有機(jī)堿是指分子中含有氨基的有機(jī)化合物。所述氨 氧化鋼使用時(shí)配制成〇.〇〇謹(jǐn)-261的水溶液，優(yōu)選0.謹(jǐn)-101的水溶液。
[0031] 本發(fā)明的方法，所述步驟S中，用于中和的酸為含有邸TA、巧樣酸、氨基乙酸、氣離 子和/或氯離子的酸溶液，優(yōu)選巧樣酸溶液，使用時(shí)配制成0.001M-7M的溶液，優(yōu)選0.1M-5M 的溶液。
[0032] 本發(fā)明的方法，所述步驟=中，用于解吸附的堿的用量是樣品量的0.001-1倍。
[0033] 本發(fā)明的方法，所述步驟S中，用酸中和是調(diào)節(jié)酸堿混合溶液pH值至檢品初始pH 值。
[0034] 本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點(diǎn)如下：
[0035] 適應(yīng)復(fù)雜的反應(yīng)體系，在抗原含量相對(duì)較低的情況下提高信噪比；
[0036] 對(duì)血清本底要求降低，簡化血清純化過程；
[0037] 消除定標(biāo)品與檢品之間的成分差異，檢測手段更具合理性。
[0038] W下通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0039] 表1:2型肺炎球菌結(jié)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法定標(biāo)比較
[Qn>in1
[0041]如表所示:結(jié)合物糖含量較低時(shí)(2-化g)，散射光增加值不明顯，造成曲線平緩，若 檢品含量恰好在此范圍內(nèi)，容易造成檢測結(jié)果在2-4]ig范圍內(nèi)波動(dòng)，準(zhǔn)確性降低，通過標(biāo)準(zhǔn) 加入法，提高了結(jié)合物糖含量，曲線斜率明顯升高，有效克服了標(biāo)準(zhǔn)曲線法的缺陷。其次，低 濃度結(jié)合物糖含量的散射光增加值與反應(yīng)體系本底(結(jié)合物糖含量化g)差別不明顯，可能 達(dá)不到檢測要求的靈敏度，勢必需要提高定標(biāo)品的含量，標(biāo)準(zhǔn)加入法正符合此需求。最后， 許多情況下，結(jié)合疫苗含有佐劑或其它非結(jié)合物成分，如果采取標(biāo)準(zhǔn)曲線法，那么佐劑或其 它非結(jié)合物成分造成了定標(biāo)品和檢品的組成差異，運(yùn)種差異對(duì)檢測準(zhǔn)確性的影響需要進(jìn)一 步驗(yàn)證，如果采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，就消除了定標(biāo)品與檢品之間的成分差異，佐劑或其它非結(jié)合 物成分對(duì)檢測準(zhǔn)確性的影響將不存在。
【附圖說明】
[0042] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中肺炎球菌結(jié)合疫苗中2型肺炎球菌結(jié)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0043] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中肺炎球菌結(jié)合疫苗中7F型肺炎球菌結(jié)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0044] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中肺炎球菌結(jié)合疫苗中12F型肺炎球菌結(jié)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0045] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中肺炎球菌結(jié)合疫苗中18C型肺炎球菌結(jié)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0046] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例5中肺炎球菌結(jié)合疫苗中23F型肺炎球菌結(jié)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 實(shí)施例1肺炎球菌結(jié)合疫苗中2型肺炎球菌多糖含量的檢測
[004引取2型肺炎球菌結(jié)合物，用稀釋液將其稀釋成多糖濃度為13化g/mL的溶液。
[0049] 取肺炎結(jié)合疫苗五份，每份94化L，第一份不加肺炎球菌結(jié)合物，第二份加入加入 15化的肺炎球菌結(jié)合物，第S份加入加入30化的肺炎球菌結(jié)合物，第四份加入加入45化的 肺炎球菌結(jié)合物，第五份加入加入60化的肺炎球菌結(jié)合物，用稀釋液將五份混合溶液稀釋 至 ImL。
[0050] 每份混合溶液加入Imol/L氨氧化鋼溶液30化，混勻，加入Imol/L巧樣酸溶液如L， 混勻，此混合溶液即為定標(biāo)品。
[0051 ] 反應(yīng)體系為:緩沖液19化L，樣品量20化、試劑量20化、反應(yīng)時(shí)間2分鐘、增益值1。 [0052 ]圖1為肺炎球菌結(jié)合疫苗中2型肺炎球菌結(jié)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0053] 將標(biāo)準(zhǔn)曲線外推至含量軸，在含量軸上的截距，即為肺炎球菌結(jié)合疫苗中2型肺炎 球菌結(jié)合物的糖含量。從圖中可知，外加2型肺炎球菌結(jié)合物的糖含量與反應(yīng)值呈很好的線 性關(guān)系，R2 = 0.9989，線性回歸方程為y = 3.086X+15.854，其中X是結(jié)合物的糖含量，y是反 應(yīng)值。標(biāo)準(zhǔn)曲線在含量軸上的截距為5.14,即肺炎球菌結(jié)合疫苗中2型肺炎球菌結(jié)合物的糖 含量為5.1化g。
[0054] 實(shí)施例2肺炎球菌結(jié)合疫苗中7F型肺炎球菌多糖含量的檢測
[0055] 1.取7F型肺炎球菌結(jié)合物，用稀釋液將其稀釋成多糖濃度為13化g/mL的溶液。
[0056] 2. W下步驟同實(shí)施例1中步驟2-4。
[0057] 3.圖2為肺炎球菌結(jié)合疫苗中7F型肺炎球菌結(jié)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[005引4.將標(biāo)準(zhǔn)曲線外推至含量軸，在含量軸上的截距，即為肺炎球菌結(jié)合疫苗中7F型 肺炎球菌結(jié)合物的糖含量。從圖中可知，外加7F型肺炎球菌結(jié)合物的糖含量與反應(yīng)值呈很 好的線性關(guān)系，R2 = 0.9895,線性回歸方程為y = 0.49x+2,標(biāo)準(zhǔn)曲線在含量軸上的截距為 4.08，即肺炎球菌結(jié)合疫苗中7F型肺炎球菌結(jié)合物的糖含量為4.0祉g。
[0059] 實(shí)施例3肺炎球菌結(jié)合疫苗中12F型肺炎球菌多糖含量的檢測
[0060] 1.取12F型肺炎球菌結(jié)合物，用稀釋液將其稀釋成多糖濃度為13化g/mL的溶液。 [0061 ] 2. W下步驟同實(shí)施例1中步驟2-4。
[0062] 3.圖3為肺炎球菌結(jié)合疫苗中12F型肺炎球菌結(jié)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0063] 4.將標(biāo)準(zhǔn)曲線外推至含量軸，在含量軸上的截距，即為肺炎球菌結(jié)合疫苗中12F型 肺炎球菌結(jié)合物的糖含量。從圖中可知，外加12F型肺炎球菌結(jié)合物的糖含量與反應(yīng)值呈很 好的線性關(guān)系，R2 = 0.9878,線性回歸方程為y = 2.9985x+14.676,標(biāo)準(zhǔn)曲線在含量軸上的 截距為4.89，即肺炎球菌結(jié)合疫苗中12F型肺炎球菌結(jié)合物的糖含量為4.89iig。
[0064] 實(shí)施例4肺炎球菌結(jié)合疫苗中18C型肺炎球菌多糖含量的檢測
[0065] 1.取18C型肺炎球菌結(jié)合物，用稀釋液將其稀釋成多糖濃度為13化g/mL的溶液。
[0066] 2. W下步驟同實(shí)施例1中步驟2-4。
[0067] 3.圖4為肺炎球菌結(jié)合疫苗中18C型肺炎球菌結(jié)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0068] 4.將標(biāo)準(zhǔn)曲線外推至含量軸，在含量軸上的截距，即為肺炎球菌結(jié)合疫苗中18C型 肺炎球菌結(jié)合物的糖含量。從圖中可知，外加18C型肺炎球菌結(jié)合物的糖含量與反應(yīng)值呈很 好的線性關(guān)系，R2 = 0.9984，線性回歸方程為y = 1.005X+3.048，標(biāo)準(zhǔn)曲線在含量軸上的截 距為3.03，即肺炎球菌結(jié)合疫苗中18C型肺炎球菌結(jié)合物的糖含量為3.03iig。
[0069] 實(shí)施例5肺炎球菌結(jié)合疫苗中23F型肺炎球菌多糖含量的檢測
[0070] 1.取23F型肺炎球菌結(jié)合物，用稀釋液將其稀釋成多糖濃度為13化g/mL的溶液。
[0071] 2. W下步驟同實(shí)施例1中步驟2-4。
[0072] 3.圖5為肺炎球菌結(jié)合疫苗中23F型肺炎球菌結(jié)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0073] 4.將標(biāo)準(zhǔn)曲線外推至含量軸，在含量軸上的截距，即為肺炎球菌結(jié)合疫苗中23F型 肺炎球菌結(jié)合物的糖含量。從圖中可知，外加23F型肺炎球菌結(jié)合物的糖含量與反應(yīng)值呈很 好的線性關(guān)系，R2 = 0.9944，線性回歸方程為y = 2.131X+8.924，標(biāo)準(zhǔn)曲線在含量軸上的截 距為4.19,即肺炎球菌結(jié)合疫苗中23F型肺炎球菌結(jié)合物的糖含量為4.1化邑。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗中各型莢膜多糖的糖含量的檢測方法，其特征在于，所 述方法，步驟如下： 步驟一:將各型單價(jià)莢膜多糖蛋白結(jié)合物按糖濃度配制成一定濃度的溶液； 步驟二:取肺炎球菌結(jié)合疫苗，第一份不加步驟一的結(jié)合物溶液，從第二份開始，加入 步驟一的結(jié)合物溶液，加入的體積依次遞增，全部樣品用溶劑稀釋至同樣體積； 步驟三:每份中加入堿解吸附，再用酸中和，作為定標(biāo)品； 步驟四：定標(biāo)品與特異性血清反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為1.5-10分鐘，以加入的結(jié)合物溶液的糖 含量為橫坐標(biāo)，以散射光增加值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 步驟五:將標(biāo)準(zhǔn)曲線外推至含量軸，在含量軸上的截距，即為肺炎球菌結(jié)合疫苗中單價(jià) 結(jié)合物的糖含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟二中，每份肺炎球菌結(jié)合疫 苗加入單價(jià)莢膜多糖蛋白結(jié)合物的體積不大于總體積的10%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟二中，每份肺炎球菌結(jié)合疫 苗的體積均不小于總體積的90%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟二中，每份樣品用稀釋液稀 釋至相同的體積，總體積不小于100yL。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟三中，用于解吸附的堿為氫 氧化鈉，配制成0.1M-10M的水溶液，堿的用量是樣品量的0.001-1倍。6. 權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟三中，用于中和的酸為檸檬酸，配 制成0.1M-5M的溶液，用酸調(diào)節(jié)pH值至檢品初始pH值。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟四中反應(yīng)體系為:緩沖液體 積為0-300yL，樣品量為3-75yL、特異性血清量為3-235yL、反應(yīng)時(shí)間為1.5-10分鐘，所述緩 沖液為:含有表面活性劑的磷酸緩沖生理鹽水，其中磷酸緩沖生理鹽水為〇. 01M-0.1M的溶 液，所述表面活性劑為非離子型表面活性劑，配制成〇. 05 %的溶液。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK106018832SQ201610563165
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月16日
【發(fā)明人】胡月鳳, 朱衛(wèi)華, 杜琳
【申請(qǐng)人】北京智飛綠竹生物制藥有限公司