一種lc-ms/ms測定食品中亮黑和羅丹明b的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種LC?MS/MS測定食品中亮黑和羅丹明B的方法。本發(fā)明首先對樣品進(jìn)行粉碎、水浴加熱提取、離心、上清液調(diào)酸后，再利用自組裝的固相萃取凈化小柱(陽離子交換填料+陰離子交換填料)對樣品提取液進(jìn)行凈化處理，可在有效除去干擾物的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對亮黑的凈化、富集，并采用LC?MS/MS定量測定。該方法操作簡單，凈化效果好，靈敏度高，重現(xiàn)性好，符合食品添加劑分析標(biāo)準(zhǔn)，具有一定的新穎性和適用性。
【專利說明】
一種LC-MS/MS測定食品中亮黑和羅丹明B的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種食品中人工著色劑的測定方法，具體涉及一種食品中亮黑和羅丹 明B的固相萃取/LC-MS/MS方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人工合成著色劑是通過化學(xué)合成的方法生產(chǎn)的有機(jī)色素，主要以苯、甲苯、萘等芳 烴類化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過磺化、鹵化、偶氮化等一系列有機(jī)反應(yīng)化合而成。其成本低廉、色 澤鮮艷、著色力強(qiáng)、性能穩(wěn)定，在食品生產(chǎn)加工行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。但人工合成著色劑大多 為偶氮類化合物，過量食用可對人體有致畸致癌作用。近年來，為了加強(qiáng)對食用合成著色劑 的管理，許多國家對食用合成色素的理化性質(zhì)及安全性做了深入細(xì)致的研究，明確限定了 食用合成色素的使用品種、使用范圍及使用量。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織規(guī)定了亮黑PN INS151在不同食品基質(zhì)中使用范圍為12~500mg/kg;歐盟94/36/EC及(EU)No 1274/2013號 法規(guī)規(guī)定"加工魚和水產(chǎn)品，包括軟體動物和甲殼綱動物中可以使用E 151亮黑PN"，最大使 用量為250mg/kg;香港食品色素使用法規(guī)Chapter 132H允許使用亮黑，未規(guī)定限量;美國、 加拿大、日韓等國則嚴(yán)禁在加工食品中使用亮黑和羅丹明B，我國GB 2760-2014《食品安全 國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》批準(zhǔn)使用的著色劑亦不包含亮黑和羅丹明B(玫瑰紅B)。
[0003] 亮黑，中文名稱食品黑1，英文名Brilliant black，分子式C28H17N5Na4〇i4S4，CAS號： 2519-30-4，目前主要用作化工染料。羅丹明B在溶液中有強(qiáng)烈的熒光，用作實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞熒 光染色劑、有色玻璃、特色煙花爆竹等行業(yè)。由于亮黑和羅丹明B價(jià)格低廉，可能存在不法商 人違規(guī)添加入食品中的問題。為了保障消費(fèi)者的利益，需要對其進(jìn)行檢測。
[0004] 目前，國內(nèi)外用于亮黑和羅丹明B的檢測方法主要有高效液相色譜法。肖海龍等提 出了一種測定食品中亮黑等18種合成著色劑的HPLC方法（肖海龍，屠海云，等.反相高效液 相色譜法快速測定食品中18種水溶性合成著色劑[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21 (2): 264-266"）；邵仕萍等用HPLC檢測了亮黑等5種色素(邵仕萍，奚星林，等.飲料和糖果中5種 非法添加色素的檢測[J].食品科學(xué)，2011，32(4): 189-192"）；楊建龍等用LC-MS/MS同時(shí)測 定朱砂中摻假染料猩紅808和玫瑰紅B，它是針對礦物基質(zhì)的，前處理凈化方法在該文獻(xiàn)中 未有報(bào)道(楊建龍，譚紋.LC-MS/MS同時(shí)測定朱砂中摻假染料猩紅808和玫瑰紅B的含量[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2015,8(32):979-983)。液相色譜法是食品中人工合成著色劑檢測應(yīng)用 最廣泛的方法，但是缺乏配套的確證技術(shù)，無法滿足復(fù)雜的食品基質(zhì)中目標(biāo)物的定性確證 要求。已報(bào)道的檢測食品中合成著色劑的LC-MS/MS方法，只涉及部分著色劑且無普適的前 處理凈化手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種LC-MS/MS測定食品中亮黑和羅 丹明B的方法。該方法對樣品的提取、SPE柱凈化、LC-MS/MS定量檢測食品中亮黑和羅丹明B 的方法進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡單，可廣泛應(yīng)用于食品中 亮黑和羅丹明B的檢測。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種LC-MS/MS測定食品中亮黑和羅丹明B的方法，其 特征在于，包括以下步驟：
[0007] (1)制備:取具有代表性樣品粉碎、攪拌均勻密封標(biāo)識，待用；
[0008] (2)提?。喝〔襟E（1)樣品，置于離心管中，加入超純水，于50-70°C水浴超聲提取 10-30min，于離心機(jī)中4000r/min離心5-15min，移取上清液用梓檬酸水溶液調(diào)試pH值至3-6,得待凈化溶液；
[0009] (3)凈化：
[0010] a、固相萃取小柱的組裝：取40-60μπι陽離子交換填料和40-60μπι陰離子交換填料， 填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以聚乙烯篩板固定；
[0011] b、柱活化:將上述固相萃取小柱依次用pH值6-7的水、甲醇活化；
[0012] c、加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化溶液至固相萃取小柱，依次用pH值3-6的水、甲醇淋 洗SPE柱；
[0013] d、洗脫：低真空吹干SPE柱，用氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收集液于50°C氮 氣吹干，加水溶解，渦流混合后過0.22μπι濾膜，供LC-MS/MS分析；
[0014] (4)檢測:步驟(3)得到的待測樣品用液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜進(jìn)行測定。
[0015] 優(yōu)選的，具體包括以下步驟：
[0016] (1)制備:取具有代表性試樣500g粉碎、攪拌均勻，密封標(biāo)識，待用。
[0017] (2)提?。喝〔襟E（1)樣品10g，置于50mL離心管中，加入25mL超純水，于50-70°C水 浴超聲提取10-30min，于離心機(jī)中4000r/min離心5-15min，移取上清液用梓檬酸水溶液調(diào) 試pH值至3-6，得待凈化溶液；
[0018] ⑶凈化：
[0019] a、固相萃取小柱的組裝:取40_80mg 4〇-60μηι陽離子交換填料和40_80mg 4〇-60μηι 陰離子交換填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以聚乙烯篩板固 定；
[0020] 所述的陽離子交換填料為選自苯磺酸鍵合聚苯乙烯二乙烯苯共聚物(PCX)、苯磺 酸鍵合硅膠(SCX)、丙磺酸鍵合硅膠(PRS)中的至少一種;優(yōu)選PCX填料；
[0021] 所述的陰離子交換填料為選自聚酰胺(pa)、nh2氨丙基鍵合硅膠、多胺化聚苯乙烯 二乙烯苯共聚物(PWAX)填料中的至少一種;優(yōu)選PWAX填料；
[0022] 所述的陽離子交換填料和陰離子交換填料的比例為重量比1:0.5~1:2;優(yōu)選1:1; [0023] 進(jìn)一步優(yōu)選，采用60mgPCX+60mgPWAX/6mL自行填制凈化萃取柱對樣品進(jìn)行凈化處 理；
[0024] b、柱活化:將上述固相萃取小柱依次用4-8mL pH值6-7的水、4-8mL甲醇活化；
[0025] c、加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化溶液8-15mL至固相萃取小柱，依次用4-8mL pH值3-6 的水、4-8mL甲醇淋洗SPE柱；
[0026] d、洗脫:低真空吹干SPE柱，用4-8mL 3%-6%的氨化甲醇(優(yōu)選5%氨化甲醇)洗脫 待分析成分并接收，收集液于50 °C氮?dú)獯蹈?，用水定容?. OmL，渦流混合后過0.22μπι濾膜， 供LC-MS/MS分析；
[0027] (4)檢測:步驟(3)得到的待測樣品用液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜進(jìn)行測定。
[0028] 優(yōu)選的，所述步驟(4)中液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜的儀器參數(shù)條件如下： ???'ι }']： Thermo Syncrortis Cl8 [??ΗΙ：； 3.0μηι, 150mnr<2Jnim 流動相 甲醇(A)，5 mmol乙酸銨水溶液(B) 流速 0.25 mL/niin 進(jìn)樣量 5μL 柱溫 30'C
[0029] 梯度洗脫程序時(shí)間(min) A(%) B(%) 0.00 5 95 5.00 95 5 9.00 95 5 9.10 5 95 15.00 5 95
[0030] 質(zhì)譜條件為： 離子源 電噴霧離子源 掃描方式 ESI源正負(fù)離子分段掃描模式
[0031] 監(jiān)測方式 多反應(yīng)監(jiān)測(MRM) 電噴霧電壓(IS) 4500 ￥ 離子源溫度(TEM) 500 ?
[0032] 獲 ^流速 15L/min 霧化器壓力 45 psi
[0033] 選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量為：
[0034] 名稱 保留時(shí)間Cmin> 母:離子 子離子 去簇電壓EtP〇)碰撞能CE(>) 亮黑 ?Μ 778.0 291.0*,732.0 -214 -55.-43 11 6- 443.1 390.1^,355.0 100 58, 80
[0035] 本發(fā)明的有益效果：
[0036] 本發(fā)明對食品中亮黑和羅丹明B的含量檢測進(jìn)行了研究，樣品經(jīng)超純水水浴超聲 提取后，用自組裝固相萃取小柱凈化，采用LC-MS/MS同步定量測定。該方法可實(shí)現(xiàn)性質(zhì)不同 的人工合成著色劑一次過柱萃取凈化、一次色譜過程定量分析，操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn) 性好、準(zhǔn)確率較高?？蓮V泛應(yīng)用于復(fù)雜食品基質(zhì)中亮黑和羅丹明B的準(zhǔn)確定量分析，操作簡 單、靈敏度高、重現(xiàn)性好。
[0037] 本發(fā)明利用自組裝的固相萃取凈化小柱對樣品提取液進(jìn)行凈化處理，且采用陰離 子填料和陽離子填料按一定比例混裝的方式制成固相萃取小柱，可在有效除去干擾物的同 時(shí)實(shí)現(xiàn)對不同性質(zhì)人工合成著色劑的凈化、富集，方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度均符合食品 添加劑分析標(biāo)準(zhǔn)，具有一定的新穎性和適用性。同時(shí)上述方式，相比采用兩根不同的固相萃 取柱分開萃取的方式，節(jié)省了時(shí)間和成本。且本發(fā)明自組裝小柱，可以根據(jù)樣品中色素含量 適當(dāng)調(diào)整填料的粒徑和用量，方便適用。本發(fā)明首次使用PWAX柱進(jìn)行固相萃取，它的吸附容 量大，萃取效果好。
[0038]本發(fā)明的方法中，亮黑和羅丹明B同時(shí)進(jìn)行提取、凈化等前處理(本發(fā)明的亮黑和 羅丹明B為非同系物，由于不同物質(zhì)的性質(zhì)不同，在提取的過程中，很難把所有目標(biāo)物都提 取完全，但是，本發(fā)明的方法，同時(shí)提取、凈化，并且亮黑和羅丹明B提取比較完全，實(shí)施例中 的回收率就可以說明這點(diǎn)），并且一次上機(jī)檢測，節(jié)約時(shí)間和成本。
【附圖說明】
[0039]圖1為甲醇+5mmol乙酸銨水溶液亮黑和羅丹明B的MRM色譜圖；
[0040] 圖2亮黑和羅丹明B特征離子對色譜圖；
[0041] 圖3烤肉調(diào)味料樣品中亮黑和羅丹明B的MRM色譜圖；
[0042] 圖4烤肉調(diào)味料加標(biāo)樣品中亮黑和羅丹明B的MRM對色譜圖；
[0043] 圖5是實(shí)施例1的分析色譜圖（調(diào)味料）；
[0044] 圖6是實(shí)施例2的分析色譜圖（水果糖）。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的 內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例，實(shí)施例不應(yīng)視作對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
[0046] 1儀器與試劑
[0047] 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Aglientl200高效液相色譜儀，API4000質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX) ;MS3渦流混勻器（IKA公司）；恒溫超聲水?。↖KA公司）；高速冷凍離心機(jī)（日本日立公 司）；感量為〇· lmg的分析天平(瑞士梅特勒公司）;Milli-Q純水器(美國Millipore公司）;N-EVAP24氮吹儀(美國）；量程為10-100yL、100-1000yL移液槍(Eppendof公司）。
[0048] 亮黑、羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品（自制）；甲醇:色譜純(Merk公司）；乙腈:色譜純(Merk公司）； 甲酸：色譜純(Merk公司）；乙酸銨:分析純;檸檬酸：分析純；氨水:分析純;無水乙醇：分析 純；PWAX 填料：Age la Technologies公司；PCX 填料：Age la Technologies公司；SCX 填料： Agela Technologies公司；PRS填料:Agela Technologies公司；NH2氨丙基鍵合硅膠填料： Agela Technologies公司；C18SPE萃取柱:Agela Technologies公司；陽離子交換（PCX)SPE 萃取柱:Agela Technologies公司；聚酰胺(PA)SPE萃取柱:Agela Technologies公司。
[0049] 2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
[0050] 稱取亮黑、羅丹明B著色劑標(biāo)準(zhǔn)品100 . Omg，用水溶解，并定容于100mL棕色容量瓶 中，即得1000mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液。棕色瓶儲存于-18°C備用。
[0051] 取空白樣品按上述提取和凈化方法進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)提取凈化液。用該基 質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行LC-MS/MS分析。以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為 橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制相關(guān)線性方程。
[0052] 3樣品提取與凈化
[0053] 3.1制備：
[0054] 取具有代表性試樣500g粉碎、攪拌均勻密封標(biāo)識，待用。
[0055] 3.2提?。?br>[0056] 取步驟（1)樣品，置于離心管中，加入超純水，于50-70°C水浴超聲提取10_30min， 于離心機(jī)中4000r/min離心5-15min，移取上清液用檸檬酸水溶液調(diào)試pH值至3-6,得待凈化 溶液；
[0057] 3.3凈化：
[0058] 3.3.1固相萃取小柱的組裝：分別稱取40-80mg 40-60μπι陽離子交換填料和40- 80mg 40-60μπι陰離子交換填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以 聚乙烯篩板固定；
[0059]所述的陽離子交換填料為選自苯磺酸鍵合聚苯乙烯二乙烯苯共聚物(PCX)、苯磺 酸鍵合硅膠(SCX)、丙磺酸鍵合硅膠(PRS)中的至少一種，所述的陰離子交換填料為選自丙 基乙二胺(PSA)、聚酰胺(PA)、多胺化聚苯乙烯二乙烯苯共聚物(PWAX)填料中的至少一種； [0060]所述的陽離子交換填料和陰離子交換填料的比例為重量比1:0.5~1:2。
[00611 3.3.2柱活化:將上述固相萃取小柱依次用4-8mL pH值6-7的水、4-8mL甲醇活化；
[0062] 3.3.3加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化液8-15mL至固相萃取小柱，依次用4-8mL pH值3- 6的水、4-8mL甲醇淋洗SPE柱；
[0063] 3.3.4洗脫:低真空吹干SPE柱，用4-8mL 3的氨化甲醇洗脫待分析成分并接 收，收集液于50°C氮?dú)獯蹈桑盟ㄈ葜?. OmL，渦流混合后過0.22μπι濾膜，供LC-MS/MS分 析。
[0064] 4 檢測
[0065] 待測樣品用液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜進(jìn)行測定，儀器參數(shù)條件見下表1，選擇反 應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量見表2。
[0066] 表1液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜的儀器參數(shù)條件
[0067]
[0068] 表2亮黑和羅丹明B的LC-MS/MS分析參數(shù)
[0070] 5.結(jié)果與討論 [0071] 5.1色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化
[0072] 5.1.1流動相的選擇
[0073] 比較了乙腈+0.1 %甲酸水溶液，甲醇+5mmol/L乙酸銨水溶液，甲醇+0.1 %甲酸水 溶液不同流動相對色譜圖的影響。研究發(fā)現(xiàn)以乙腈+0.1%甲酸水、甲醇+0.1%甲酸水為流 動相，目標(biāo)物峰形差，離子化響應(yīng)值低。甲醇+5mmol/L乙酸銨水溶液為流動相，目標(biāo)化合物 色譜峰對稱尖銳，與食品中基質(zhì)分離效果較好，MRM色譜圖如附圖1所示。
[0074] 5.1.2質(zhì)譜測定條件的優(yōu)化
[0075]首先采用濃度為500yg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液以蠕動栗連續(xù)進(jìn)樣的方式進(jìn)行母離子全掃 描，確定亮黑和羅丹明B的母離子質(zhì)量數(shù)，然后再以母離子進(jìn)行2級碰撞掃描，選擇兩個(gè)豐度 比較高的子離子作為定性和定量離子。同時(shí)優(yōu)化質(zhì)譜條件，確定質(zhì)譜最佳條件，建立多離子 反應(yīng)監(jiān)測模式。圖2中下圖為正離子模式下羅丹明B的特征離子色譜；圖2中上圖為負(fù)離子模 式下亮黑的特征離子色譜。
[0076] 5.2樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除
[0077] 電噴霧離子源(ESI)易受樣品基質(zhì)的影響。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)樣品基質(zhì)對離子化有抑制 作用，不同樣品基質(zhì)對亮黑和羅丹明B離子化抑制程度存在差異。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，應(yīng) 以空白樣品提取液作為標(biāo)注溶液的稀釋液來消除樣品基質(zhì)效應(yīng)。
[0078] 5.3凈化SPE柱的選擇
[0079] 常用來做色素的SPE凈化萃取柱有陽離子交換（如PCX)SPE柱、陰離子交換柱（如 PWAX、PA)SPE柱及C18粉制成的SPE柱等，C18粉具有疏水作用對非極性的組分有吸附作用， 常用來去除雜質(zhì)，對水溶性的著色劑幾乎沒有吸附能力。根據(jù)著色劑酸堿性的不同，填料有 選擇性的吸附目標(biāo)物，如PCX粉對目標(biāo)物羅丹明B有很好的吸附，但對其他酸性著色劑吸附 差;PA粉、PWAX粉對酸性著色劑有很好的選擇性吸附性。由于8種著色劑中既有酸性也有堿 性化合物，本課題主要研究采用一次過柱解決凈化問題。優(yōu)選地，采用PCX粉:PWAX為填料時(shí) 吸附兩種性質(zhì)的化合物能力最佳，60mgPCX: 60mgPWAX/6mL自行填制凈化萃取柱對樣品進(jìn)行 凈化處理。
[0080] 5.4洗脫液的選擇
[0081] 本研究測試了純甲醇洗脫上樣后的SPE柱，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物幾乎洗脫不下來。比較 1%、2%、4%、5%、6%、10%氨化甲醇作為洗脫液的洗脫效果。發(fā)現(xiàn)同樣取6!1^洗脫液時(shí)， 5 %氨化甲醇能洗脫完全，因此采用5 %氨化甲醇作為洗脫液。
[0082] 5.5方法驗(yàn)證
[0083] 5.5.1方法的線性和檢出限
[0084] 將空白樣品按上述提取和凈化過程進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)提取凈化液。用該基 質(zhì)溶液將亮黑標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成10(^8/1，20(^8/1，40(^8/1，80(^8/1，100(^8/1的系列標(biāo)準(zhǔn)工 作液，羅丹明 B 標(biāo)準(zhǔn)系列：20yg/L，40yg/L，80yg/L，160yg/L，200yg/L; LC/MS/MS 進(jìn)行分析后， 計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)，見表3。由此可見亮黑和羅丹明B在線性范圍內(nèi)具有良好的 線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.9929和0.9961。
[0085] 方法的檢出限(L0D)以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時(shí)，取信噪 比S/N = 3和樣品處理過程的稀釋倍數(shù)計(jì)算得出。定量限（L0Q)以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲 線上的最低濃度出峰時(shí)，取信噪比S/N=10和樣品處理過程的稀釋倍數(shù)計(jì)算得出。具體數(shù)據(jù) 見表3。
[0086] 表3亮黑和羅丹明B的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限
[0088] 5.5.2回收率和精密度
[0089] 對烤肉調(diào)味料和水果糖中進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，由于羅丹明B響應(yīng)值高，添加濃度為 5、10、50yg/kg;亮黑添加濃度分別為50、100、200yg/kg。稱樣后加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻放 置〇.5h后按上文進(jìn)行樣品處理。每個(gè)水平重復(fù)6次，測精密度。結(jié)果見表4?？梢姡梁诤土_丹 明B在烤肉調(diào)味料和水果糖中添加平均回收率在81.2 %-96.0 %之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 均小于6.0%。
[0090] 表4亮黑和羅丹明B的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0091]
[0093] 5.6方法的應(yīng)用
[0094] 烤肉調(diào)味料樣品，及加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品，按"3樣品提取與凈化"的實(shí)驗(yàn)步驟操作 完畢后上機(jī)，測得色譜圖如圖3和圖4所示：
[0095] 從色譜圖中可以看出，烤肉調(diào)味料樣品基質(zhì)不干擾亮黑和羅丹明B的測定，加標(biāo)樣 品回收較好。但羅丹明B在空白中有本底，需要扣空白。
[0096] 實(shí)驗(yàn)表明，采用本法可利用自組裝的固相萃取凈化小柱對樣品提取液進(jìn)行凈化處 理，可在有效除去干擾物的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對亮黑和羅丹明B的凈化、富集，并采用LC-MS/MS定量 測定，方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度均符合食品添加劑分析標(biāo)準(zhǔn)，完全滿足進(jìn)出口食品的產(chǎn) 品質(zhì)量控制要求。
[0097] 實(shí)施例1:
[0098] 烤肉調(diào)味料樣品中亮黑和羅丹明B的測定。
[0099] 3樣品提取與凈化
[0100] 3.1提取
[0101 ]取具有代表性試樣500g粉碎、攪拌均勻，密封標(biāo)識，待用。
[0102] 置于離心管中，加入超純水，于50-70°C水浴超聲提取20min，于離心機(jī)中4000r/ min離心10min，移取上清液用檸檬酸水溶液調(diào)試pH值4，得待凈化溶液；
[0103] 3.2?爭化
[0104] 3.2.1固相萃取小柱(6mL)的組裝:分別稱取60mg 40-60ym PCX陽離子交換填料和 60mg 40-60ym PWAX混合型弱陰離子交換填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)， 填料上端再以聚乙烯篩板固定；
[0105] 3.2.2柱活化:將上述固相萃取小柱依次用6mL pH值6-7的水、6mL甲醇活化；
[0106] 3.2.3加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化液lOmL至固相萃取小柱，依次用6mL pH值4的水、 6mL甲醇淋洗SPE柱；
[0107] 3.2.4洗脫:低真空吹干SPE柱，用6mL 5 %的氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收 集液于50°C氮?dú)獯蹈?，用水定容?. OmL，渦流混合后過0.22μπι濾膜，供LC-MS/MS分析； [0108] 4 檢測
[0109] 待測樣品用液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜進(jìn)行測定，儀器參數(shù)條件見表1，選擇反應(yīng) 監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量見表2;其分析色譜圖如圖5所示，該樣品回收率和精密度實(shí) 驗(yàn)結(jié)果見表4。
[0110] 實(shí)施例2
[0111] 水果糖樣品中亮黑和羅丹明Β的測定。
[0112] 3樣品提取與凈化
[0113] 3.1提取
[0114]取具有代表性試樣500g粉碎、攪拌均勻密封標(biāo)識，待用。
[0115] 置于離心管中，加入超純水，于50-70°C水浴超聲提取15min，于離心機(jī)中4000r/ min離心10min，移取上清液用檸檬酸水溶液調(diào)試pH值至3-6，得待凈化溶液；
[0116] 3.2凈化
[0117] 3.2.1固相萃取小柱(6mL)的組裝:分別稱取60mg 40-60ym PCX陽離子交換填料和 60mg40-60ym PWAX混合型弱陰離子交換填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)， 填料上端再以聚乙烯篩板固定；
[0118] 3.2.2柱活化:將上述固相萃取小柱依次用6mL pH值6-7的水、6mL甲醇活化；
[0119] 3.2.3加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化液10mL至固相萃取小柱，依次用6mL pH值4的水、 6mL甲醇淋洗SPE柱；
[0120] 3.2.4洗脫:低真空吹干SPE柱，用6mL 5 %的氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收 集液于50°C氮?dú)獯蹈?，用水定容?. OmL，渦流混合后過0.22μπι濾膜，供LC-MS/MS分析。
[0121] 4 檢測
[0122] 待測樣品用液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜進(jìn)行測定，儀器參數(shù)條件見表1，選擇反應(yīng) 監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量見表2;其分析色譜圖如圖6所示，該樣品回收率和精密度實(shí) 驗(yàn)結(jié)果見表4。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種LC-MS/MS測定食品中亮黑和羅丹明B的方法，其特征是，包括以下步驟： (1) 制備:取具有代表性樣品粉碎、攪拌均勻，密封標(biāo)識，待用； (2) 提取:取步驟(1)樣品，置于離心管中，加入超純水，于50-70°C水浴超聲提取，離心， 移取上清液用檸檬酸水溶液調(diào)試pH值至3-6，得待凈化溶液； (3) 凈化： a、 固相萃取小柱的組裝:取40-60μπι陽離子交換填料和40-60μπι陰離子交換填料，填充 于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以聚乙烯篩板固定； 所述的陽離子交換填料和陰離子交換填料的比例為重量比1:0.5~1:2; b、 柱活化:將上述固相萃取小柱依次用pH值6-7的水、甲醇活化； c、 加樣淋洗:轉(zhuǎn)移步驟(2)的待凈化溶液至固相萃取小柱，依次用pH值3-6的水、甲醇淋 洗固相萃取小柱； d、 洗脫：吹干固相萃取小柱，用氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收集液氮?dú)獯蹈?，?水溶解，渦流混合后過〇. 22μπι濾膜，供LC-MS/MS分析； (4) 檢測:步驟(3)得到的待測樣品用液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜進(jìn)行測定。2. 如權(quán)利要求1所述的一種LC-MS/MS測定食品中亮黑和羅丹明B的方法，其特征是，所 述步驟(4)中液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜的儀器參數(shù)條件如下： 色Thermo Syncronis Cl 8 (i；：iffl'!：> 3.0μπ?^ 150mm><2.1 mm 流動?xùn)?甲醇，5 mmol乙酸銨水溶液 流速 0.25 mL/min 進(jìn)樣量 5pL 柱溫 30°C 梯度洗脫程序時(shí)間(min)甲醇(％) 5 mmol乙酸銨水溶液(％) 0.00 5 95 5.00 95 5 9.00 95 5 9.10 5 95 ]5 00 5 95 質(zhì)譜條件為： 離子源 電噴霧離子源 掃描方式 ESI源正負(fù)離子分段掃描模式 監(jiān)測方式 多反應(yīng)監(jiān)測 電噴霧電壓 4500 V 離子源溫度 50(TC 載氣流速 15 L/min 霧化器壓力 45psL3. 如權(quán)利要求2所述的一種LC-MS/MS測定食品中亮黑和羅丹明B的方法，其特征是，亮 黑和羅丹明B的LC-MS/MS分析參數(shù)如下表所示： 〇4. 如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的一種LC-MS/MS測定食品中亮黑和羅丹明B的方法， 其特征是，所述的陽離子交換填料為選自苯磺酸鍵合聚苯乙烯二乙烯苯共聚物PCX、苯磺酸 鍵合硅膠SCX、丙磺酸鍵合硅膠PRS中的至少一種。5. 如權(quán)利要求4所述的一種LC-MS/MS測定食品中亮黑和羅丹明B的方法，其特征是，所 述的陽離子交換填料為苯磺酸鍵合聚苯乙烯二乙烯苯共聚物PCX。6. 如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的一種LC-MS/MS測定食品中亮黑和羅丹明B的方法， 其特征是，所述的陰離子交換填料為選自聚酰胺PA、NH 2氨丙基鍵合硅膠、多胺化聚苯乙烯 二乙烯苯共聚物PWAX填料中的至少一種。7. 如權(quán)利要求6所述的一種LC-MS/MS測定食品中亮黑和羅丹明B的方法，其特征是，所 述的陰離子交換填料為多胺化聚苯乙烯二乙烯苯共聚物PWAX填料。8. 如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的一種LC-MS/MS測定食品中亮黑和羅丹明B的方法， 其特征是， (1) 制備:取代表性樣品粉碎、攪拌均勻，密封標(biāo)識，待用。 (2) 提取:取步驟（1)樣品IOg，置于50mL離心管中，加入25mL超純水，于50-70°C水浴超 聲提取10-30min，于離心機(jī)中4000r/min離心5-15min，移取上清液用梓檬酸水溶液調(diào)試pH 值至3-6,得待凈化溶液； (3) 凈化： a、 固相萃取小柱的組裝:取40_80mg 40-60μηι陽離子交換填料和40_80mg 40-60μηι陰離 子交換填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以聚乙烯篩板固定； b、 柱活化:將上述固相萃取小柱依次用4-8mL pH值6-7的水、4-8mL甲醇活化； c、 加樣淋洗:轉(zhuǎn)移步驟(2)的待凈化溶液8-15mL至固相萃取小柱，依次用4-8mL pH值3-6的水、4-8mL甲醇淋洗固相萃取小柱； d、 洗脫:低真空吹干固相萃取小柱，用4-8mL 3%-6%的氨化甲醇洗脫待分析成分并接 收，收集液于50°C氮?dú)獯蹈桑盟ㄈ葜?.0 mL，渦流混合后過0.22μπι濾膜，供LC-MS/MS分 析； (4) 檢測:步驟(3)得到的待測樣品用液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜進(jìn)行測定。9. 如權(quán)利要求8所述的一種LC-MS/MS測定食品中亮黑和羅丹明B的方法，其特征是，分 別稱取60mg 40-60μηι苯磺酸鍵合聚苯乙稀二乙稀苯共聚物PCX填料和60mg 40-60μηι多胺化
【文檔編號】G01N30/02GK106018583SQ201610311214
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】鄭新華, 王樂, 陳晞, 張愛霞
【申請人】濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心