人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的血漿代謝小分子標(biāo)志物及其應(yīng)用
【專(zhuān)利說(shuō)明】人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的血漿代謝小分子標(biāo)志物及其應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的血漿代謝小 分子標(biāo)志物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是全世界男性和女性癌癥相關(guān)死亡最常見(jiàn)的原因。據(jù)估計(jì)，2012年全球肺癌 新發(fā)病例1800萬(wàn)，占全部腫瘤新發(fā)病例的12. 9%，死亡病例1600萬(wàn)，占全部腫瘤相關(guān)死亡 的19. 4%。肺癌按照細(xì)胞類(lèi)型分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌（15% )，非小細(xì)胞肺癌有兩 個(gè)主要的亞型為腺癌（40% )、鱗狀細(xì)胞癌（30% )，依據(jù)類(lèi)型不同其治療和預(yù)后也不同。
[0003] 目前臨床用于診斷肺癌的影像學(xué)檢查方法有：胸部X射線、CT (computed tomography，電子計(jì)算機(jī) X 射線斷層掃描）、PET_CT(Positron Emission Tomography/ Computer Tomography,正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描），這些檢查存在一些缺陷，福射對(duì)身體 的影響以及較高的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。臨床上常用的侵入性檢查方法有：支氣管鏡下肺活檢及CT引 導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢，這些檢查往往是需要消耗一定的時(shí)間，同時(shí)給患者帶來(lái)一定的創(chuàng)傷 風(fēng)險(xiǎn)。除了以上這些檢查，外周血中肺癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)也較常使用，但是這些標(biāo)志 物的敏感性及特異性均較低。因此迫切需要尋求一個(gè)非輻射、微創(chuàng)、不昂貴同時(shí)高度敏感及 特異的診斷方法。
[0004] 代謝組學(xué)（Metabolomics/Metabonomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué) 之后迅速崛起的一門(mén)新興學(xué)科，已成為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。它是研究生物體系受 外部刺激或擾動(dòng)后所產(chǎn)生的內(nèi)源性代謝物整體機(jī)器變化規(guī)律的科學(xué)，是探明生物體系代謝 途徑的研究方法。代謝組學(xué)的研究對(duì)象是相對(duì)分子質(zhì)量l〇〇〇Da以下的小分子物質(zhì)，包括： 糖類(lèi)、氨基酸、脂類(lèi)、有機(jī)酸、肉堿等。
[0005] 正常狀態(tài)下的生物體是一個(gè)完整的系統(tǒng)，生物體液、細(xì)胞和組織中的代謝物處于 一個(gè)穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。機(jī)體由于遺傳或者后天原因發(fā)生了病理變化，這一平衡就被打破，代 謝產(chǎn)物和代謝過(guò)程也產(chǎn)生了相應(yīng)的變化。在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞受到外界 環(huán)境的刺激，其內(nèi)環(huán)境發(fā)生的微小變化多會(huì)引起代謝物的"延增效應(yīng)"，使代謝物發(fā)生異乎 尋常的變化。通過(guò)代謝組學(xué)分析了解代謝小分子在疾病過(guò)程中的變化，可以幫助人們尋找 有關(guān)的生物標(biāo)志物（biomarker)可以輔助疾病的診斷，也可以幫助人們通過(guò)小分子物質(zhì)本 身涉及的代謝通路了解疾病的發(fā)病機(jī)制并為藥物研發(fā)提供特異性的靶標(biāo)。代謝組學(xué)自出現(xiàn) 以來(lái)，引起了各國(guó)科學(xué)家極大的興趣，短短十余年來(lái)獲得了迅速發(fā)展。代謝組學(xué)在病理闡 述、藥物設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)、疾病診斷、分型以及疾病預(yù)后等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大潛力。
[0006] 自從Warburg假設(shè)由于線粒體缺陷改變的代謝對(duì)癌癥細(xì)胞的特異性，代謝生物標(biāo) 志物已受到研究者的關(guān)注，是一種對(duì)早期癌癥診斷和預(yù)后有效的生物標(biāo)志物。從那時(shí)起，許 多努力致力于腫瘤學(xué)中代謝生物標(biāo)志物的鑒定。直至現(xiàn)在只有兩個(gè)代謝生物標(biāo)志物已進(jìn)入 臨床實(shí)踐，分別是甲氧基腎上腺素和甲氧基去甲腎上腺素，作為預(yù)測(cè)嗜鉻細(xì)胞瘤疾病狀態(tài) 的標(biāo)志物。代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵在于對(duì)大量小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析鑒定，這 在很大程度上依賴(lài)于相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步。核磁共振、質(zhì)譜、色譜等技術(shù)的發(fā)展和聯(lián)用，使得代 謝組學(xué)的廣泛應(yīng)用成為可能。
[0007] 目前，代謝物整體水平的檢測(cè)分析技術(shù)包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS)、氣象色 譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS)及核磁共振技術(shù)（NMR)。NMR特點(diǎn)是對(duì)待測(cè)組分無(wú)破壞，樣本前處理 簡(jiǎn)單，但靈敏度較低、檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍窄；GC-MS具有較好的靈敏度和重現(xiàn)性，但一般要采用 衍生化方法對(duì)樣本進(jìn)行前處理，使得實(shí)驗(yàn)步驟變得復(fù)雜。相比GC-MS而言，LC-MS能分析高 極性和分子量相對(duì)更高的化合物，更適合于代謝組學(xué)生物樣本中復(fù)雜代謝產(chǎn)物的檢測(cè)和潛 在標(biāo)志物的鑒定。此外，更具有樣本處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，臨床實(shí)用性強(qiáng)的特點(diǎn)，故而采用 LC-MS進(jìn)行代謝小分子的代謝組學(xué)分析，若能發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的與非小細(xì)胞肺癌發(fā)病相關(guān)的特異 血衆(zhòng)代謝小分子作為生物標(biāo)志物，并研發(fā)相應(yīng)疾病的代謝小分子標(biāo)志的LC-MS檢測(cè)方法， 不僅在該領(lǐng)域處于國(guó)際領(lǐng)先地位，可創(chuàng)造令人矚目的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)我國(guó)非小細(xì)胞肺癌的早 期發(fā)現(xiàn)、早期診斷也將是一次強(qiáng)有力的推動(dòng)。
[0008] Maeda等通過(guò)研究非小細(xì)胞肺癌與健康者的血漿氨基酸輪廓，探討了氨基酸輪 廓作為非小細(xì)胞篩選指標(biāo)的可能性，并發(fā)現(xiàn)6個(gè)敏感性和特異性均較高的診斷標(biāo)志物。 Duarte等對(duì)尚未經(jīng)過(guò)放療和化療的初期肺癌患者和健康志愿者的血漿樣品進(jìn)行了系統(tǒng)分 析，認(rèn)為內(nèi)源性代謝物的改變出現(xiàn)在疾病的初期階段，且可能與癌癥生化過(guò)程相關(guān)，如增強(qiáng) 性的糖酵解和糖異生以及受到抑制的三羧酸循環(huán)和脂代謝。Carrola等對(duì)肺癌患者與健 康者的尿液進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌尿液中馬尿酸鹽和萌蘆巴堿含量降低，而 羥基異戊酸、羥基異丁酸、N-乙酰谷氨酰胺和肌酐相對(duì)對(duì)照組升高。Fan T等利用 13C穩(wěn)定同位素示蹤代謝組學(xué)分析法"SIRM"，對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者癌組織與癌旁非癌組織 進(jìn)行了研究。既往研究均提示了腫瘤的代謝異常，并在不同程度發(fā)現(xiàn)了差異性的代謝物，可 作為預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)展的標(biāo)志物。但是，代謝組學(xué)研究在臨床應(yīng)用上存在幾個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題，除了 技術(shù)本身對(duì)研究的影響外，不同生理狀態(tài)，比如性別、年齡、飲食、晝夜變化、文化對(duì)代謝組 的影響也越來(lái)越受到重視。因此在疾病或治療標(biāo)志物的篩選中需要特別注意這些影響因 素，此外還需結(jié)合數(shù)學(xué)的方法以排除這些影響因素，以更好地應(yīng)用于臨床。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的血漿代謝小分子標(biāo)志物。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的血漿代謝小分子標(biāo)志物，該標(biāo)志物為皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮和4-甲 氧基苯乙酸中的一種或多種。
[0012] 所述的血漿代謝小分子標(biāo)志物，該標(biāo)志物由皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮和4-甲氧基苯乙酸構(gòu) 成。
[0013] 上述三種標(biāo)志物含量范圍（95 %置信區(qū)間）分別為，皮質(zhì)醇（0.00018~ 0? 00067)、皮質(zhì)酮（0? 000029 ~0? 00010)，4-甲氧基苯乙酸（0? 000015 ~0? 000022)，代 謝物在上述范圍內(nèi)可以提示腫瘤的發(fā)生。正常組相應(yīng)的水平范圍為皮質(zhì)醇（0.0030~ 0? 0037)、皮質(zhì)酮（0? 00044 ~0? 00056)，4-甲氧基苯乙酸（7. 39E-07 ~2. 09E-06)。
[0014] 本發(fā)明詳細(xì)描述如下：
[0015] 本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序（S0P)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人群 基礎(chǔ)信息和臨床資料，并采用了基于UPLC/MS的代謝組學(xué)方法進(jìn)行分析。
[0016] 具體來(lái)說(shuō)研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分：
[0017] -、研究對(duì)象選擇和分組依據(jù)
[0018] A組：健康對(duì)照組（n = 112, 56人篩選，56人獨(dú)立人群驗(yàn)證）：
[0019] 1.年齡在42歲至80歲間；
[0020] 2.經(jīng)體檢未診斷為腫瘤，既往無(wú)腫瘤病史；
[0021] 3?無(wú)其他全身性重大疾病；
[0022] 4?無(wú)長(zhǎng)期用藥的慢性病史。
[0023] B組：非小細(xì)胞肺癌組（n = 99, 53人篩選，46人獨(dú)立人群驗(yàn)證）：
[0024] 1.年齡在42歲至83歲間；
[0025] 2.經(jīng)手術(shù)或穿刺病理初診為非小細(xì)胞肺癌；
[0026] 3?無(wú)其他全身性重大疾??；
[0027] 4?無(wú)長(zhǎng)期用藥的慢性病史。
[0028] 二、UPLC-MS代謝組學(xué)分析和非小細(xì)胞肺癌診斷用代謝小分子篩選和驗(yàn)證
[0029] 1?樣本前處理
[0030] 1. 1新鮮血液于離心機(jī)3000rpm離心5min，取上清100 y 1分裝至潔凈1. 5ml EP 管中。
[0031] 1. 2 100 y 1血漿用300 y 1甲醇沉淀蛋白。
[0032] 1.3吸取上清，平均分成2份，用氮?dú)獯蹈稍儆谜婵崭稍铩?br>[0033] 1. 4用50 y L水（含0? 1 %的甲酸）溶解一份干燥物（酸性提取物），另一份干燥 物用50 y L含6. 5mM的重碳酸銨pH = 8的水溶解（堿性提取物）。
[0034] 2?儀器檢測(cè)
[0035] 2. 1 分析儀器：米用 Waters Acquity 公司的 UPLC 串聯(lián) ThermoFisher LTQ-FT 線 性離子阱回旋共振質(zhì)譜儀。
[0036] 2. 2液相條件：
[0037] 2.2. 1液相色譜柱為Waters BEH C18 1.7 ym 100mm色譜柱，柱溫為40度。
[0038] 2. 2. 2酸性提取物：采用的流動(dòng)相為㈧含0. 1 %甲酸的水和⑶含0. 1 %甲酸的 甲醇，流速為 350 yL/min。1.2 儀器梯度為：0-4min 0%B 到 70%B，4-4. 5min70%-9