評(píng)價(jià)丙烯酰胺短期暴露的巰基尿酸加合物檢測(cè)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種評(píng)價(jià)膳食丙烯酰胺短期體內(nèi)暴露的巰基尿酸加合物同步檢測(cè)方 法及其應(yīng)用，屬于食品安全領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙烯酰胺（Acrylamide)是一種無色無味的白色晶體小分子物質(zhì)，是一種重要的 化工原料，用于合成聚合物和凝膠劑。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC)將丙烯酰胺列為2A類 致癌物（對(duì)人類很可能有致癌性），其具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、基因毒性等。2002年，瑞 典國(guó)家食品管理局和斯德哥爾摩大學(xué)的研究人員共同宣稱在油炸食品和焙烤食品中發(fā) 現(xiàn)了高含量的丙稀酰胺（Swedish National Food Administration, Information about acrylamide in food, 2002, 4)。隨后的研究證明熱加工食品中丙稀酰胺的形成源自美拉德 反應(yīng)（Maillard reaction)。高碳水化合物含量的食品，如薯類油炸食品、面包類焙烤食品、 漢堡類快餐食品以及餅干類休閑食品等，是人體攝入丙烯酰胺的直接來源也是主要來源。
[0003] 目前，食品中丙烯酰胺的分析主要以色譜分離以及質(zhì)譜分析技術(shù)為檢測(cè)手段，液 相色譜-質(zhì)譜（LC-MS)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用尤其廣泛。為排除復(fù)雜食品基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾，通 過脫脂、提取、萃取、旋蒸、重溶和過濾等前處理步驟提取食品中的丙烯酰胺（一種提取食 品中丙烯酰胺的預(yù)處理方法，CN103499478A，2014 ; -種烘烤食品中丙烯酰胺檢測(cè)樣品的 提取方法，CN103389235A，2013)。Ros6n和HellcnSs首次報(bào)道了采用同位素稀釋的LC-MS 技術(shù)檢測(cè)熱加工食品中丙烯酰胺的含量，確定了多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM)的定量模式下丙烯 酰胺的母離子、定性離子和定量離子（R〇s6n，J·，Hdieniis，K.E. Analysis of acrylamide in cooked foods by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analyst 2002, 127:880-882)。此后，大量的研究報(bào)道在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了基于質(zhì)譜技術(shù)的丙烯酰胺 檢測(cè)方法。隨著超高效液相色譜的廣泛應(yīng)用，基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/ MS)的檢測(cè)丙烯酰胺的方法也迅速被開發(fā)（同時(shí)檢測(cè)食品中的丙烯酰胺和雜環(huán)胺的方法， CN103149316A，2013)。除此之外，還有基于丙烯酰胺偶聯(lián)蛋白質(zhì)后具有抗原性的免疫學(xué)檢 測(cè)方法而開發(fā)的快速檢測(cè)試劑（一種丙烯酰胺快速檢測(cè)卡，CN202330398U，2012)和經(jīng)過對(duì) 熱加工食品的前處理，采用熒光手段對(duì)丙烯酰胺的檢測(cè)方法（一種食品中丙烯酰胺的檢測(cè) 方法，CN101303304,2008)。該兩種方法由于受抗體特異性及熒光檢測(cè)靈敏度方面的局限 性，并未得到廣泛適用。
[0004] 對(duì)于丙烯酰胺的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究，現(xiàn)有研究主要是采用外暴露的評(píng)估方式，即通過 測(cè)定各類食物中丙烯酰胺的含量進(jìn)行膳食丙烯酰胺的攝入水平調(diào)查，但這種評(píng)估方式不能 準(zhǔn)確反映丙烯酰胺進(jìn)入人體內(nèi)的真正暴露水平。為能準(zhǔn)確評(píng)估膳食丙烯酰胺對(duì)人體的暴露 風(fēng)險(xiǎn)，須采用體內(nèi)暴露的評(píng)估方式，即通過丙烯酰胺體內(nèi)代謝生物標(biāo)志物的測(cè)定對(duì)丙烯酰 胺進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。與膳食丙烯酰胺外暴露相比，基于生物標(biāo)志物的內(nèi)暴露水平研究可以更 準(zhǔn)確地評(píng)估丙烯酰胺的日常攝入量并為流行病學(xué)的研究提供更可靠的依據(jù)。
[0005] 目前基于毒代動(dòng)力學(xué)水平的丙烯酰胺體內(nèi)代謝已經(jīng)在動(dòng)物和人群實(shí)驗(yàn)中有一定 的研究。丙烯酰胺進(jìn)入體內(nèi)，在細(xì)胞色素 P4502E1酶的作用下，一部分迅速轉(zhuǎn)化成環(huán)氧活性 的物質(zhì)環(huán)氧丙酰胺。環(huán)氧丙酰胺在環(huán)氧化物水解酶的作用下，一部分轉(zhuǎn)化成無毒的2, 3-二 羥基丙酰胺。同時(shí)，丙烯酰胺和環(huán)氧丙酰胺在體內(nèi)都能夠與谷胱甘肽（GSH)、血紅蛋白以及 DNA進(jìn)行結(jié)合，形成相應(yīng)的加合物，如圖1所示。丙烯酰胺和環(huán)氧丙酰胺與GSH結(jié)合進(jìn)而 轉(zhuǎn)化成巰基尿酸加合物，包括N-乙酰-S-(2-氨基甲酰乙基）-L-半胱氨酸（AAMA)、N-乙 酰-S_(2-氨基甲酰乙基）-L-半胱氨酰亞砜（AAMA亞砜）、N(R，S)_乙酰-S-(2-氨基甲 酰-2-羥乙基）-L-半胱氨酸（GAMA)以及N-乙酰-S-(l-氨基甲酰-2-羥乙基）-L-半胱氨 酸（異GAMA)，并通過尿液排出體外。另外，丙烯酰胺和環(huán)氧丙酰胺都可以與血紅蛋白形成 共價(jià)化合物，即丙烯酰胺-Hb和環(huán)氧丙酰胺-Hb加合物。這兩種加合物被認(rèn)為是評(píng)估丙烯 酰胺體內(nèi)暴露劑量的兩個(gè)重要的生物標(biāo)志物。環(huán)氧丙酰胺和丙烯酰胺還能與DNA進(jìn)行結(jié)合 形成DNA加合物，但是環(huán)氧丙酰胺與DNA的結(jié)合率遠(yuǎn)高于丙烯酰胺與DNA發(fā)生結(jié)合作用的 效率。目前已經(jīng)有四種環(huán)氧丙酰胺DNA加合物被確認(rèn)，即Nl- (2-羧基-2-羥乙基）-2'-脫 氧腺苷（Nl-GA-dA)、N3- (2-氨基甲酰-2-羥乙基）-腺嘌呤（N3-GA-Ade)、N7- (2-氨基 甲酰-2-羥乙基）-鳥嘌呤（N7-GA-Gua)以及N6-(2-羧基-2-羥乙基）-2'-脫氧腺苷 (N6-GA-dA)〇
[0006] 膳食丙烯酰胺體內(nèi)短期暴露水平通過丙烯酰胺和環(huán)氧丙酰胺的巰基尿酸加合 物含量水平反映。對(duì)于丙烯酰胺巰基尿酸加合物的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián) 用法（GC-MS) ( V5丨kc-丨，W·，A·，Dekant，W. Gas chromatography-negative ion chemical ionization mass spectrometry as a powerful tool for the detection of mercapturic acids and DNA and protein adducts as biomarkers of exposure to halogenated olefins. Journal of Chromatography A 1999,847:35-46)、 高效 液相色譜-紫外檢測(cè)法（HPLC-UV) (Perbellini，L·，Maestri, L·，Veronese, N.，et al. Analysis of urinary N-acetyl-S-(N-methylcarbamoyl)cysteine, the mercapturic acid derived from N,N-dimethylformamide. Journal of Chromatography B 2001，759:349-354)、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法（冊(cè)1^：40))(]\&168廿丨，1^，611丨《〇4,5· ,Imbriani, M. Determination of urinary mercapturic acids of styrene in man by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Chromatography B 1996,687:387-394)等。由于丙稀酰胺的疏基尿酸加合物在尿液中的含 量在數(shù)ng到數(shù)百ng之間，LC-MS/MS具有高度的靈敏性以及特異性，被認(rèn)為是首選的定量方 法，預(yù)期能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)尿液中低含量丙烯酰胺巰基尿酸加合物的定量研究，然而目前LC-MS/ MS法在丙烯酰胺巰基尿酸加合物的定量分析方面卻鮮有報(bào)道。
[0007] 目前現(xiàn)有的LC-MS/MS法為：采用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定AAM和GAM兩種 加合物，并采用D 3-AAM和D3-GAM作為各自的同位素內(nèi)標(biāo)（Bjellaas，T.，Stolen, L. Η. , Haugen,Μ.,et al. Urinary acrylamide metabolites as biomarkers for short-term dietary exposure to acrylamide.Food and Chemical Toxicology 2007, 45:1020-1026)。由于測(cè)定方法的自身?xiàng)l件的限制，因此該方法不能同時(shí)測(cè)定另兩種 加合物：異GAMA和AAMA亞砜。
[0008] 尿液中四種巰基尿酸加合物（AAMA、GAMA、異GAMA和AAMA亞砜）為主要生物標(biāo)志 物。目前的定量分析方法并未實(shí)現(xiàn)對(duì)四種巰基尿酸加合物進(jìn)行同步定量分析。同時(shí)，上述 提到的HPLC等方法分析的時(shí)間較長(zhǎng)，且檢測(cè)靈敏度十分有限，不利于對(duì)大批量生物樣本的 檢測(cè)和低含量樣本的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種評(píng)價(jià)膳食丙烯酰胺短期體內(nèi)暴露的巰基尿 酸加合物同步檢測(cè)方法。
[0010] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種評(píng)價(jià)丙烯酰胺短期暴露的巰基尿酸加合 物檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0011] 1)、對(duì)待測(cè)尿液進(jìn)行前處理；
[0012] 2)、將經(jīng)前處理后的尿液進(jìn)行色譜檢測(cè)；
[0013] 色譜條件以及質(zhì)譜條件如下：
[0014] (一）色譜條件：
[0015] 流速：0· 2mL/min ;柱溫：40°C ;
[0016] 梯度洗脫程序如下：
[0019] A為0~1% (體積％ )甲酸水，B為乙腈，其體積配比為90:10~98:2 ;
[0020] 所述色譜柱種類及規(guī)格為 ACQUTITY UPLC? BEH AMIDE (2. IXlOOmm i.d.，1.7ym)、ACQUTITY UPLC? BEH Shield RP(2.1X150mm i.d.，1.7ym)或 ACQUTITY UPLC# HSS T3 (2. I X 150mm i. d.，I. 8 μ m);
[0021] 所述進(jìn)樣體積為I~10 μ L ;
[0022] 備注說明：上述梯度洗脫程序最佳如表3所述；
[0023] (二）質(zhì)譜條件：
[0024] 儀器：三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；質(zhì)譜定量方法：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM);離子源：電 噴霧（ESI)負(fù)離子掃描方式；鞘氣溫