一種快速檢測(cè)量子點(diǎn)與hat標(biāo)簽相互作用的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及納米生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)量子點(diǎn)與HAT標(biāo)簽相互作 用的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 量子點(diǎn)（QDs)作為一種新型熒光材料，具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄而對(duì)稱(chēng)、顏色 可調(diào)、抗光漂白和熒光壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，逐漸使其在生物分析檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。
[0003] 目前，在生物標(biāo)記中應(yīng)用最廣泛的是金屬有機(jī)溶劑法合成的CdSe/ZnS量子點(diǎn)。但 是其油溶性限制其生物應(yīng)用。因此，可通過(guò)親水性配體交換、兩親性配體封裝、硅烷涂層等 方法將脂溶性量子點(diǎn)轉(zhuǎn)換為水溶性量子點(diǎn)，從而使其表面功能化。水溶性量子點(diǎn)可與多肽、 蛋白和DNA通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)或靜電吸附的方法制備量子點(diǎn)熒光探針。
[0004] 將量子點(diǎn)與熒光多肽結(jié)合，當(dāng)它們之間的距離小于Raster半徑時(shí)，會(huì)發(fā)生非輻射 能量轉(zhuǎn)移，即焚光能量共振轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)。從 而通過(guò)熒光檢測(cè)，可以分析彼此之間的相互作用。
[0005] 另一方面，毛細(xì)管電泳作為一種高分辨率、高靈敏、高通量及低樣品消耗的微分離 技術(shù)，在生物分析領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，通過(guò)將熒光檢測(cè)與毛細(xì)管電泳相結(jié)合， 大大提高了檢測(cè)限，拓展了毛細(xì)管的應(yīng)用。且毛細(xì)管內(nèi)的方法可實(shí)時(shí)檢測(cè)生物分子微量的 變化，比毛細(xì)管外的方法更靈敏、便捷、迅速。
[0006] HAT標(biāo)簽是天然組氨酸親和標(biāo)簽，序列為KDHLIHNVHKEFHAHAHNK，其中帶有3個(gè)正 電荷，與量子點(diǎn)表面的負(fù)電荷容易發(fā)生靜電吸附作用，從而導(dǎo)致量子點(diǎn)聚集，這限制了 HAT 標(biāo)簽的應(yīng)用。
[0007] 本方法通過(guò)熒光染料（ΑΤΤ0 590)標(biāo)記含有HAT標(biāo)簽的多肽與量子點(diǎn)（QDs)在毛 細(xì)管內(nèi)相互作用，將量子點(diǎn)和染料標(biāo)記的多肽按不同摩爾比例先后微量注入毛細(xì)管內(nèi)，通 過(guò)熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)兩者之間在毛細(xì)管內(nèi)的相互作用，發(fā)生FRET，并測(cè)定受體檢測(cè)通道 (625nm)與供體檢測(cè)通道（565nm)的峰值面積之比與含有HAT標(biāo)簽多肽摩爾濃度的關(guān)系，繪 制峰面積比-濃度的擬合曲線(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)中尚無(wú)良好檢測(cè)HAT標(biāo)簽方法的不足，提供 一種快速檢測(cè)量子點(diǎn)與HAT標(biāo)簽相互作用的方法。
[0009] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為，一種快速檢測(cè)量子點(diǎn)與HAT 標(biāo)簽相互作用的方法，其特征在于，步驟如下：
[0010] (1)通過(guò)熒光染料（ΑΤΤ0 590)標(biāo)記含有HAT標(biāo)簽的多肽與量子點(diǎn)（QDs)在毛細(xì)管 內(nèi)相互作用，將量子點(diǎn)和染料標(biāo)記的多肽按不同摩爾比例先后微量注入毛細(xì)管內(nèi)，通過(guò)熒 光毛細(xì)管電泳檢測(cè)兩者在毛細(xì)管內(nèi)的相互作用。
[0011] ⑵并測(cè)定受體檢測(cè)通道（625nm)與供體檢測(cè)通道（565nm)的峰值面積之比與含 有HAT標(biāo)簽多肽摩爾濃度的關(guān)系，繪制峰面積比-濃度的擬合曲線(xiàn)。
[0012] 進(jìn)一步地，所述的多肽與量子點(diǎn)生物探針在毛細(xì)管內(nèi)的進(jìn)樣順序?yàn)橄冗M(jìn)電泳速度 慢的量子點(diǎn)，再進(jìn)電泳速度快的熒光多肽。
[0013] 作為優(yōu)選，所述熒光染料標(biāo)記的HAT多肽，染料標(biāo)記的多肽C端具有HAT標(biāo)簽序列 可以偶聯(lián)QDs，N端偶聯(lián)熒光染料ATTO 590, QDs與熒光染料之間能產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移 現(xiàn)象。
[0014] 進(jìn)一步地，所述的量子點(diǎn)為含有Zn的量子點(diǎn)。
[0015] 作為優(yōu)選，所述的量子點(diǎn)為 CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe 或者 CdTe/ZnSe。
[0016] 本發(fā)明所取得的有益效果是，本發(fā)明提供的可用于一種快速檢測(cè)量子點(diǎn)與HAT標(biāo) 簽相互作用的方法，操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，進(jìn)一步拓展了量子點(diǎn)探針在生物分析領(lǐng)域的應(yīng) 用。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖I :ΑΤΤ0 590-HAT和QDs在毛細(xì)管內(nèi)自組裝的電泳圖（實(shí)線(xiàn)，565nm，QDs檢測(cè)通 道；虛線(xiàn)，625nm，ATT0 590 檢測(cè)通道），（a)QDs，（b)l:l(ATT0 590-HAT:QDs，下同），（c)2:l， (d)4:l，（e)8:l，（f)16:l〇
[0018] 圖2 :S625/S565的值與ATTO 590-HAT摩爾濃度的關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明將就以下實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，但應(yīng)了解的是，這些實(shí)施例僅為例示說(shuō)明 之用，而不應(yīng)被解釋為本發(fā)明實(shí)施的限制。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] ATTO 590-HAT與CdSe/ZnS QDs在毛細(xì)管內(nèi)的相互作用
[0022] 1、脂溶性QDs經(jīng)GSH轉(zhuǎn)換為水溶性QDs
[0023] 將18mg GSH，5mg Κ0Η，250 μ L甲醇混勻，取40 μ L混合溶液加入200 μ L脂溶性量 子點(diǎn)中，振蕩30min。振蕩結(jié)束后，加入200 yL ImM NaOH，脂溶性量子點(diǎn)即轉(zhuǎn)移到水相中。 取出上層量子點(diǎn)，加入ImL甲醇與30 μ L NaCl (30mg/mL)沉淀，溶于硼酸緩沖液（pH 7. 4， IOmM)中。反復(fù)沉淀兩次，最后溶于200 μ L硼緩沖液（pH 7. 4, IOmM)中。
[0024] 2、多肽合成與標(biāo)記
[0025] 多肽 DDSSGGKDHLIHNVHKEFHAHAHNK采用 Fmoc 固相合成法合成。用 HBTU/HOBt (1:1) 活化Fmoc保護(hù)的氨基酸，偶聯(lián)30min ;用堿性溶劑20%哌啶脫保護(hù)，暴露出氨基；采用 HBTU和HOBt活化下一個(gè)氨基酸上的羧基，與樹(shù)脂上的氨基偶聯(lián)，形成肽鍵；重復(fù)上述步 驟，反復(fù)循環(huán)添加氨基酸，直至合成完成。再用20%哌啶脫保護(hù)，暴露出氨基，用EDC/ HOBt(I = I)活化ATT0-590的羧基，進(jìn)行染料的標(biāo)記。用切割試劑（TFA，乙二硫醇，水和 TIS，94:2. 5:2. 5:1，v/v)將多肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)，然后經(jīng)過(guò)冰乙醚沉淀，離心收集沉淀， 經(jīng)過(guò)HPLC分離純化，冷凍干燥得到的最終產(chǎn)品ATTO 590-HAT。
[0026] 3、量子點(diǎn)生物探針的組裝
[0027] ATTO 590-HAT與QDs分別按照摩爾比1:1，2:1，4:1，8:1，16:1微量注入毛細(xì)管內(nèi)， 進(jìn)樣時(shí)間分別為10S，進(jìn)樣間隔20s，通過(guò)毛細(xì)管電泳檢測(cè)兩者的相互作用。隨著隨著ATTO 590-HAT與QDs摩爾比的增大，F(xiàn)RET逐漸增強(qiáng)（圖1)。
[0028] 4、曲線(xiàn)擬合
[0029] 通過(guò)對(duì)不同摩爾比條件下的ATTO 590-HAT受體檢測(cè)通道峰面積與 QDs供體檢測(cè)通道峰面積比（S625/S565)，繪制出擬合曲線(xiàn)（圖2)，得出曲線(xiàn)方程y =-0. 0012x2+0. 8888x+0.0814。
[0030] 實(shí)施例2
[0031] Cy5-HAT與CdSe/ZnS QDs在毛細(xì)管內(nèi)的相互作用
[0032] 步驟1一 3同實(shí)施例1。
[0033] 4、相互作用變化的曲線(xiàn)擬合
[0034] 通過(guò)對(duì)不同摩爾比條件下的Cy5-HAT受體檢測(cè)通道峰面積與QDs供體檢測(cè)通道峰 面積比（S 625/S565)，繪制出擬合曲線(xiàn)，得出曲線(xiàn)方程y = -0. 0008χ2+0. 0. 0742X+0. 1703。
[0035] 以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實(shí)施例為啟示，通過(guò)上述的說(shuō)明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完 全可以在不偏離本項(xiàng)發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進(jìn)行多樣的變更及修改。本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)性 范圍并不局限于說(shuō)明書(shū)上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來(lái)確定其技術(shù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速檢測(cè)量子點(diǎn)與HAT標(biāo)簽相互作用的方法，其特征在于， 熒光染料ATTO 590標(biāo)記的含有HAT標(biāo)簽多肽與量子點(diǎn)（QDs)在毛細(xì)管內(nèi)相互作用，將 量子點(diǎn)和染料標(biāo)記的多肽按不同摩爾比例先后微量注入毛細(xì)管內(nèi)，通過(guò)測(cè)定受體檢測(cè)通道 (625nm)與供體檢測(cè)通道（565nm)的峰值面積之比與含有HAT標(biāo)簽多肽摩爾濃度的關(guān)系， 繪制峰面積比-濃度的擬合曲線(xiàn)，通過(guò)熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)兩者之間在毛細(xì)管內(nèi)的相互作 用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)量子點(diǎn)與HAT標(biāo)簽相互作用的方法，其特征在 于，所述染料標(biāo)記的HAT標(biāo)簽多肽和量子點(diǎn)均為納升級(jí)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)量子點(diǎn)與HAT標(biāo)簽相互作用的方法，其特征在 于，所述的量子點(diǎn)為含有Zn的量子點(diǎn)，為CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)量子點(diǎn)與HAT標(biāo)簽相互作用的方法，其特征在 于，所述多肽含有天然組氨酸親和標(biāo)簽（HAT-tag)，序列為KDHLIHNVHKEFHAHAHNK，其中含 有6個(gè)組氨酸，通過(guò)組氨酸的咪唑基與量子點(diǎn)配位結(jié)合，結(jié)合穩(wěn)定。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)量子點(diǎn)與HAT標(biāo)簽相互作用的方法，其特征在 于，染料標(biāo)記的多肽C端具有HAT標(biāo)簽序列，N端偶聯(lián)熒光染料ATTO 590。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及納米生物技術(shù)領(lǐng)域一種快速檢測(cè)量子點(diǎn)與HAT標(biāo)簽相互作用的方法，其特征在于熒光染料ATTO？590標(biāo)記的含有HAT標(biāo)簽多肽與量子點(diǎn)(QDs)在毛細(xì)管內(nèi)相互作用，將量子點(diǎn)和染料標(biāo)記的多肽按不同摩爾比例先后注入毛細(xì)管內(nèi)，測(cè)定受體檢測(cè)通道(625nm)與供體檢測(cè)通道(565nm)的峰值面積之比與含有HAT標(biāo)簽多肽摩爾濃度的關(guān)系，繪制峰面積比-濃度的擬合曲線(xiàn)，通過(guò)毛細(xì)管電泳檢測(cè)兩者在毛細(xì)管內(nèi)的相互作用。本發(fā)明提供了一種可以準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測(cè)量子點(diǎn)與HAT標(biāo)簽相互作用的方法，操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，進(jìn)一步拓展了量子點(diǎn)探針在生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用。
【IPC分類(lèi)】G01N21/64
【公開(kāi)號(hào)】CN105136760
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510560728
【發(fā)明人】王建浩, 李進(jìn)晨, 柴宏, 張晨澄, 陳瑤, 滕一萬(wàn), 蔣鵬舉, 邱琳, 王車(chē)禮, 柳麗, 楊麗, 樊杰, 劉菲菲
【申請(qǐng)人】常州大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年9月6日