一種低聚木糖含量的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種低聚木糖含量的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 便秘是臨床常見的復(fù)雜癥狀，而不是一種疾病，主要是指排便次數(shù)減少、糞便量減 少、糞便干結(jié)、排便費(fèi)力等。導(dǎo)致便秘癥狀的原因很多。便秘在人群中的患病率高達(dá)27%， 可以影響各年齡段的人。女性多于男性，老年多于青、壯年。因便秘發(fā)病率高、病因復(fù)雜，患 者常有許多苦惱，便秘嚴(yán)重時會影響生活質(zhì)量。
[0003] 低聚木糖作為一種新興的功能性食品配料，因具有優(yōu)良的加工特性和多種生理調(diào) 節(jié)功能，被廣泛應(yīng)用于各種功能性食品中。低聚木糖（xylo-oligosaccharides)又稱木寡 糖，是由2~7個木糖殘基以(6-1,4糖苷鍵結(jié)合而構(gòu)成的低聚糖，其組成又以木二糖和木 三糖為主。低聚木糖能夠選擇性的促進(jìn)腸道雙歧桿菌等有益菌的增殖，使其成為腸道優(yōu)勢 菌群，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)腸道健康。雙歧桿菌是人體腸道內(nèi)的正常棲居的菌群，它 能夠選擇性的代謝低聚木糖產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸，相反，腸道中的葡萄球菌、大腸桿菌和許 多梭狀芽孢桿菌都不能利用低聚木糖。雙歧桿菌代謝低聚木糖產(chǎn)生的短鏈脂肪酸主要是乳 酸和醋酸，能夠降低腸道的PH值，抑制了其它有害菌的繁殖，使人體內(nèi)的吲哚、酚、氨和尸 胺等有害代謝物質(zhì)明顯減少，從而降低了人體患結(jié)腸癌等疾病的機(jī)率。同時，腸道酸性環(huán)境 的改善還能刺激腸道蠕動，增加糞便濕潤度，促進(jìn)排便，從而防止便秘發(fā)生，減少宿便對便 秘患者帶來的危害，同時，低聚木糖通過調(diào)節(jié)腸道菌群對腹瀉癥狀也有一定的緩解作用，因 而它是一種具有通便和緩解腹瀉的雙向調(diào)節(jié)劑。
[0004]目前，低聚木糖已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種醫(yī)藥制劑、口服液、食品和保健品中，其分 離和純化是低聚木糖結(jié)構(gòu)分析的關(guān)鍵。因為低聚木糖自身組成（低聚木糖中不同小聚體間 分子量相差較小）、連接、衍生化、微觀不均一性等方面的高度復(fù)雜性，使其檢測具有很大困 難。選擇合適的方法，對收集到的混合糖鏈進(jìn)行分離，是一項摸索性很強(qiáng)的工作。測定低 聚木糖的方法很多，如薄層色譜法、氣相色譜法、高效毛細(xì)管電泳和高效液相色譜法。其中， 目前最常用且效果最好的為高效液相色譜法，其液相色譜不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限 制。只要被分析物質(zhì)在流動相溶劑中有一定溶解度，便可以分析。在常溫下即可進(jìn)行柱分 離，毋須衍生化。特別對熱穩(wěn)定低的淀粉糖而言，該分析方法尤為適用。高效液相色譜對樣 品的回收比較容易，且是定量的，這對任何規(guī)模的制備目的特別有利。
[0005] 國標(biāo)GB/T23747-2009公開了一種檢測低聚木糖含量的方法。該方法基于低聚木 糖組分可溶于水，并在一定的稀硫酸水解條件下轉(zhuǎn)化成木糖，同時與水解生成的木糖之間 存在相對固定的系數(shù)關(guān)系的特性，檢測其含量。具體方法為：采用稀硫酸水解法將樣品中的 低聚糖轉(zhuǎn)化成木糖（單糖）。由于低聚木糖在水解過程中(6-1, 4-糖苷鍵斷裂與水分子結(jié) 合生成糖苷羥基，因此生成的木糖含量比水解前的木糖含量高。用"平均轉(zhuǎn)化系數(shù)"表示水 解生成的木糖與水解前的低聚木糖含量之比，其數(shù)值因低聚木糖的聚合度而異，均值約為 1. 06 (以木二糖計）。采用高效液相色譜法定量測定樣品中原有木糖的質(zhì)量含量和樣品中 低聚木糖經(jīng)稀酸水解后的木糖的質(zhì)量含量，二者之差除以低聚木糖和木糖的平均轉(zhuǎn)換系數(shù) 即得到樣品中低聚木糖的質(zhì)量含量。由于色譜柱的分離性質(zhì)導(dǎo)致木糖的目標(biāo)峰會受到雜質(zhì) 峰干擾，分離度很難達(dá)到要求，且前處理過程會影響木糖的水解量，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高。
[0006] 《保健食品功效成分檢測方法》中公開了一種口服液中低聚木糖的高效液相色譜 測定法。其方法為：前處理的原理是用60% (V/V)乙醇沉淀雜質(zhì)，然后進(jìn)行酸水解，使低聚 木糖水解成木糖，用高效液相色譜法測定，氨基柱分離，流動相為75 %乙腈水。此方法的樣 品前處理應(yīng)用于保健品中低聚木糖的檢測時，會影響木糖的水解量，導(dǎo)致分析結(jié)果偏高。由 于使用硅膠鍵合氨基柱分離，此色譜柱在分離分析的過程中，會受到明顯的溶劑效應(yīng)影響， 導(dǎo)致木糖峰型較差，且氨基柱的填料會受到極性溶劑的消耗，柱子使用壽命較短，柱效下降 較快。
[0007] 同時，針對胃腸道的保健產(chǎn)品配方除了含有低聚木糖之外，還加入了其他的纖維 素多糖類物質(zhì)，復(fù)配促進(jìn)增效。在這種情況下，其他的纖維素多糖類物質(zhì)也會影響低聚木糖 含量的檢測。目前還未有公開的檢測方法能夠準(zhǔn)確檢測低聚木糖的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種低聚木糖含量的檢測方法。該檢測方法可排除其它 功能糖纖維素的干擾，能夠準(zhǔn)確測定低聚木糖的含量；通過對低聚木糖的含量測定方法進(jìn) 行線性、精密度試驗、回收率試驗，均符合GB/T27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化 檢測》的要求，證明該檢測方法科學(xué)有效，能對低聚木糖的含量測定起到質(zhì)量控制的目的。
[0009] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明提供了一種低聚木糖含量檢測方法，取低聚木糖供試品，水解，獲得水解后 的低聚木糖供試品，采用HPLC進(jìn)行檢測，HPLC的色譜條件為：
[0011] 采用糖柱或氨基柱，以純化水或乙腈水溶液作為流動相進(jìn)行等度洗脫，根據(jù)HPLC 檢測結(jié)果，獲得低聚木糖含量。
[0012] 作為優(yōu)選，低聚木糖供試品的制備方法為：取樣品與無水乙醇混合，超聲提取，無 水乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，離心，取上清液，干燥，加水溶解，得到低聚木糖供試品。
[0013] 在本發(fā)明中，用無水乙醇溶解樣品，使樣品中其它功能糖纖維素等干擾物質(zhì)進(jìn)行 有效的沉淀分離，可排除干擾，準(zhǔn)確測定低聚木糖的含量。
[0014] 作為優(yōu)選，超聲提取的時間為10~20min。
[0015] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，超聲提取的時間為15min。
[0016] 作為優(yōu)選，糖柱為鈣型糖柱，流動相為純化水。
[0017] 本發(fā)明采用鈣型糖柱和純化水的HPLC體系進(jìn)行目標(biāo)峰分離，此體系穩(wěn)定，重現(xiàn)性 好。
[0018] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，鈣型糖柱長300mm，內(nèi)徑7. 8mm。
[0019] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，f丐型糖柱為phenomenex(菲羅門）Rezex RCM-MonosaccharideCa2+，8ym，300*7. 8mm〇
[0020] 作為優(yōu)選，糖柱的交聯(lián)度為8%。
[0021] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，鈣型糖柱為Bio-RadAminexHPX-87C鈣型， 9um，300*7. 8mm〇
[0022] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，氨基柱為WatersNova_Pak，4ym，250mm*3. 9mm。
[0023] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，水解為：加入硫酸，在100~120°C下水解90~ 120min，冷卻，調(diào)節(jié)pH值至6. 5~7. 5。
[0024] 作為優(yōu)選，水解為：加入硫酸，在110°C下水解90min，冷卻，用10%氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH值至7。
[0025] 作為優(yōu)選，在水解過程中，低聚木糖與硫酸的質(zhì)量比為1: (20~50)。
[0026] 優(yōu)選地，在水解過程中，低聚木糖與硫酸的質(zhì)量比為1: (24~28)。
[0027] 本發(fā)明優(yōu)化了水解低聚木糖的硫酸添加量和水解后pH值，使樣品溶液的鹽濃度 控制在適合的范圍，既保證了低聚木糖的完全水解，又保證了將色譜柱的消耗減至最低，同 時保證了鹽峰與目標(biāo)峰有足夠的分離度。
[0028] 作為優(yōu)選，HPLC檢測的流速為0? 3~0? 6mL/min。
[0029] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，HPLC檢測的流速為0. 5mL/min。
[0030] 作為優(yōu)選，HPLC檢測的柱溫為60~80°C。
[0031] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，HPLC檢測的柱溫為65°C。
[0032] 作為優(yōu)選，HPLC檢測的檢測池溫度為50~70°C。
[0033] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，HPLC檢測的檢測池溫度為60°C。
[0034] 作為優(yōu)選，HPLC檢測的進(jìn)樣量為10~80yL。
[0035] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，HPLC檢測的進(jìn)樣量為60yL。
[0036] 作為優(yōu)選，HPLC檢測的運(yùn)行時間為30~60min。
[0037] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，HPLC檢測的運(yùn)行時間為30min。
[0038] 作為優(yōu)選，乙腈水溶液中乙腈與水的體積比為80:20。
[0039] 本發(fā)明提供了一種低聚木糖含量的檢測方法。該檢測方法包括：取低聚木糖供試 品，水解，獲得水解后的低聚木糖供試品，采用HPLC進(jìn)行檢測，HPLC的色譜條件為：采用糖 柱或氨基柱，以純化水或乙腈水溶液作為流動相進(jìn)行等度洗脫，根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，獲得 低聚木糖含量。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢之一：
[0040] 本發(fā)明可排除其它功能糖纖維素的干擾，能夠準(zhǔn)確測定低聚木糖的含量；
[0041] 本發(fā)明檢測方法通過對低聚木糖的含量測定方法進(jìn)行線性、精密度試驗、回收率 試驗，均符合GB/T27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》的要求，證明該檢測 方法科學(xué)有效，能對低聚木糖的含量測定起到質(zhì)量控制的目的。
【附圖說明】
[0042] 圖1示木糖對照品的圖譜；
[0043] 圖2示樣品水解前圖譜；
[0044] 圖3示樣品水解后圖譜；
[0045] 圖4示木糖濃度與響應(yīng)值線性關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0046] 本發(fā)明公開了一種低聚木糖含量的檢測方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi) 容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員 來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施 例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和 應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0047] 本發(fā)明提供的低聚木糖含量檢測方法中所用原料藥或輔料均可由市場購得。
[0048] 儀器與設(shè)備：高效液相色譜儀（帶示差折射光檢測器）；電子天平（感量0.Img); 超聲波設(shè)備儀。
[0049] 試劑：純化水；10%氫氧化鈉溶液：稱取10.Og氫氧化鈉溶于90mL純化水；12%硫 酸溶液；木糖標(biāo)準(zhǔn)液（來源：中檢所，批號=111508-200404,純度：100% ) ;pH試紙；無水乙 醇。
[0050] 下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0051] 實施例1~3低聚木糖含量的檢測
[0052] 液相色譜條件：
[0053] 表1本發(fā)明實施例1~3的色譜條件
[0054]
[0055] 2、對照品貯備液的配制：
[0056] 稱取木糖對照品50mg，加純化水超聲溶解后用純化水定容至IOmL容量瓶中，配成 濃度為5.Omg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4°C避光保存。
[0057] 3、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制：
[0058] 分別取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液0. 04mL、0.lmL、0. 2