一種同時檢測乳制品中雙氰胺和三聚氰胺含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學分析技術領域，進一步屬于食品安全檢測領域，具體涉及一種同 時檢測乳制品中雙氰胺和三聚氰胺含量的方法。
【背景技術】
[0002] 目前，食品中非蛋白含氮物質(zhì)的檢測尚未引起足夠重視，尤其是乳制品中的非蛋 白氮的殘留、摻假等問題嚴重影響了乳制品企業(yè)乃至整個行業(yè)的生存發(fā)展，危害人體健康， 影響人們的正常生活。2013年1月25日，美國《華爾街日報》報道，新西蘭乳品巨頭恒天 然集團出產(chǎn)的部分牛奶和奶粉中，檢測出少量的有毒化學物質(zhì)雙氰胺（dicyandiamide，簡 稱DCD)。一方面，新西蘭聲稱含有少量雙氰胺殘留物的食品對人體無害；另一方面，又下令 禁售含有雙氰胺的奶類制品。全球60%的奶制品企業(yè)和乳品供應商采用新西蘭奶源，新西 蘭乳制品占到中國全進口嬰幼兒食品的40%左右。在國內(nèi)"三鹿奶粉事件"發(fā)生后國人對 國產(chǎn)嬰幼兒奶粉信心全失的情況下，無論涉事各方面如何解釋雙氰胺的低毒性甚至是無毒 性，此次事件無疑引發(fā)了中國民眾對奶制品新一輪的恐慌且再次引起人們對乳制品安全問 題的關注。
[0003] 對健康的影響不能以有關方面解釋的"毒不死"為標準。至于雙氰胺能否致癌、致 畸、致突變、過敏，以及損害人體器官，很少有實驗數(shù)據(jù)。對健康而言，"沒有實驗數(shù)據(jù)"的時 候，就更應該采取保守謹慎的態(tài)度。而且在奶制品行業(yè)信譽低下、食品安全極度敏感的社會 現(xiàn)實面前，制定雙氰胺的殘留檢測安全標準是不得不做的事情。
[0004] 雙氰胺是一種重要的化工產(chǎn)品中間體，別名二氰二胺、二聚氨基氰(是氰胺的二 聚體，也是胍的氰基衍生物)，其病理實驗數(shù)據(jù)顯示：小鼠經(jīng)口LD5Q>4000mg/kg，家兔經(jīng)口 LD5Q>3000mg/kg，即如果給一批lkg的小鼠喂養(yǎng)雙氰胺超過4000mg就會導致半數(shù)小鼠中 毒死亡。盡管雙氰胺的毒性雖小，但大量或長期接觸對人體的危害是不可忽視的。特別對 于嬰幼兒來說，各個臟器尚未發(fā)育完全，肝臟的代謝功能、腎臟排泄系統(tǒng)均未完善，體內(nèi)的 物質(zhì)代謝與成人不同，毒性反應也有差異，有毒物質(zhì)的長期累積勢必對其臟器勢有一定的 損害，而且毒物的三致"致畸、致癌、致突變"性質(zhì)的確定是一個長期的體內(nèi)過程，那么嬰幼 兒在成長過程中就必須杜絕有毒有害物質(zhì)的攝入。
[0005] 目前，我國現(xiàn)已有GB/T22388- 2008原料乳及乳制品中三聚氰胺檢測方法標準， 但尚未建立嬰幼兒奶粉中雙氰胺殘留量檢測標準，針對同時檢測嬰幼兒奶粉中三聚氰胺和 雙氰胺的文獻報道也極少。因此，建立一種快速準確并能同時檢測乳制品中三聚氰胺和雙 氰胺殘留量的方法迫在眉睫，可為準確客觀評價乳制品中雙氰胺和三聚氰胺含量提供技術 手段；對乳制品安全性的評價及保護人們的身體健康具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種同時檢測乳制品中雙氰胺和三聚氰胺含量的方法。該目 的是這樣實現(xiàn)的：所述的一種同時檢測乳制品中雙氰胺和三聚氰胺含量的方法包括如下步 驟： (1) 標準溶液制備：先分別制備雙氰胺和三聚氰胺標準儲備液；再將兩種儲備液混合 稀釋為標準混合溶液；最后將標準混合溶液進行梯度稀釋，得到標準混合工作溶液系列； (2) 待測樣品處理：將待測樣品溶解于水中，加入蛋白質(zhì)沉淀劑，渦旋、離心得到上清 液，加入除脂劑后渦旋、離心，棄除脂劑層，在清液中加入凈化包，渦旋、離心得上清液，最后 經(jīng)微孔濾膜過濾，得到待測液； (3) 采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行檢測，將步驟（1)所述的標準混合工作溶液系 列和步驟（2)所述的待測液分別進樣，先制作標準曲線，根據(jù)標準曲線和所述待測液的進樣 結(jié)果來計算雙氰胺和三聚氰胺的含量；其中： 色譜條件為： 色譜柱：C18,150mmX2.ImmX5ym； 流速：〇? 2mL/min; 柱溫：25°C; 進樣量：5yL; 流動相A: 10mm〇l/L乙酸銨水溶液用乙酸調(diào)節(jié)pH至3. 0,流動相B:乙腈；梯度洗脫，洗 脫程序為洗脫程序如表1所示。
[0007] 表1高效液相色譜梯度洗脫條件
質(zhì)譜條件為： 電噴霧電離源（ESI); 掃描方式：正離子掃描； 檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM); 電噴霧電壓：500V; 干燥氣溫度：325°C; 干燥氣流量：6L/min; 鞘氣溫度：380°C; 鞘氣流量：1〇L/min; 毛細管電壓：3500V; 質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。
[0008] 表2質(zhì)譜參數(shù)
由于乳制品中雙氰胺和三聚氰胺的含量較低，特別是雙氰胺有時僅為痕量，傳統(tǒng)方法 很難檢測出來，本發(fā)明采用的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法克服了傳統(tǒng)檢測方法的不 足，滿足了食品中微量雙氰胺和三聚氰胺的檢測要求，且具有專屬性強、靈敏度高的特點。
【附圖說明】
[0009] 圖 1 為AgelaVenusilAS-TC1S總離子流圖； 圖中，2. 323為雙氰胺離子峰，8. 458為三聚氰胺離子峰。
[0010] 圖2為三聚氰胺定量離子85. 1的離子圖； 圖3為三聚氰胺定性離子68. 1的離子圖； 圖4為雙氰胺定量離子68. 1的離子圖； 圖5為雙氰胺定性離子43. 1的離子圖； 圖6為某品牌幼兒配方奶粉的總離子流圖。
【具體實施方式】
[0011] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于 本發(fā)明教導所作的任何變換，均落入本發(fā)明保護范圍。
[0012] 本發(fā)明所述的一種同時檢測乳制品中雙氰胺和三聚氰胺含量的方法包括如下步 驟： (1)標準溶液制備：先分別制備雙氰胺和三聚氰胺標準儲備液；再將兩種儲備液混合 稀釋為標準混合溶液；最后將標準混合溶液進行梯度稀釋，得到標準混合工作溶液系列。
[0013] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述標準溶液的制備方法為：準確稱取雙氰胺和三聚氰 胺標準品各25.Omg，用甲醇分別溶解定容至25.OmL，得到1000yg/mL的標準儲備液；移取 所述標準儲備液各1.OmL混合，用去離子定容至100mL，制成10yg/mL的標準混合溶液； 最后用陰性乳制品基質(zhì)溶液進行梯度稀釋，得到標準混合工作溶液系列。標準混合工作溶 液系列雙氰胺的質(zhì)量濃度為1~209ng/mL，三聚氰胺的質(zhì)量濃度為2~420ng/mL。
[0014] (2)待測樣品處理：將待測樣品溶解于水中，加入蛋白質(zhì)沉淀劑，渦旋、離心得到上 清液，加入除脂劑后渦旋、離心，棄除脂劑層，在清液中加入凈化包，渦旋、離心得上清液，最 后經(jīng)微孔濾膜過濾，得到待測液； 由于乳制品，特別是奶粉成分復雜，蛋白質(zhì)和脂類蛋白質(zhì)和脂肪類含量較高，因此在奶 粉的前處理過程中，非常重要就是除去蛋白質(zhì)和脂類?，F(xiàn)常用的除去蛋白質(zhì)的方法為選擇 某種蛋白質(zhì)沉淀劑使蛋白質(zhì)沉淀，然后離心、過濾除去。常用的蛋白質(zhì)沉淀劑包括三氯乙酸 溶液、氨水乙腈及其水溶液、乙腈。通過試驗，比較三種沉淀劑的沉淀效果，結(jié)果顯示：應用 三氯乙酸提取后要運用固相萃取小柱進行凈化和濃縮，固相萃取小柱對雙氰胺和三聚氰胺 同時提取效果不好；用氨化乙腈溶液和乙腈同時提取奶粉中雙氰胺和三聚氰胺簡單方便， 提取液可不用進行固相萃取。其中，5%氨化乙腈和乙腈進行提取的效果沒有明顯區(qū)別，乙腈 略好一些，但因無需配制溶液，乙腈的使用更方便一些。
[0015] 去除溶液中脂類物質(zhì)的方法是使用除脂劑萃取脂類物質(zhì)，再渦旋、離心分離。常用 除脂劑包括正己烷和石油醚等，一般除脂1次即可，但為保證脂類物質(zhì)去除完全且基質(zhì)干 擾較少，本發(fā)明優(yōu)選使用正己烷除脂2次。
[0016] 經(jīng)過去除蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)后，為了進一步消除基質(zhì)的干擾，使用凈化包進行凈 化處理。常用的凈化包為AgilentQuEChERs凈化包和月旭WelchromQuChERS-雙氰胺凈 化管。但是，后者對雙氰胺的凈化效果較好，對三聚氰胺的凈化效果較差，因此本發(fā)明優(yōu)選 AgilentQuEChERs凈化包（25mgClf^P150mgMgS04)對提取液進行凈化。
[0017] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述微孔濾膜的孔徑為0. 2ym。
[0018] (3)采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行檢測，將步驟（1)所述的標準混合工作溶 液系列和步驟（2)所述的待測液分別進樣，先制作標準曲線，根據(jù)標準曲線和所述待測液的 進樣結(jié)果來計算雙氰胺和三聚氰胺的含量；其中： 色譜條件為： 色譜柱：C18,150mmX2.ImmX5ym； 流速：〇? 2mL/min; 柱溫：25°C; 進樣量：5yL; 流動相A: 10mm〇l/L乙酸銨水溶液用乙酸調(diào)節(jié)pH至3. 0,流動相B:乙腈；梯度洗脫，洗 脫程序如表1所示。
[0019] 質(zhì)譜條件為： 電噴霧電離源（ESI); 掃描方式：正離子掃描； 檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM); 電噴霧電壓：500V; 干燥氣溫度：325°C; 干燥氣流量：6L/min; 鞘氣溫度：380°C; 鞘氣流量：1〇L/min; 毛細管電壓：3500V; 質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。
[0020] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，色譜柱采用AgelaVenusilAS-T(：18色譜柱。
[0021] 檢測后，乳制品中雙氰胺和三聚氰胺的定性方法為： 在相同實驗條件下，如果待測液中檢出的色譜峰的保留時間與標準溶液中的某種組分 峰的保留時間一致(表3,圖1)，并且所選擇的兩對子離子的質(zhì)荷比一致，待測液的定性離 子相對豐度與標準工作溶液進行比較時，相對偏差不超過表4規(guī)定的范圍，則可判定樣品 中存在該組分。
[0022] 表3雙氰胺和三聚氰胺的保留時間和定性離子相對豐度
表4定性確定時相對離子豐度的最大允許偏差
檢測后，乳制品中雙氰胺和三聚氰胺的定量方法為: 根據(jù)標準溶液的標準混合工作溶液系列的檢測結(jié)果，制作標準曲線，樣品中雙氰胺和 三聚氰胺的質(zhì)量分數(shù)用外標法定量，按公式（1)進行計算：
(1) 式中為樣品中某種組分的質(zhì)量分數(shù)，ng/g;C,為由標準曲線得出的樣品中某種組分 的質(zhì)量濃度，ng/mL;c。為空白溶液某種組分的質(zhì)量濃度，ng/mL;偽樣品定容體積，mL為 樣品質(zhì)量，g。
[0023] 以兩次平行測定的平均值為測定結(jié)果，結(jié)果精確至0. 01ng/g;兩次平行測定結(jié)果 之間的相對偏差不應大于10. 〇%。
[0024] 另外，一般乳制品包括液體乳、乳粉和其他乳制品都可用本發(fā)明所述的方法同時 檢測雙氰胺和三聚氰胺含量。
[0025] 實施例1待測樣品檢測 (1)儀器 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：1290高效液相色譜儀(美國Agilent公司），Agilent6460三重 四級桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(美國Agilent公司）；分析天平(瑞士梅 特勒；型號：AB204-S);渦旋混勻器；離心機；具螺旋蓋聚四氟乙烯離心管（50mL)。
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