一種雌二醇磁性分子印記納米粒電化學傳感膜的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析檢測技術領域，具體涉及一種雌二醇磁性分子印記納米粒電化學 傳感膜（MMIES)的制備方法。
【背景技術】
[0002] 17-β雌二醇（E2)作為內分泌干擾物之一，有研宄表明兒童性早熟，男性前列腺 癌，婦女乳腺癌和子宮癌發(fā)病率的上升都與食品中的雌激素殘留有關。此外，它還會影響女 性的生理規(guī)律，甚至會導致不孕。痕量級別的雌二醇就能夠引起體液免疫和細胞免疫的失 調，導致生殖免疫、心血管和神經系統(tǒng)的病變。但是由于雌激素生產過程中的殘留和非法添 加等原因，往往造成環(huán)境污染和食品安全等問題出現(xiàn)。為了保證廣大消費者的身體健康，規(guī) 范食品市場，建立一個可靠快速的雌激素檢測方法是非常必要而又迫切的問題。
[0003] 電化學傳感器是一種重要的電子器件，因其設計簡單、靈敏度高、價格低廉、可實 現(xiàn)人體實時檢測、可滿足臨床診斷、環(huán)境分析、食品分析和產品檢測需要等優(yōu)點，越來越受 到人們的關注。分子印記技術是制備具有特異選擇性或專一選擇性聚合物的技術。其最顯 著的三大特點為：構效預定性，特異識別性和廣泛適用性。目前磁性分子印記納米傳感膜及 電化學檢測復雜體系中雌二醇相關研宄未見報道。
[0004] 食品、保健品由于自身成分的復雜性，以及添加劑種類的多樣性和未知性等問題， 對其含有雌二醇的分析檢測提出了更高的要求。已有文獻報道的檢測方法有：HPLC、LC-MS、 GC-MS等。這些傳統(tǒng)的方法雖然也能實現(xiàn)對雌二醇的測定，但往往由于樣品基質復雜而需要 經過繁瑣的樣品前處理，這大大影響了目標物檢測的準確性和快捷性。近來基于納米材料 和納米技術的生物傳感器和電化學傳感器因具有快速、靈敏、穩(wěn)定的特點成為熱門研宄領 域。特別是分子印記電化學傳感器（MIES)因具有高靈敏度和選擇性成為一種極具前景的 電化學仿生傳感器，已經被廣泛應用于復雜體系微痕量目標物的識別和靈敏檢測。MIES往 往需要復雜的電極修飾和電化學聚合傳感膜形成過程，制備和操作技術要求高，不利于推 廣和應用。MIPs電聚合傳感膜雖然可多次重復使用，但電極拋光再生處理時間長，電極利用 率低，電極磨耗導致使用壽命有限。另外，MIPs結構對電化學響應有明顯影響，構建優(yōu)良 電傳導和催化活性的MIPs對提高MIES檢測靈敏度有重要作用。因此設計和制備電活性結 構MIPs，研宄具有普適性強的高靈敏度和選擇性MIES將有顯著意義。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于雌激素電化學檢測的磁性分子印記納米傳感膜的 制備方法，該法首次結合電化學傳感技術、磁性吸附技術、分子印記納米粒三者的優(yōu)點構筑 以雌二醇為代表的磁性分子印記納米電化學傳感膜，實現(xiàn)了對復雜基質中微痕量雌二醇快 速檢測，本方法測定靈敏度高，對目標物選擇性強，操作簡單，具有良好的普適性。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過以下措施達到：
[0007] 一種雌二醇磁性分子印記納米粒電化學傳感膜制備方法，其特征在于該方法包括 以下步驟：
[0008] a)分子印記自組裝溶液的制備：在Fe3O4OAu-GSH納米粒中加入E2-乙醇溶液，攪 拌反應，溶液通氮氣除氧后加入苯胺-HCl溶液，避光攪拌均勻；
[0009] b)聚合反應：在步驟a)得到的溶液中加入引發(fā)劑過硫酸銨（APS)，避光攪拌反 應；
[0010] c)洗脫模板分子：將步驟b)得到的溶液，磁性分離去除上清液，水洗，加 HCl-乙 醇溶液處理，脫去模板分子，得Fe3O4IgAu-GSH-PANI磁性分子印跡納米粒（MMIPs);
[0011] d)富集模板分子：將制得的MMIPs置于E2-PBS溶液中，攪拌吸附，得到E2-MMIPS ;
[0012] e)電化學檢測：將含E2-MMIPs的溶液置于反應池中，用磁性玻碳電極（MGCE)磁 性吸附5min~lh，使得電極表面成膜。
[0013] 在步驟a)中，每5mg~20mg的Fe3O4OAu-GSH納米粒，加入5mL~50mL濃度范圍 為lmmol/L~20mmol/L的E2-乙醇溶液，所使用的乙醇為無水乙醇，反應時間1~20h。加 入苯胺-HCl溶液前通氮氣的時間為1~50min。
[0014] 在苯胺-HCl溶液中，苯胺和HCl的體積比范圍為I :10~20, HCl的濃度范圍為 0. 05mol/L~5mol/L。溶液的酸度增加，電子轉移速率增大，質子化作用加強，有利于聚苯 胺的合成，但是酸度過大，會使得磁性分離難度加大，最后得到的MMIPs導電性能減弱。本 實驗中，苯胺和HCl的最佳摩爾濃度比為1:2. 5。
[0015] 步驟a)的整個過程的反應溫度為5~50°C。
[0016] 在步驟b)中，過硫酸按以過硫酸按溶液的形式加入，每含5mg~20mg的Fe3O 4O Au-GSH納米粒的分子印記預組裝溶液中，加入濃度范圍為IOmmo I/L~500mmo I/L的過硫酸 銨溶液〇. ImL~5mL，聚合反應時間為2~20h，反應溫度為0~50°C。聚合時間影響印記 的效果，聚合時間過短，Ip的響應值很弱，聚合反應時間過長，E2嵌入過深，Ip的響應值也 會減小。本實驗中的最佳聚合反應時間為6h。
[0017] 在步驟c)中，HCl-乙醇溶液的濃度范圍為0· 05mol/L~2. Omol/L，攪拌時間為 5min~2h，可在5~50°C溫度條件下處理。
[0018] 在步驟d)中，MMIPs的加入量質量范圍為5mg~50mg，E2-PBS濃度為0· 01~ 2. Omol/L，攬拌時間為5min~5h。
[0019] Fe3O4OAu-GSH納米粒的制備包括制備Fe3O4磁性納米粒，F(xiàn)e 304表面接NH 2，制備 Fe3O4OAu納米粒，連接功能基團疏基步驟。
[0020] 制備Fe3O4磁性納米粒步驟具體如下：
[0021] 在氮氣保護及磁力攪拌下，將FeCl3 · 6H20和FeCl2 · 4H20的混合水溶液，加熱至 20-80°C后，逐滴加入NH3 · H2O反應20~60min，磁性分離去上清液，收集反應沉淀物水洗， 獲得Fe3O 4磁性納米粒。其中，F(xiàn)eCl 3 ·6H20與FeCl2 · 4H20的摩爾比為3:1~I: I，F(xiàn)eCl3 · 6H20 在混合水溶液的體積濃度為0. 05~0.1 mmol/mL，每100_300ml混合水溶液加入NH3 ·Η20的 體積范圍為5mL~20mL。
[0022] 在Fe3O4表面接NH 2步驟具體如下：取Fe 304磁性納米粒，加入APTES-乙醇溶液，溫 度為0~80°C攪拌反應l_48h，磁性分離去上清液，加乙醇清洗溶解，得到APTES包裹Fe 3O4 納米粒。其中，APTES-乙醇的體積濃度范圍為0. 1%~5%，每5-20mgFe304磁性納米粒加 入的體積范圍為5mL~20mL。
[0023] 制備Fe3O4OAu納米粒步驟具體如下：取I-IOOmg APTES包裹Fe3O4納米粒，加入 0.1 -10mL體積濃度為1% -5%的HAuC14水溶液和I. 4-140mL二次蒸餾水，超聲分散后，繼 續(xù)超聲同時加入濃度范圍為2mmol/L~20mmol/L NaBH4直至溶液顏色由黃褐色變?yōu)樽鲜砩?得到Fe3O4OAu納米粒溶液，反應溫度為10~100°C。在制備Fe 3O4OAu納米粒步驟中，NaBH4 在反應中作還原劑，將金離子還原成金納米粒包裹在Fe3O4的表面，配制的NaBH 4溶液濃度 不宜過高，且滴加速度應緩慢同時超聲分散，否則會使還原反應迅速進行，生成的金納米粒 不能均勻地包裹在Fe 3O4的表面。
[0024] 在上述 Fe3O4OAu 納米粒溶液中，加入 0. 5mL ~30mL 5mmol/L ~100mmol/L GSH， 攪拌反應l-48h，反應溫度為5~50°C。磁性分離去上清液，水洗，得到Fe304@Au/GSH納米 粒。加入的GSH也可以是其他含巰基（-SH)的氨基酸，如半胱氨酸。
[0025] 上述雌二醇磁性分子印記納米粒電化學傳感膜的制備方法，具體可包括以下步 驟：
[0026] 1、磁性分子印記納米粒電化學傳感膜的制備
[0027] a)制備Fe3O4納米粒：在氮氣保護下，加熱FeCl 3 · 6H20與FeCl2 · 4H20的混合水 溶液，劇烈攪拌的條件下滴加 NH3 · H2O反應，反應結束后磁性分離去上清液，水洗沉淀物得 Fe3O4磁性納米粒。
[0028] b) Fe3O4表面接-NH 2:取Fe 304納米粒，加入APTES-乙醇溶液，攪拌反應，磁性分離 去上清液，加乙醇清洗溶解，得到APTES包裹Fe 3O4納米粒。
[0029] c)制備Fe3O4OAu納米粒：取步驟b)中得到的APTES包裹Fe3O 4納米粒，加入HAuCl4 和適量的二次蒸餾水，超聲分散，繼續(xù)超聲同時加入NaBH4直至溶液顏色由黃褐色變?yōu)樽?薯色；
[0030] d)連接功能基團-疏基：在步驟c)得到的溶液中，再加入GSH攪拌反應，磁性分 離去上清液，水洗；得到Fe3O 4OAu-GSH納米粒。
[0031] e)分子印記自組裝溶液：將得到的Fe3O4OAu-GSH納米粒中加入E2-乙醇溶液，攪 拌反應，溶液通氮氣除氧后加入苯胺-HCl溶液，避光攪拌均勻；
[0032] f)聚合反應：在步驟e)得到的溶液中加入引發(fā)劑過硫酸銨（APS)，避光攪拌反 應；
[0033] g)洗脫模板分子：將步驟f)得到的溶液，磁性分離去除上清液，水洗，加 HCl-乙 醇溶液處理，脫去模板分子，得Fe3O4IgAu-GSH-PANI磁性分子印記納米粒（MMIPs);
[0034] h)富集模板分子：將制得的麗IPs置于E2-PBS溶液中，攪拌吸附，得到E2-MMIPS ;
[0035] i)電化學檢測：將步驟h)中含E2-MMIPs的溶液置于反應池中，用磁性玻碳電極 (MGCE)磁性吸附，進行電化學測定。
[0036] 通過以下方法對本發(fā)明磁控電化學傳感膜進行檢測：
[0037] 電化學檢測方法和條件：
[0038] 循環(huán)伏安法（CV)法：檢測電位范圍為-0. 2~0. 6V，掃描速率為IOOmV 測試 底液為 〇· Imol · L-1KCl 和 Immol · T1K3Fe (CN) 6溶液。
[0039] 差示脈沖法（DPV)法：檢測電位范圍為-0. 2~0. 8V，掃描速率為50mV · s'電位 增量為〇. 005V，振幅為0. 05V，脈沖寬度為0. ls，采樣寬度為0. 02s，靜止時間為2s。測試前 電極用Al2O3粉末拋光、乙醇、蒸餾水超聲清洗、氮氣吹干。測試底液為0. 05mol · L -1PBS (pH 7· 0)-0· Imol · T1KCl 溶液。
[0040] 樣品測定：以測定奶粉中的雌二醇為例，稱取某奶粉粉末lg，以20mL乙醇超聲溶 解Ih后，12000rpm離心5min，取上清液，真空干燥。干燥后用5mL乙醇復溶，取0. 5mL用 pH7. 0磷酸鹽緩沖液稀釋到5mL，將實施例1方法制得的MMIPs置于溶液中攪拌吸附30min。 MGCE在得到的E2-MMIPS溶