膀胱癌檢測(cè)組合物、試劑盒及相關(guān)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測(cè)癌癥的組合物、試劑盒和方法，特別地涉及用于檢測(cè)膀脫癌的該 種組合物、試劑盒和方法，且更特別地涉及用于無(wú)創(chuàng)地檢測(cè)膀脫癌的該種組合物、試劑盒和 方法。此外，該種組合物、試劑盒和方法在使用免疫組織化學(xué)程序的情況下可用作輔助細(xì)胞 學(xué)評(píng)價(jià)。
【背景技術(shù)】
[0002] 膀脫癌是全世界五種最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。2010年僅在美國(guó)的膀脫癌病例預(yù) 計(jì)為 67, 160 例，預(yù)計(jì)死亡 13, 750 例（A. Jemal 等，Cancer Statistics, 2010CA:A Cancer Journal for Clinicians 60, 277-300, 2010)。當(dāng)早期檢查到時(shí)，5年內(nèi)的存活率大約為 94% ;因此及時(shí)的介入可W顯著提高患者存活的概率。目前，超過(guò)80%的膀脫腫瘤是非浸 潤(rùn)性的乳頭瘤（pTa或pTl)，但是剩余部分在診斷期間展現(xiàn)出肌肉浸潤(rùn)并具有更不太有利 的預(yù)后。
[0003] 盡管肌肉浸潤(rùn)性疾病需要根治性手術(shù)，非肌肉浸潤(rùn)性腫瘤在有或沒(méi)有膀脫灌注 療法的情況下，通過(guò)經(jīng)尿道切除腫瘤可W更保守地治療；然而，70% W上的患有早期階段 疾病的患者會(huì)在診斷后的前兩年有復(fù)發(fā)，該使得膀脫癌成為最常見(jiàn)的癌癥之一。如果不 及時(shí)治療，該些最初非浸潤(rùn)性病變可演變?yōu)榧∪饨?rùn)性病變化Millan-Ro化iguez等，J. 化〇1. 164, 680-84, 2000)。膀脫癌的復(fù)發(fā)現(xiàn)象意味著患者需要至少每年一次的嚴(yán)格監(jiān)控。為 了生命的質(zhì)量和積極的臨床結(jié)果，及時(shí)發(fā)現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)和初步診斷同樣重要。
[0004] 目前的主要診斷方法是膀脫鏡檢查結(jié)合尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查（VUC)。膀脫鏡檢 查是不舒服的侵入性操作且成本高，并可能造成感染和創(chuàng)傷。VUC仍然是用于非侵入性 檢查膀脫癌的可選擇方法；然而，盡管試驗(yàn)具有良好的特異性，但靈敏度是次優(yōu)的，尤其 是對(duì)于低級(jí)和低階段腫瘤值.S. Kaufman 等，Lancet 374, 239-49, 2009 ;D.Trivedi and E. M. Messing, BMC Urol. 9, 13, 2009)。
[0005] 許多用于尿分析的診斷蛋白標(biāo)志物已被商業(yè)開(kāi)發(fā)，但單一的生物標(biāo)志物的試驗(yàn)缺 乏足夠的能量來(lái)替代VUC或減少重復(fù)膀脫鏡檢查的需求?？紤]到信號(hào)通路的兀余，分子網(wǎng) 絡(luò)之間的串?dāng)_和腫瘤的寡克隆性，該不奇怪。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了用于檢測(cè)非侵入性 所得材料中的膀脫癌的可選生物標(biāo)志物的鑒定，該提供了理想的全基因組分析策略。 發(fā)明概要
[0006] 通過(guò)舉例的方式提供了用于診斷膀脫癌的組合物和方法。該方法可包括檢測(cè)至少 兩種在體樣品中結(jié)合的生物標(biāo)志物的過(guò)度表達(dá)，例如，尿液樣品，眾所周知，其中含有源于 包括尿路上皮的膀脫粘膜的基因和基因產(chǎn)物。該方法能把患有膀脫癌的受試者得到的生 物樣品與未患有癌癥（例如膀脫癌）的受試者獲得的樣品區(qū)分出來(lái)。在一個(gè)實(shí)施方式中， 該方法包括生物標(biāo)志物的預(yù)選組合的檢測(cè)，所述生物標(biāo)志物在疾病狀態(tài)下選擇性地過(guò)度表 達(dá)，而不是在正常組織中。
[0007] 該方法也可與其它有創(chuàng)或無(wú)創(chuàng)的診斷技術(shù)結(jié)合使用，該些技術(shù)目前在本領(lǐng)域已知 或?qū)⒃谖磥?lái)研發(fā)。
[000引生物標(biāo)志物的過(guò)度表達(dá)可W在蛋白質(zhì)或核酸水平上評(píng)估。在一些實(shí)施方式中，提 供了用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑W及包含該些試劑的試劑盒。
[0009] 本發(fā)明的教導(dǎo)基于當(dāng)前發(fā)明者先前的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)，展示出分析尿脫落基因 表達(dá)分析的可行性W鑒定膀脫癌相關(guān)的基因標(biāo)簽（C.J. Rosser等，Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18(2), 444-53, Feb. 2009)。該里，發(fā)現(xiàn)分析階段擴(kuò)大到92例，選取的候 選生物標(biāo)志物分別在兩套獨(dú)立的81個(gè)和127個(gè)尿液樣品中進(jìn)行驗(yàn)證。尿路上皮細(xì)胞mRNA 的線(xiàn)性擴(kuò)增能夠分析最小樣品中47, 000個(gè)W上的轉(zhuǎn)錄，且統(tǒng)計(jì)分析確定了與膀脫癌相關(guān) 的差異表達(dá)的一組52個(gè)基因（P<0. 001)。
[0010] 在驗(yàn)證階段，使用定量PCR或化ISA策略對(duì)自然排出的尿液樣本中獲得的尿路上 皮細(xì)胞監(jiān)測(cè)選定的44個(gè)祀轉(zhuǎn)錄。許多單個(gè)的基因/蛋白質(zhì)顯示出有希望作為膀脫癌檢測(cè) 的生物標(biāo)志物，W及作為多個(gè)基因/蛋白質(zhì)的生物標(biāo)志物成員（panel)，例如，示例性的9個(gè) 和14個(gè)成員的組合物和試劑盒，實(shí)現(xiàn)了非常高的鑒別能力。該些生物標(biāo)志物可W納入可靠 的尿分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從而導(dǎo)致用于膀脫癌檢測(cè)和高?；颊弑O(jiān)測(cè)的可靠、精確、無(wú)創(chuàng)的測(cè)試。
[0011] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括用于檢測(cè)受試者泌尿生殖器相關(guān)癌癥（包括膀脫 癌）的方法，該方法包括確定受試者的生物樣品中的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物的存在或存 在水平，其中生物標(biāo)志物選自：比-8、MMP9、SDC1、(XL18、SERPI肥1、CD44、VEGF-A、CA9和 ANG，其中生物標(biāo)志物的存在和/或存在水平指示出受試者中癌癥的存在與否。本發(fā)明 的另一個(gè)實(shí)施方式包括檢測(cè)表2至表10中列舉的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物，且生物標(biāo)志 物選自；UBC ;PPIA ;PGK1 ;GAP畑；BIRC5 ;TERT ;KRT20 ;CLU ;PLAU ;CALR ;ANG ;CA9 ;SCG3 ; ATF3 ;TLR2 ;AGT ;DMBT1 ;ERBB2 ;CTNNA1 ;ATM ;FBX09 ;CCNE2 ;NUSAP1 ;SMI2 ;化孤2 ;MMP12 ; ILIRAP ;ITGB日；DSC2 ;AP0E ;TMEM45A ;SYNGR1 ;MMP10 ;IL8 ;VEGFA ;CPA1 ;CCL18 ;CRH ; MCOLNl沈RPI肥IMMPl ;MMP9 ;FGF22 ;MXRA8 ;NRG3 ;沈MA3D ;PTX3 和 RABIA。本發(fā)明的另一個(gè) 實(shí)施方式包括檢測(cè)表4至表10中列舉的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記物。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方 式包括檢測(cè)如尿液中存在的蛋白質(zhì)或mRNA轉(zhuǎn)錄或尿液中存在的尿路上皮細(xì)胞的生物標(biāo)志 物成員。
[0012] 在一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括檢測(cè)尿液中存在的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物的水平 (例如，蛋白質(zhì)或mRNA轉(zhuǎn)錄的水平）或尿液中存在的尿路上皮細(xì)胞，其中生物標(biāo)志物選自 CCL18、CD44、VEGF-A。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括檢測(cè)尿液中存在的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志 物的水平（例如，蛋白質(zhì)或mRNA轉(zhuǎn)錄的水平）或尿液中存在的尿路上皮細(xì)胞，其中生物標(biāo) 志物選自 CA9、(XL18、MMP12、TMEM45A、MMP9、SEMA3D、ERBB2、CRH 和 MXRA8。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 參照附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行例示說(shuō)明，其中：
[0014] 圖1A是說(shuō)明膀脫癌的14基因分類(lèi)診斷準(zhǔn)確率的受試者工作特征（R0C)曲線(xiàn)；
[0015] 圖1B是癌癥和非癌癥組的14基因標(biāo)簽的表達(dá)分布；
[0016] 圖1C顯示了 P值和受試者工作特征曲線(xiàn)下的面積值（AUC)作為預(yù)測(cè)模型包含的 基因數(shù)目函數(shù)的變化圖；
[0017] 圖2A是例示膀脫癌的9基因分類(lèi)診斷準(zhǔn)確率的ROC曲線(xiàn)，其僅包括上調(diào) (up-regulated)的基因；
[0018] 圖2B是癌癥和非癌癥組的9基因標(biāo)簽的表達(dá)分布；
[0019] 圖2C顯示了 P值和AUC值相對(duì)于預(yù)測(cè)模型包含的基因數(shù)目的變化圖；
[0020] 圖3是用于推導(dǎo)最佳基因生物標(biāo)志物標(biāo)簽的示例性"留一法交叉驗(yàn)證"(L00CV)流 程圖；
[002。 圖4是16個(gè)內(nèi)源對(duì)照的應(yīng)用生物系統(tǒng)微流體卡片化qMan? (Micro Fluidic Card化qMan液）的低密度陣列（TLDA)分析圖；
[0022] 圖5是膀脫癌的檢測(cè)方法的實(shí)施方式流程圖；
[0023] 圖6是確定患者預(yù)后方法的流程圖；
[0024] 圖7是癌癥檢測(cè)方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[00巧]下面將參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更充分地說(shuō)明，其中本發(fā)明的實(shí)施方式通過(guò)說(shuō)明和 舉例的方式展示。然而，本發(fā)明可W體現(xiàn)為多種形式，且不應(yīng)解釋為限于在此闡述的實(shí)施方 式。相反，提供該些實(shí)施方式用來(lái)使本發(fā)明的公開(kāi)更徹底和完整，且將本發(fā)明的范圍充分地 傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)US2010/0184049 A1在此W引證的方式并 入本文。
[0026] 在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于診斷泌尿生殖器相關(guān)癌癥（包括膀脫癌）的 方法，其中該方法包括：
[0027] 確定生物樣品中的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物的存在或存在水平，其中生物標(biāo)志物選 自CA9 (碳酸酢酶I幻，MMP9 (基質(zhì)金屬蛋白酶9)，MMP10 (基質(zhì)金屬蛋白酶10)，PAI-1 (纖溶 酶原激活物抑制劑-1，也稱(chēng)絲氨酸蛋白酶抑制劑E1)，ANG (血管生成素），VEGF (血管內(nèi)皮生 長(zhǎng)因子），SYNDECAN (多配體聚糖），A1AT ( a -1抗膜蛋白酶原），IL-8 (白介素8)，AP0E (載 脂蛋白巧和CD44 ;
[0028] 其中與對(duì)照組相比，所述的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物的存在或所述的一個(gè)或多個(gè)生 物標(biāo)志物升高水平，表明了受試者具有泌尿生殖器相關(guān)的癌癥（包括膀脫癌）。
[0029] 在一實(shí)施方式中，本發(fā)明用于膀脫癌的診斷。
[0030] 在一實(shí)施方式中，生物樣品是尿液樣品。在某些實(shí)施方式中，生物樣品包括膀脫組 織和/或尿路上皮細(xì)胞中的活組織檢查。
[0031] 在一實(shí)施方式中，生物樣品來(lái)自受試者人。
[0032] 生物標(biāo)志物的存在或存在水平可W在核酸（如mRNA)和/或蛋白水平檢測(cè)。
[0033] 在一實(shí)施方式中，對(duì)照物是未患有癌癥的受試者所得樣品中存在的生物標(biāo)志物水 平。在一實(shí)施方式中，對(duì)照物是未患有膀脫癌或其他癌癥的受試者所得樣品中存在的生物 標(biāo)志物水平。在一實(shí)施方式中，對(duì)照物是具有良性膀脫腫瘤但不患有膀脫癌的受試者所得 樣品中存在的生物標(biāo)志物的水平。
[0034] 在一實(shí)施方式中，表2至表10 (具體是表4至表10)中列舉的一個(gè)生物標(biāo)志物或 生物標(biāo)志物的組合的存在或存在水平可用于泌尿生殖器相關(guān)癌癥（如膀脫癌）的診斷。
[0035] 本發(fā)明還提供了用于膀脫癌診斷的試劑盒，其包括檢測(cè)膀脫癌的一個(gè)或多個(gè)生物 標(biāo)志物的試劑。能夠檢測(cè)受試者生物樣品中的生物標(biāo)志物的試劑是與編碼生物標(biāo)志物的 生物標(biāo)志物多膚或核酸分子相互作用或結(jié)合的那些試劑。該些試劑（在此也稱(chēng)為結(jié)合劑） 的實(shí)例包括，但不限于，與蛋白質(zhì)/多膚生物標(biāo)志物結(jié)合的抗體，適體或其片段，蛋白質(zhì)/多 膚生物標(biāo)志