斑馬魚卵黃原蛋白間接競爭elisa試劑盒及其檢測方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境檢測領域，具體涉及一種斑馬魚卵黃原蛋白間接競爭ELISA試劑盒及其檢測方法與應用。
【背景技術】
[0002]隨著我國工業(yè)化程度和人民群眾生活水平的不斷提高，大量的工業(yè)廢水和生活污水排入到江河湖海中，造成了嚴重的水環(huán)境污染，不僅危害了野生生物的生存，也嚴重威脅我國人民的健康。雖然這些污染物在環(huán)境中的濃度很低，但是能夠干擾人和動物體內激素的合成、釋放、運輸、代謝，以及激素與受體的結合、功能的表達等一系列生物過程，從而擾亂人和動物內分泌系統(tǒng)、神經系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的機能，甚至對生物后代的生殖功能造成潛在影響，這一類化學物質統(tǒng)稱為內分泌擾亂化學物質。其中，環(huán)境雌激素對野生動物和人類生殖系統(tǒng)的影響受到了廣泛關注，已成為繼臭氧層、氣候變暖之后的第三大環(huán)境問題。環(huán)境雌激素種類繁多，包括多氯聯(lián)苯類、二惡英類、農藥類、雙酚類、金屬化合類、類固醇類等，其中塑化劑、殺蟲劑、避孕藥等被人們廣泛利用，它們的雌激素效應已引起了人們越來越多的關注。近年來，關于環(huán)境雌激素污染的報道越來越多。早在1985年，人們就在英國城市污水處理廠下游河流中捕獲到了具有雌雄兩性特征的斜齒鳊魚，我國武漢市東湖部分魚類出現(xiàn)了“雄魚雌化”現(xiàn)象，并且在長江、太湖、珠三角河流中都檢測到了雌激素類物質。環(huán)境雌激素除了造成魚蝦生長速度減慢、畸形等現(xiàn)象外，還能夠通過生物濃縮、生物積累和生物放大等途徑增大濃度，對生物和人類造成更大危害。因此，為了減少環(huán)境雌激素的危害，有必要建立化學物質的環(huán)境雌激素活性篩選體系，制備能夠快速檢測雌激素活性的試劑盒。
[0003]美國、歐盟和日本相繼建立起以魚類為模式生物的環(huán)境雌激素篩選評價體系，其中卵黃原蛋白(Vitellogenin, Vtg)作為重要的生物篩選指標，已經得到廣泛應用。魚類卵黃原蛋白是卵黃蛋白的前體，是一種大分子量的脂磷聚糖蛋白。通常，卵黃原蛋白只能在卵黃形成期的雌魚體內檢測到，但是雄魚和幼魚體內也含有卵黃原蛋白基因，在環(huán)境雌激素的誘導下，也能合成和分泌卵黃原蛋白。因此，卵黃原蛋白是環(huán)境雌激素篩選的特異性生物標志物，通過檢測雄魚體內卵黃原蛋白水平可以評價環(huán)境化合物的雌激素活性。
[0004]斑馬魚(Dan1ree1)，屬于福鰭亞綱(Actinopterygii)鯉科(Cyprinidae)短擔尼魚屬(Dan1)的一種硬骨魚，具備以下獨特優(yōu)點:(I)價格便宜，容易獲得，并且易于管理；(2)體型小，在較小空間內就可飼養(yǎng)大量斑馬魚(2L的燒杯中就可飼養(yǎng)10條左右)，便于毒理學試驗得到較大樣本量(3)斑馬魚對內分泌干擾物反應敏感，內分泌干擾物結構多樣，種類眾多，并且新的內分泌干擾物不斷出現(xiàn)，研宄表明斑馬魚可以作為評價內分泌干擾物的一個模型；(4)斑馬魚的雌雄魚在體形上較易分辨。雌魚體型通常較大，腹部較鼓脹；雄魚體型稍小，腹部平坦。仔細對照可以看出雌魚臀鰭的條紋是藍白相間的，而雄魚臀鰭是藍紋間夾著深黃色的條紋。目前，斑馬魚已成為一些生態(tài)毒理標準(如OE⑶和ISO標準)的推薦測試物種，被廣泛地應用于環(huán)境毒性試驗、環(huán)境危險度評價、環(huán)境污染物生物累積效應的研宄中。
[0005]研宄表明，環(huán)境激素暴露可導致雄性斑馬魚卵黃原蛋白生成、發(fā)育遲緩、雌性化、雌雄同體、產卵量減少、受精率降低以及性比失衡等變化，其中卵黃原蛋白可能是最敏感的指標。卵黃原蛋白的測定通常采用免疫學方法，其分離純化是制備抗體、定性定量檢測魚類卵黃原蛋白的基礎。研宄者多通過17 β-雌二醇(17 β-estrad1l，E2)腹腔注射的方法誘導卵黃原蛋白的產生，而斑馬魚體型小，注射困難，血液量少，取血困難，無法獲得足夠的血漿用于卵黃原蛋白的純化，這大大制約了斑馬魚卵黃原蛋白抗體的制備。
[0006]目前，研宄者對斑馬魚卵黃原蛋白的定性或定量檢測多采用鯉魚卵黃原蛋白抗體，由于卵黃原蛋白的蛋白質一級結構存在差異，且空間結構也會制約抗原的免疫原性，Watts等(2002)認為大量的轉譯后修飾會影響魚類卵黃原蛋白的三級結構，改變抗原決定簇的暴露情況，從而影響不同魚種卵黃原蛋白之間的種間交叉反應敏感性，使得魚類卵黃原蛋白抗體在用于其它魚類卵黃原蛋白檢測時受到限制。因此，為了準確反映環(huán)境雌激素的存在水平，對不同各類的魚類，需要制備其相應的卵黃原蛋白抗體。斑馬魚卵黃原蛋白純品已有國外公司出售，價格為1500元(5yg)，過于昂貴，并且如此小的劑量無法達到抗體制備要求?？梢?，建立斑馬魚卵黃原蛋白的純化方法，將成為制備抗體與建立斑馬魚卵黃原蛋白檢測的重要前提。
[0007]中國專利201210559592.1提供了一種利用卵黃脂磷蛋白抗體定性檢測魚類卵黃原蛋白的試劑盒，具有顯著的檢測效果，然而該試劑盒只能對斑馬魚卵黃原蛋白進行定性檢測。因此，有必要開發(fā)一種高效純化斑馬魚卵黃原蛋白的方法，并制備出具有較高特異性和敏感性的抗斑馬魚卵黃原蛋白抗體，建立準確定量斑馬魚卵黃原蛋白的ELISA檢測方法，從而準確評價化學物質對斑馬魚的環(huán)境雌激素效應。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種斑馬魚卵黃原蛋白間接競爭ELISA試劑盒及其檢測方法與應用，以滿足現(xiàn)有技術的上述要求。
[0009]一種檢測斑馬魚卵黃原蛋白的間接競爭ELISA試劑盒，包括一個盒體，盒體內有空白96孔酶標板I塊，封閉液、包被液、洗滌液、樣品稀釋液、顯色液、終止液和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗各I支，
[0010]其特征在于該盒體還裝有:斑馬魚卵黃脂磷蛋白純品I支，兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體I支。
[0011]所述的斑馬魚卵黃脂磷蛋白制備方法如下:將斑馬魚卵巢取出后稱重，加入3倍體積4°C預冷的PBS緩沖液(內含ImM PMSF，pH 7.4)混合，在冰浴條件下用玻璃勻漿器勻楽，8000g離心10分鐘，收集上清液；將上清液進行離子交換層析(DEAE-Sepharose FastFlow)，用分別含 0.07Μ、0.1Μ、0.2Μ和 1.0M NaCl 的 25mM Tris-HCl 緩沖液(pH 7.5)進行不連續(xù)洗脫。收集0.2M洗脫組分，裝入截留分子量為10kDa的Millipore超濾離心管，4°C、3000g離心30分鐘，加入Iml PBS緩沖液，收集截留在超濾離心管膜上的溶液；取Iml收集液加入S印hadex G-200層析柱，用25mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)洗脫，收集第一個主洗脫峰，即為斑馬魚卵黃脂磷蛋白。
[0012]所述的兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備方法如下:
[0013](I)斑馬魚卵黃原蛋白純品的制備:采用水體暴露17 β-雌二醇的方式誘導斑馬魚產生卵黃原蛋白，將斑馬魚置于2L的玻璃缸中，每缸放入10尾斑馬魚，17 β -雌二醇的暴露濃度為200 μ g/L，每天全部換水，并重新加入相應的17 β -雌二醇，早晚投喂飼料，水溫26°C ；7天后將斑馬魚放入50%的酒精中，待斑馬魚麻醉后，取出稱重，并加入3倍體積4°C預冷的PBS緩沖液(內含ImM PMSF, pH 7.5)，在冰浴條件下用玻璃勻漿器勻漿，4°C、8000g離心10分鐘，收集上清液；利用權利要求2的方法從上清液中純化獲得斑馬魚卵黃原蛋白；
[0014](2)兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備:取600 μ g純化的斑馬魚卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后對新西蘭大白兔進行背部皮下多點注射，每點注射0.1ml，兩周后再次加強免疫，免疫劑量為600 μ g/只，用弗氏不完全佐劑充分乳化后進行背部皮下注射，此后，每隔10天按以上方法進行加強免疫；第5次注射后于第5天從心臟取血，6000r/min離心20分鐘，收集上清，獲得了兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗血清；抗體的純化分為以下幾步，上樣前向多克隆抗血清中加入1/3的對照陰性樣品(雄魚勻漿液)，低溫振蕩2h，4°C過夜，次日離心取上清；向上清中加入等體積的PBS緩沖液；在冰浴條件下加入等體積飽和硫酸錢，0°c震蕩2h后，低溫離心(8000rpm, 15min)，棄上清，沉淀用1ml PBS緩沖液溶解；用0.45微米孔徑的濾膜過濾后，上Hitrap Protein G柱，以PBS緩沖液洗脫10個柱體積后，用0.1M甘氨酸(pH 2.7)洗脫，即獲得兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體。
[0015]上述檢測斑馬魚卵黃原蛋白的間接競爭ELISA試劑盒在環(huán)境雌激素類物質篩選與內分泌擾亂化學物質研宄中的應用，包括:上述檢測斑馬魚卵黃原蛋白的間接競爭ELISA試劑盒在水體