專利名稱：超高敏酶促化學發(fā)光液配方的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是一種依賴過氧化物酶催化的化學發(fā)光液配方。適合于在各類以過氧化物酶為標記的酶標檢測技術中應用。
核酸的體外重組技術及抗原抗體特異反應技術是現(xiàn)代生命科學的兩個重要標志。其應用范圍已擴展到基礎研究，臨床檢驗，法醫(yī)鑒定，乃至農(nóng)牧業(yè)，環(huán)境科學等諸多領域。而在這些應用中，首先要對核酸及抗原抗體進行檢測。以往大多采用放射性同位素標記技術。這一技術雖然具有靈敏度高的特點，但同時存在諸多不足如某些放射性同位素由于半衰期短，不利于儲存和運輸;更由于放射性物質(zhì)對工作人員的健康及環(huán)境造成了一定危脅，因而需要特殊的防護和廢物處理設備及嚴格的管理。因此，只限于在少數(shù)實驗室中使用。大大限制了它的廣泛應用。因此，人們一直在尋求一種非同位素的標記技術。其中應用最廣，發(fā)展最快的是酶標技術。它具有簡單，快速，方便，安全的特點。但目前采用的酶標顯色技術其靈敏度較低，即使采用生物素-親合素系統(tǒng)加以放大，也無法與同位素標記技術相比(E.L.SheldetalProc.Natl.Acad.Sci.USA83∶90851986)。
八十年代中后期，出現(xiàn)了一類新型的利用酶促化學發(fā)光反應的酶標檢測技術。它不但具有快速，安全的特點;同時可以直接利用感光膠片自顯影技術，無需檢測儀器及電源，方便了基層野外工作以及檢測結(jié)果的復制和永久保存;而且突出的優(yōu)點是具有極高的靈敏度，可以完全達到同位素技術的水平。該項技術的關鍵所在是化學發(fā)光液的配方。目前主要有兩大類發(fā)光液體系一類是依賴堿性磷酸酶催化的發(fā)光體系，它使用了國外最新專利物質(zhì)AMPPD(I.Brostein & P.McGrath Nature 338(13)∶599 1989)，用于檢測乙型肝炎基因片段時，最低檢測限可達4.39×104考貝(I.Bronstein et al Analytical Biochemistry 180∶95 1989)，說明已達到同位素標記技術的水平。但由于該體系中的關鍵物質(zhì)AMPPD價格昂貴，每毫克數(shù)十美元，且國內(nèi)尚無生產(chǎn);而堿性磷酸酶的穩(wěn)定性也較差。因此大規(guī)模推廣尚存在困難。
另一體系是依賴過氧化物酶的發(fā)光體系。該體系以魯米諾(Luminol)及其衍生物為發(fā)光劑;H2O2等構(gòu)成氧化劑;另外，由6-羥基苯并噻唑及其衍生物(Kricka L.J.et al Eur Patent Pub 118454 1983)或含對位取代基的酚類(Carter T.J.N.et al Eur Patent Pub 87959 1982)作為發(fā)光增強劑;以及緩沖體系組成。它成本較低，魯米諾每克僅幾美元，且國內(nèi)已能生產(chǎn);同時由于通常使用的辣根過氧化物酶穩(wěn)定性較好，因此具有較大的推廣價值。但遺憾的是其靈敏度仍不夠理想，即使采用昂貴的高感光度一次成像膠片(ASA 20，000)及生物素-親合素系統(tǒng)加以放大，其最低檢測限也僅能達到1pg的pBR322質(zhì)粒DNA(J.A.Matthews et al Analytical Biochemistry 151∶205 1985)，相當于5×105基因考貝，無法與堿性磷酸酶發(fā)光體系及同位素標記技術相比。另外，該發(fā)光體系的發(fā)光液配制后經(jīng)數(shù)月存放，其發(fā)光靈敏度會逐漸下降;同時本底發(fā)光(沒有酶存在時的自行發(fā)光)逐漸上升。這些都對該技術的推廣應用及商品化造成了障礙。
因此本發(fā)明的目的，就是試圖通過改進依賴過氧化物酶的化學發(fā)光液的配方使其靈敏度進一步提高;同時消除隨放置時間延長而出現(xiàn)的本底發(fā)光上升的現(xiàn)象。
經(jīng)過長期，反復多次試驗，我們發(fā)現(xiàn)如果在現(xiàn)有發(fā)光液配方(J.A.MatthewsetalAnalyticalBiochemistry151∶2051985)即1.25mM魯米諾2.7mM H2O20.136mM對-碘苯酚100mMTris-HCl緩沖液，pH8.6的基礎上，再加入一組復合助劑;其構(gòu)成和在配方中的終濃度是
乙醇0.1%～5%環(huán)己二胺四乙酸(CDTA)1mM～10mMNaCl0.1M～0.5M同時將其中的氧化劑由單純的H2O2改為以H2O2及NaBO3的等克分子比混合物作為復合氧化劑，終濃度為3mM～6mM，則該體系的發(fā)光靈敏度大大提高;并消除了長期放置條件下本底發(fā)光上升的現(xiàn)象，產(chǎn)生了預料不到的技術效果，該配方稱為“超高敏酶促化學發(fā)光液配方”。
附圖
(1)是改進前后的兩種發(fā)光液配方在不同濃度的辣根過氧化物酶(HRP)作用下，以化學發(fā)光儀測得其光電流變化的曲線。圖中以辣根過氧化物酶(HRP)的克分子濃度(×10-12)為橫坐標，以光電流對數(shù)值(logmV)為縱坐標。其中實線A代表超高敏酶促化學發(fā)光液配方，虛線B代表改進前的配方。可看出，超高敏酶促化學發(fā)光液配方的光電流強度在各個酶濃度下均高于改進前，最高可超出15倍以上。
附圖(2)是改進前后的兩種發(fā)光液配方經(jīng)放置數(shù)月后再測定其不同酶濃度條件下光電流變化的曲線。從中發(fā)現(xiàn)，改進前的發(fā)光液B由于本底發(fā)光明顯升高，實際上已無法使用;而超高敏酶促化學發(fā)光液配方A的本底發(fā)光依然極低，且保持了較高的靈敏度。
為進一步驗證上述結(jié)果，我們使用普通X光膠片進行了改進前后兩種配方的發(fā)光液對固相支持物上的辣根過氧化物酶自顯影效果的比較實驗，步驟如下1硝酸纖維濾膜在0.15MNaCl;50mMTris-HClPH8.6的緩沖液中浸泡10分鐘以上。
2取出上述濾膜，用吸水紙吸干水分。將不同濃度的辣根過氧化物酶(以生理鹽水配制)分別等體積點到濾膜上，待其自然晾干。
3將濾膜置于透明塑料袋中，按每cm2濾膜0.125ml的比例加入發(fā)光液。趕走氣泡，立即封口。
4在暗室條件下將上述塑料袋置于X光膠片盒中，并覆蓋一張未感光的X光膠片，壓緊盒蓋。
5暴光30分鐘左右，取出膠片顯定影。
實驗結(jié)果如下(×10-18克分子) (mm) (mm)2,5005.012.07503.511.02503.06.0752.04.0250.03.07.50.02.02.50.00.0改進配方前的發(fā)光液僅能檢測出75×10-18克分子的辣根過氧化物酶，而超高敏酶促化學發(fā)光液配方可檢測出7.5×10-18克分子的辣根過氧化物酶。因此該實驗證明在X光膠片自顯影中，超高敏酶促化學發(fā)光液配方的發(fā)光靈敏度比改進前提高了一個數(shù)量級即10倍。
而后我們進一步使用本室自行研制的辣根過氧化物酶標記物(HRP-PEI)以直接酶標-化學發(fā)光法進行斑點雜交實驗，以檢測SP64質(zhì)粒DNA。步驟如下1用加樣器分別將不同濃度的SP64質(zhì)粒DNA溶液點于尼龍膜上，用熱風機小心吹干。
2在一平皿內(nèi)置一迭濾紙，加入0.4NNaOH使濾紙浸透。將上述尼龍膜含DNA面朝上貼到濾紙上，持續(xù)1～5分鐘。
3以5×SSC溶液洗尼龍膜2次，每次5分鐘。
4將尼龍膜置于塑料袋中，按每cm2膜0.25ml的比例加入雜交液，42℃預雜交2小時以上。
注雜交液配方
6M尿素0.5MNaCl0.1%SDS5×Denhart4mMEDTA6%PEG6，0005%封膜劑100mg/l鮭魚精子DNA50mMTris-HClpH8.0緩沖液5按每ml雜交液20ng的比例取SP64質(zhì)粒DNA，以5mM磷酸緩沖液(pH6.8)稀釋為10mg/l;100℃煮沸5～10分鐘，立即置0℃5分鐘。
6在上述SP64質(zhì)粒DNA溶液中，每mgDNA加入50mg酶標物(HRP-PEI)，另加相當于SP64質(zhì)粒DNA溶液1/3體積的5%戊二醛;37℃10～30分鐘。
7將步驟6獲得的液體加入步驟4中的塑料袋;趕走氣泡，42℃雜交過夜。
8取出尼龍膜置于洗液中，42℃洗二次，每次30分鐘。
注洗液配方6M尿素0.4%SDS0.5×SSC9以2×SSC溶液洗二次，每次5分鐘。
10用超高敏酶促化學發(fā)光液配方和X光膠片進行發(fā)光自顯影。
實驗結(jié)果如下
SP64質(zhì)粒DNA(pg)顯影斑點直徑(mm)1，0009.53008.01006.0303.2103.032.812.50.32.00.12.00.00.0該實驗檢測出了0.1pg的SP64質(zhì)粒DNA，相當于6×104基因考貝，因此該實驗結(jié)果證明超高敏酶促化學發(fā)光液配方在檢測核酸分子雜交時的靈敏度高于現(xiàn)有文獻報道的水平(J.A.Matthews et al Analytical Biochemistry 151∶205 1985);而與堿性磷酸酶發(fā)光體系的靈敏度接近(I.Bronstein et al Analytical Biochemistry 180∶95 1989)。
綜合上述實驗，可以認為改進后的超高敏酶促化學發(fā)光液配方，其發(fā)光靈敏度比原有技術提高一個數(shù)量級，已接近堿性磷酸酶發(fā)光體系及同位素標記技術的水平;同時還消除了長期放置條件下本底發(fā)光升高的現(xiàn)象，提高了穩(wěn)定性;結(jié)合該技術具有使用簡單，安全的特點;因此將在生物學研究，臨床檢驗，法醫(yī)鑒定，農(nóng)牧業(yè)及環(huán)境科學等諸多領域內(nèi)對核酸及抗原抗體等生物大分子的檢測方面產(chǎn)生廣泛的應用效益。
下面實施例僅用于說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。
實施例一-酶標-化學發(fā)光自顯影法-斑點雜交實驗。
實驗步驟如下
1用點膜器將待測標本的核酸提取物(包括DNA，RNA)點于硝酸纖維膜上，80℃烤2小時。
2硝酸纖維膜移入塑料袋，每cm2膜加入0.25ml雜交液;42℃2小時。
注雜交液配方6M尿素0.1%SDS0.5MNaCl5×Denhart100mg/l鮭魚精子DNA50mMTris-HCl緩沖液pH8.03每ml雜交液中加入10ng酶標探針，42℃雜交過夜。
4取出硝酸纖維膜，42℃洗膜二次，每次20分鐘。
注洗膜液配方6M尿素0.4%SDS0.5×SSC52×SSC溶液洗二次，每次5分鐘。
6化學發(fā)光自顯影。
該方法可用于檢測特定基因片段。適合于基因表達的研究;遺傳性疾病及某些感染性疾病的診斷;尤其是某些嚴重遺傳性疾病的產(chǎn)前診斷和那些難以找到血清抗原的嚴重傳染性疾病如愛滋病，丙型肝炎等的診斷。其靈敏度至少比常規(guī)顯色反應高10倍，與同位素標記技術相當。
實施例二-酶標-化學發(fā)光自顯影法-索氏吸印(Southern-Blot)雜交實驗實驗步驟如下1將標本DNA以限制性內(nèi)切酶(如TaqⅠ，BglⅡ)消化，行瓊脂糖電泳。
2經(jīng)索氏吸印將電泳帶吸附到硝酸纖維膜上。
380℃烤膜2小時。
4將膜移入塑料袋，每cm2膜加入0.25ml雜交液，42°2小時。
注雜交液配方6M尿素0.1%SDS0.5MNaCl5×Denhart100mg/1鮭魚精子DNA50mMTris-HCl緩沖液pH8.05每ml雜交液加入10ng酶標探針，42℃過夜。
6取出硝酸纖維膜，42℃洗二次，每次20分鐘。
注洗膜液配方6M尿素0.4%SDS0.5×SSC72×SSC溶液洗膜二次，每次5分鐘。
8化學發(fā)光自顯影。
該方法用于檢測基因片段長度多態(tài)性。適用于基因突變的研究;遺傳性疾病家族的基因連鎖分析;以及法醫(yī)鑒定中的DNA指紋圖技術(該技術可在親子鑒定，及謀殺案，強奸案的偵破中發(fā)揮以往任何技術手段都無法起到的作用。是現(xiàn)代法醫(yī)學的重要標志)。由于上述方法取代了放射性同位素，因此便于普及推廣。
實施例三-酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)-“一步法”-化學發(fā)光自顯影實驗實驗步驟如下1取純化抗體溶液(20mg/l)加入酶標板，每孔0.15ml，4℃過夜。
2洗板3～4次。
注洗液配方0.15MNaCl0.5‰吐溫-203每孔加入0.1ml標本血清及0.05ml酶標抗體(1∶100稀釋)，43℃1小時。
4洗板3～4次(洗液配方同步驟2)。
5化學發(fā)光自顯影。
該方法可檢測血清中的某種特異抗原。適用于大多數(shù)感染性疾病的臨床診斷。由于采用了化學發(fā)光自顯影技術，使其靈敏度大大提高。實際測定乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的實驗證實其靈敏度比目前臨床所用方法至少高10倍。而且操作簡單，快速;無需測定儀器及電源。
權(quán)利要求
1.一種超高敏酶促化學發(fā)光液配方。由發(fā)光劑；氧化劑；增強劑；緩沖液及助劑組成。本發(fā)明的特征是在現(xiàn)有技術基礎上，它使用了復合氧化劑和復合助劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，復合氧化劑由H2O2及NaBO3的等克分子比混合物組成，配方中的終濃度是3mM～6mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，復合助劑的構(gòu)成和配方中的終濃度是乙醇 0.1%～5%環(huán)己二胺四乙酸(CDTA) 1mM～10mMNaCl 0.1M～0.5M
全文摘要
超高敏酶促化學發(fā)光液配方，是一種適合于在各類以過氧化物酶為標記物的酶標檢測技術中應用的發(fā)光體系。該發(fā)明由發(fā)光劑，復合氧化劑，增強劑，緩沖液及一組復合助劑構(gòu)成。具有發(fā)光靈敏度高，穩(wěn)定性好，成本低的特點。可廣泛用于生物學研究，臨床檢驗，法醫(yī)鑒定，農(nóng)牧業(yè)及環(huán)境科學中對核酸及抗原抗體等生物大分子的檢測。
文檔編號G01N33/535GK1072264SQ9111062
公開日1993年5月19日 申請日期1991年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1991年11月14日
發(fā)明者楊曉林, 王申五 申請人:北京醫(yī)科大學人民醫(yī)院