氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及使用方法，屬于化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。該檢測(cè)試劑盒采用直接競(jìng)爭(zhēng)法，試劑盒包括包被有氯霉素抗原的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，氯霉素酶標(biāo)抗體，化學(xué)發(fā)光液和洗滌液。該試劑盒的使用方法包括如下步驟：（1）待測(cè)樣品的前處理；（2）順序加入氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品、加入氯霉素酶標(biāo)抗體，最后加入化學(xué)發(fā)光液通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行氯霉素的定量檢測(cè)；（3）結(jié)果處理與分析。本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒靈敏度高、穩(wěn)定性好，適合大量樣品的篩查，具有重要的實(shí)際應(yīng)用推廣意義。
【專利說(shuō)明】氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及使用方法。

【背景技術(shù)】
[0002]氯霉素(Chloramphenicol，簡(jiǎn)稱CAP)是一種有效的廣譜抗生素，1947年由Ehrlich J等人從鏈絲菌的培養(yǎng)液中提取而得到的抗生素，其化學(xué)名稱為D-蘇式-對(duì)硝基苯基-1- 二氯乙?；?1-3丙二醇，是白色的針狀或片狀晶體，味極苦。微溶于水，易溶于甲醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。在酸性和中性溶液中穩(wěn)定，遇堿易失效。常用于畜禽養(yǎng)殖中各種傳染性疾病的治療。
[0003]目前氯霉素被廣泛用于家禽、家畜、蜜蜂及水產(chǎn)品中各種傳染性疾病的治療，但氯霉素易在動(dòng)物體內(nèi)蓄積，且毒性較大，在畜禽體內(nèi)蓄積會(huì)嚴(yán)重?fù)p害其生殖系統(tǒng)。同時(shí)，氯霉素可危害人體造血系統(tǒng)，易引發(fā)人的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥；可引起中毒性精神病、視神經(jīng)炎、角膜癱痕、皮疹等，對(duì)新生兒、早產(chǎn)兒、老年人以及肝腎功能不全的病人影響更大，對(duì)人類健康構(gòu)成巨大的潛在威脅。
[0004]由于氯霉素存在嚴(yán)重的毒副作用，許多國(guó)家和地區(qū)均規(guī)定氯霉素最高殘留限量為“不得檢出”。歐盟各成員國(guó)自1994年以來(lái)已全面廢止氯霉素的使用，并將氯霉素列為“不設(shè)定最高殘留限量”的禁用藥物，即氯霉素的最高殘留限量為“不得檢出”(2377/90/EC)。美國(guó)僅允許將氯霉素用于非食用動(dòng)物。FDA規(guī)定氯霉素的檢出限為0.3 ng/mL。2000年我國(guó)農(nóng)業(yè)部將氯霉素從《中國(guó)獸藥典》中刪除。2002年12月農(nóng)業(yè)部發(fā)布235號(hào)公告《動(dòng)物性食品獸藥最高殘留限量》，規(guī)定所有動(dòng)物性食品及所有可食性組織中不得檢出氯霉素及其鹽，并在出口的日常檢測(cè)中，將其列為必檢項(xiàng)目。
[0005]目前氯霉素殘留已成為擴(kuò)大動(dòng)物性食品國(guó)際貿(mào)易的主要障礙之一，引起了世界上許多國(guó)家和國(guó)際組織的高度重視，近年來(lái)，我國(guó)出口水產(chǎn)品、蜂蜜等動(dòng)物性食品仍多次被進(jìn)口國(guó)檢出氯霉素殘留超標(biāo)。因此需建立一種高度靈敏、低檢測(cè)限的檢測(cè)方法。
[0006]氯霉素殘留檢測(cè)方法通常采用微生物法、色譜法和免疫分析法等。微生物法雖然操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低，在基層大規(guī)模篩選工作中有較大的應(yīng)用價(jià)值，但其靈敏度低，檢測(cè)周期長(zhǎng)，易受組織中其它抗生素的影響。采用色譜法進(jìn)行檢測(cè)，成本高，耗時(shí)長(zhǎng)，要達(dá)到較高的靈敏度，通常需要加大樣品稱取量，而氯霉素樣品前處理多采用有機(jī)試劑萃取，蒸干后復(fù)溶的方式，加大樣品量意味著萃取劑用量相應(yīng)提高，從而使前處理操作更為繁瑣，消耗時(shí)間延長(zhǎng)。盡管能達(dá)到大部分檢測(cè)要求，但色譜法無(wú)法應(yīng)對(duì)大量樣品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求，因而通常作為確證方法。
[0007]ELISA方法雖具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏的特點(diǎn)，也適宜大規(guī)模的篩查工作，但其靈敏度有一定的制約。因此，建立一種經(jīng)濟(jì)、可靠、特異、敏感、快速有效的檢測(cè)方法有很大的實(shí)際意義和應(yīng)用前景?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)是化學(xué)發(fā)光和免疫分析結(jié)合的產(chǎn)物，將發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記到抗原或抗體上，與抗體或抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)后，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度確定被測(cè)抗體或抗原的含量。具有高通量檢測(cè)、靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、分析速度快、價(jià)廉經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，是免疫分析的重要發(fā)展方向，并被逐漸引入食品安全領(lǐng)域有毒有害物質(zhì)的檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供上述氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法。
[0010]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括包被有氯霉素抗原的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，氯霉素酶標(biāo)抗體，化學(xué)發(fā)光液和洗滌液；所述的氯霉素抗原為氯霉素與卵清蛋白(OVA)的偶聯(lián)物，氯霉素抗原的包被濃度為0.25 mg/L ;所述的包被液為0.02 MpH8.0的Tris-HCl緩沖溶液。
[0011]優(yōu)選地，所述的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板優(yōu)選為96孔可拆不透明白色發(fā)光板。
[0012]所述的氯霉素酶標(biāo)抗體為實(shí)驗(yàn)室前期制備；所述的酶標(biāo)抗體優(yōu)選為辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的氯霉素抗體。其原濃度為lmg/mL，使用時(shí)優(yōu)選為0.01 mo I/L PBST稀釋6000倍。
[0013]優(yōu)選地，封閉液優(yōu)選為取0.1g BSA (牛血清白蛋白)、5g甘氨酸溶于10mL PBS(0.01mol/L ρΗ7.4)溶液得到。
[0014]優(yōu)選地，所述的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為lmg/mL，使用時(shí)用0.01mol/L PBST (配方為NaH2PO4.12H20 2.9g、NaCl 8.5g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、Tween-20 0.5mL，定容至 1L)將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成濃度為0.0,0.01,0.03,0.1,0.3、1、3μ g/L的一系列氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0015]優(yōu)選地，所述化學(xué)發(fā)光液由A液和B液組成，A液優(yōu)選為將20mg對(duì)碘苯酚、8mg魯米諾、1.21g Tris溶于10mL去離子水,用鹽酸調(diào)pH至8.4得到；B液優(yōu)選為將體積分?jǐn)?shù)
0.40%H202、1.21gTris溶于10mL去離子水，用鹽酸調(diào)pH至7.0得到；臨用時(shí)將A液和B液按體積比1:1的比例混合。
[0016]優(yōu)選地，所述的洗滌液優(yōu)選為20倍濃縮洗滌液，20倍濃縮洗滌液是含有體積分?jǐn)?shù)
0.5% Tween20的pH7.4 0.4mol/L的磷酸鹽緩沖液，使用時(shí)用去離子水稀釋成I倍洗滌液。
[0017]所述的氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒最大檢測(cè)范圍為0.058?0.466ng/mL,靈敏度 0.16 ng/mL,檢出限 0.025 ng/mL。
[0018]上述氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括如下步驟:
(I)將試劑盒置于15?35°C平衡30 min以上。
[0019](2)取出化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，往標(biāo)準(zhǔn)孔中加入不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品孔中加入待測(cè)樣品，然后每孔加入氯霉素酶標(biāo)抗體，蓋上蓋板膜振搖混勻，孵育。
[0020](3)吸除板孔中的反應(yīng)液，加入洗滌液洗滌，將酶標(biāo)板拍干。
[0021](4)每孔加入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，I?2min后用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定各孔的發(fā)光值RLU。
[0022](5)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算與分析:抑制率(％) =B/B0X 100 (%)，式中:B—不同濃度氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液孔(或樣品孔)的發(fā)光值A(chǔ)tl-O濃度氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值；以抑制率為縱坐標(biāo)，氯霉素濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定樣品中氯霉素的含量。
[0023]優(yōu)選地，步驟(2)中所述的待測(cè)樣品為雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等組織樣品。
[0024]優(yōu)選地，以上組織在進(jìn)行檢測(cè)之前，需經(jīng)過(guò)以下預(yù)處理:
用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本，稱3±0.05g樣本于離心管中，加入6mL乙酸乙酯，振蕩lOmin，室溫4000r/min以上,離心1min ;取出4mL上層液體在氮?dú)饬?0_6(TC水浴中干燥；加入ImL正己烷溶解干燥的殘留物，再加ImL稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩lmin，室溫4000r/min以上離心lOmin。取50 KL下層相用于分析。
[0025]優(yōu)選的，所述的氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法，包含如下步驟:
(I)將試劑盒置于室溫平衡30 min以上，用0.0l mo I/L PBST將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成濃度分別為0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 μ g/L的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0026](2)取出化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，在標(biāo)準(zhǔn)孔加入50 μ L不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品孔加入50 μ L待測(cè)樣品，然后每孔加入50 μ L稀釋好的氯霉素的酶標(biāo)抗體，蓋上蓋板膜在微量振蕩器上振搖10 min后,置于37°C孵育30 min。
[0027](3)吸除板孔中的反應(yīng)液，各孔加入洗滌液約300 μ L，靜置20秒左右，除去其中液體，如此共洗5次，最后一次將板拍干；也可用自動(dòng)洗板機(jī)洗板5次，洗完后將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體。
[0028](4)每孔加入10yL A液與B液等體積混合后的化學(xué)發(fā)光液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，I?2min后用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定各孔的發(fā)光值RLU，保存數(shù)據(jù)。
[0029](5)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算與分析:抑制率(％) =B/B0X 100 (%)，式中:B—不同濃度氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液孔(或樣品孔)的發(fā)光值A(chǔ)tl-O濃度氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值；以抑制率為縱坐標(biāo)，氯霉素濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定樣品中氯霉素的含量。
[0030]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
(O環(huán)保經(jīng)濟(jì):與現(xiàn)有的檢測(cè)氯霉素的ELISA試劑盒相比，不需要再使用具有腐蝕性的硫酸、以及大部分有毒或?yàn)橹掳┪镔|(zhì)的底物，更加環(huán)保經(jīng)濟(jì)。
[0031](2)高靈敏度、高特異性:與現(xiàn)有的檢測(cè)氯霉素的ELISA試劑盒相比，克服了試劑盒檢測(cè)過(guò)程中易受到內(nèi)源性酶干擾、吸光度的檢測(cè)也易受到多種外在因素的影響的弊端，本發(fā)明采用高特異性、高親合力的抗體，檢測(cè)氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶免疫試劑盒靈敏度更高，可達(dá)到 0.16ng/mL。
[0032](3)快速、準(zhǔn)確:反應(yīng)時(shí)間短，前處理方法簡(jiǎn)單快速、符合試劑盒的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)要求。
[0033]基于以上優(yōu)點(diǎn)本試劑盒非常適用于氯霉素殘留的痕量分析與批量檢測(cè)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0034](4)由于氯霉素結(jié)構(gòu)的特異性，其包被抗原在酶標(biāo)板中的包被濃度比較大才可以實(shí)現(xiàn)對(duì)氯霉素的靈敏性檢測(cè)，但是，包被濃度過(guò)高的話，常規(guī)的包被液(將1.69g碳酸鈉和
2.95g碳酸氫鈉溶于IL雙蒸水中得到。)很難將0.25 mg/L的氯霉素高效率的包被在酶標(biāo)板上。經(jīng)過(guò)大量創(chuàng)造性的摸索，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)只有包被液為0.02 M pH8.0的Tris-HCl緩沖溶液，才能實(shí)現(xiàn)高效率的包被。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1是氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0037]實(shí)施例中所使用試劑如下:
包被液為0.02 M pH8.0的Tris-HCl緩沖溶液。如果用常規(guī)的包被液(將1.69g碳酸鈉和2.95g碳酸氫鈉溶于IL雙蒸水中得到。)包被氯霉素的話，很難將0.25 mg/L的氯霉素高效率的包被在酶標(biāo)板上。
[0038]20倍濃縮洗滌液:體積分?jǐn)?shù)0.5% Tween20的ρΗ7.4 0.4mol/L的磷酸鹽緩沖液，使用時(shí)用去離子水稀釋成I倍。
[0039]封閉液:取0.1g BSA (牛血清白蛋白)、5g甘氨酸溶于10mL PBS溶液(0.0lmol/L pH7.4)得到。
[0040]氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液:用色譜級(jí)甲醇將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成lmg/mL備用；再用0.01mol/L PBST稀釋為濃度分別為0.0,0.01,0.03,0.1、0.3、1、3 μ g/L的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，
4°C保存。
[0041]化學(xué)發(fā)光液:化學(xué)發(fā)光液由A液和B液組成，A液為將20mg對(duì)碘苯酚、8mg魯米諾、1.21gTris溶于10mL去離子水，用鹽酸調(diào)pH至8.4得到；B液為將體積分?jǐn)?shù)0.40%H202、
1.21gTris溶于10mL去離子水，用鹽酸調(diào)pH至7.0得到；使用時(shí)將A液和B液按體積比I: I的比例混合。
[0042]氯霉素單克隆抗體(2mg/mL):實(shí)驗(yàn)室前期制備。
[0043]辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的氯霉素抗體(lmg/mL):實(shí)驗(yàn)室前期制備。
[0044]實(shí)施例1氯霉素單克隆抗體、氯霉素酶標(biāo)抗體、包被抗原的制備 (I)包被抗原的制備
取氯霉素半抗原80 μ mo I用ImL DMF溶解，然后加入等當(dāng)量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室溫下攪拌反應(yīng)lh。取反應(yīng)液400 UL緩慢加入到6 mL pH 9.0，0.2mol/ L的碳酸鹽緩沖溶液溶解的20 mg/mL的OVA溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)2 h后，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2次，然后用PBS透析3 d后，取出分裝，于-20°C保存。
[0045](2)氯霉素單克隆抗體的制備
用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。融合7?8d后,取上清液用ELISA法進(jìn)行篩選，OD450 ^ 1.0的孔判定為陽(yáng)性孔。并同時(shí)觀察100 μ g/L氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的抑制情況。用有限稀釋法對(duì)該孔中的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行多次克隆化，直至所有細(xì)胞生長(zhǎng)孔的上清均為陽(yáng)性為止。將雜交瘤細(xì)胞注入Balb/c小鼠腹腔中并收集腹水。采用Protein-G親和層析柱對(duì)小鼠腹水進(jìn)行純化，并用紫外分光光度法測(cè)定抗體濃度。
[0046](3)氯霉素酶標(biāo)抗體的制備:
將HRP 25mg溶于含1.25%戊二醛的pH 6.8的0.0lM PBS 0.5mL中，室溫中避光靜置過(guò)夜。將反應(yīng)后的酶溶液置于生理鹽水中透析Id以除去小分子化合物戊二醛等，并定容至5mL ;將抗體12.5mg用生理鹽水稀釋到5mL，在攪拌下逐滴加入酶溶液中；加IM pH 9.5碳酸鹽緩沖液0.25mL，繼續(xù)攪拌3h，加0.2M賴氨酸0.25mL，混勻，置室溫2h;在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C冰箱I h ；3000 rpm離心30min,棄上清,沉淀物用飽和硫酸銨洗滌2次，最后溶于ρΗ7.4 0.02Μ PBS中；0.02Μ pH7.4 PBS透析，去除NH4+離子，1000 rpm離心30min去除沉淀，上清液加入等體積甘油后分裝冷藏以用于下一步的分析和測(cè)定。
[0047]實(shí)施例2化學(xué)發(fā)光酶免疫方法的建立 (I)包被抗原與抗體濃度的優(yōu)選
I)將包被抗原按 1.25 mg/L、0.625mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L、0.125 mg/L 用包被液(0.02 M pH8.0的Tris-HCl緩沖溶液)稀釋并縱向包被不透明白色發(fā)光板，100 μ L/孔，370C 24 h，用洗液洗滌2次，在吸水紙上拍干。
[0048]2)加入配制好的封閉液150 UL /孔進(jìn)行封閉，37°C過(guò)夜，甩干后放入烘箱烘干。
[0049]3)加入50 μ L /孔用0.01 mol/L PBST稀釋的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液
4)加入50 μ L /孔用0.01 mol/L PBST系列稀釋的氯霉素酶標(biāo)抗體(1: 4000、1:5000、1: 6000、1: 7000、1: 8000), 37 °C 60min，洗板 5 次，在吸水紙上拍干。
[0050]5)加入現(xiàn)配的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，100 UL /孔，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定發(fā)光值。以發(fā)光值隨包被抗原濃度有明顯梯度變化的包被抗原濃度和抗體稀釋度為最佳濃度進(jìn)行特異性測(cè)定。得到包被抗原最佳濃度為0.25 mg/L，酶標(biāo)抗體(濃度I mg/mL)稀釋倍數(shù)為1: 6000。
[0051](2)抗體靈敏度的測(cè)定
以包被抗原濃度為0.25 mg/L，氯霉素酶標(biāo)抗體(濃度lmg/mL)稀釋倍數(shù)為1:6000，進(jìn)行抗體靈敏度的測(cè)定。
[0052]I)取96孔不透明白色發(fā)光板，將包被抗原用包被液稀釋至0.25 mg/L，每孔內(nèi)加入100 μ L，37°C過(guò)夜，用洗滌液洗滌2次，在吸水紙上拍干。
[0053]2)加入封閉液150 μ L /孔進(jìn)行封閉，37°C過(guò)夜，甩干后放入烘箱烘干。
[0054]3)加稀釋倍數(shù)為1: 6000的氯霉素酶標(biāo)抗體50 μ L/孔與不同濃度的氯霉素溶液50 4 17孔于相應(yīng)孔內(nèi)，371: 40 min，洗板5次，在吸水紙上拍干。
[0055]4)加入現(xiàn)配的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，100 μ L/孔，測(cè)定發(fā)光值。
[0056]檢測(cè)結(jié)果以抑制率計(jì)算，抑制率(GzO=BZiBtlX 100 (%)，B是不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液競(jìng)爭(zhēng)的發(fā)光值，Btl是不加標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光值。計(jì)算50%抑制率時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度即為氯霉素酶標(biāo)抗體的靈敏度，為0.16ng/mL。
[0057]實(shí)施例3氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒 (I)試劑盒的組成
I)包被有氯霉素抗原的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板:酶標(biāo)板為96孔可拆不透明白色發(fā)光板，已包被氯霉素抗原和封閉液；氯霉素抗原為氯霉素與OVA的偶聯(lián)物，包被濃度為0.25 mg/L。
[0058]酶標(biāo)板的制備:取96孔可拆不透明白色發(fā)光板，包被抗原用包被液稀釋至0.25mg/L，每孔內(nèi)加入100 μ L，37°C過(guò)夜，傾去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌2次，在吸水紙上拍干。然后每孔加入封閉液15(^匕371:孵育過(guò)夜，傾去孔內(nèi)液體，置于371:烘箱中烘干后用鋁箔袋真空密封4 °C保存。
[0059]2)氯霉素系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度 0.0,0.01,0.03,0.1,0.3、1、3μ g/L)。
[0060]3)辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的氯霉素單克隆抗體lmg/mL，其工作濃度為1: 6000。
[0061]4)化學(xué)發(fā)光液:由A液和B液組成。
[0062]5) 20倍濃縮洗滌液。
[0063](2)試劑分裝:將各試劑測(cè)定合格后無(wú)菌分裝，已稀釋好的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品I mL/瓶，已稀釋的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的氯霉素抗體7mL/瓶，A液7mL/瓶，B液7mL/瓶，20倍濃縮洗滌液50mL/瓶。分裝后貼標(biāo)簽，注明批號(hào)和有效期，4°C保存。
[0064](3)試劑盒的組裝:分別將步驟(I)的包被有氯霉素抗原的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板I塊和氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的氯霉素抗體、A液、B液、20倍濃縮洗滌液各I瓶及使用說(shuō)明書I份置試劑盒內(nèi)指定位置，試劑盒檢驗(yàn)合格后封裝，4°C保存。
[0065]實(shí)施例4氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法
(I)樣品前處理
用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本，稱3±0.05g樣本于離心管中，加入6mL乙酸乙酯，振蕩lOmin，室溫4000r/min以上,離心1min ;取出4mL上層液體在氮?dú)饬?0_6(TC水浴中干燥；加入ImL正己烷溶解干燥的殘留物，再加ImL稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩lmin，室溫4000r/min以上離心lOmin。取50 KL下層相用于分析。
[0066](2)試劑盒的檢測(cè)方法
I)取出試劑盒，置于室溫(20?24°C)平衡30 min以上，取出化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，用0.01mol/L PBST將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成一系列不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.0,0.01,0.03、
0.1、0.3、1、3 μ g/L)。
[0067]2)在標(biāo)準(zhǔn)孔加入50 μ L不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品孔加入50 μ L待測(cè)樣品，然后每孔加入50μ L用0.01 mol/L PBST稀釋好的氯霉素酶標(biāo)抗體，蓋上蓋板膜在微量振蕩器上振搖10 min后，置于37°C孵育30 min。
[0068]3)吸除板孔中的反應(yīng)液，各孔加入洗滌液約300 μ L，靜置20秒左右，除去其中液體，如此共洗5次，最后一次將板拍干；也可用自動(dòng)洗板機(jī)洗板5次。洗完后將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每輪洗板拍打3次)以保證完全除去孔中的液體。
[0069]4)每孔加入100 μ L底物緩沖液與底物液等體積混合后的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，I?2min后用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定各孔的發(fā)光值RLU，保存數(shù)據(jù)。
[0070](3)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算與分析抑制率(％) =B/BqX100 (%)
式中:B—不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液孔(或樣品孔)的發(fā)光值A(chǔ)tl-O濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值。
[0071]以抑制率為縱坐標(biāo)，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定樣品中氯霉素的含量。
[0072]實(shí)施例5試劑盒精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) (O氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的重復(fù)性試驗(yàn)
從3批按照實(shí)施例3中的方法制備的酶標(biāo)板中，各抽出20個(gè)微孔，按照實(shí)施例4中試劑盒的檢測(cè)方法測(cè)定0.1 μ g/L氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的發(fā)光值，重復(fù)20次，計(jì)算變異系數(shù)CV%，結(jié)果見(jiàn)表I。
[0073]表I氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)性試驗(yàn)

【權(quán)利要求】
1.一種氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒包括包被有氯霉素抗原的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品、氯霉素酶標(biāo)抗體、化學(xué)發(fā)光液和洗滌液；所述的氯霉素抗原為氯霉素與OVA的偶聯(lián)物，所述的氯霉素抗原的包被濃度為0.25mg/L ;所述的包被液為0.02 M ρΗ8.0的Tris-HCl緩沖溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板為96孔可拆不透明白色發(fā)光板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為lmg/mL，使用時(shí)用0.01 mo I/L PBST將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成濃度為0.0、0.01,0.03,0.1、0.3、1、3 μ g/L的一系列氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的氯霉素酶標(biāo)抗體為辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的氯霉素單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的氯霉素酶標(biāo)抗體的原濃度為lmg/mL，使用時(shí)用0.01 mo I/L PBST稀釋6000倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光液由A液和B液組成，A液為將20mg對(duì)碘苯酚、8mg魯米諾、1.21gTris溶于10mL去離子水，用鹽酸調(diào)pH至8.4得到；B液為將體積分?jǐn)?shù)0.40% H202、1.21gTris溶于10mL去離子水，用鹽酸調(diào)pH至7.0得到；使用時(shí)將底物液和底物緩沖液按體積比1:1的比例混八口 ο
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的洗滌液為20倍濃縮洗滌液，為含有體積濃度0.5% Tween20的pH7.4 0.4mol/L的磷酸鹽緩沖液，使用時(shí)用去離子水稀釋成I倍洗滌液。
8.權(quán)利要求1?7任一項(xiàng)所述的氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于包含如下步驟: (1)將試劑盒置于15?35°C平衡30min以上； (2)取出化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，往標(biāo)準(zhǔn)孔中加入不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品孔中加入待測(cè)樣品，然后每孔加入氯霉素酶標(biāo)抗體，蓋上蓋板膜振搖混勻，孵育； (3)吸除板孔中的反應(yīng)液，加入洗滌液洗滌，將酶標(biāo)板拍干； (4)每孔加入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，I?2min后用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定各孔的發(fā)光值RLU ； (5)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算與分析，從而確定樣品中氯霉素的含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟(2)中所述的待測(cè)樣品為雞肉或肝臟。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述雞肉和肝臟在檢測(cè)之前，要先經(jīng)過(guò)以下預(yù)處理:用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本，稱3±0.05g樣本于離心管中，加入6mL乙酸乙酯,振蕩1min,室溫4000r/min以上,離心1min ;取出4mL上層液體在氮?dú)饬?0-60°C水浴中干燥；加入I mL正己烷溶解干燥的殘留物，再加ImL稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩Imin,室溫4000r/min以上離心1min,取50 μ?下層相用于分析。
【文檔編號(hào)】G01N33/535GK104165990SQ201410356798
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】曾道平, 路俊山, 盧秋鴻, 陳蓮英 申請(qǐng)人:廣州萬(wàn)聯(lián)生物科技有限公司