本發(fā)明涉及食用油鑒別，尤其涉及一種cas蛋白在食用油鑒別中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、食用油是日常飲食的必需品，它能夠?yàn)闄C(jī)體提供熱量和脂肪酸，同時(shí)也能夠促進(jìn)脂溶性維生素的吸收。將廉價(jià)的植物油摻入到高價(jià)位的植物油中，這些行為對(duì)人們的健康造成了威脅。摻入的植物油通常在外觀、物理性狀上難以被辨別出來(lái)，常規(guī)的感官、物理、化學(xué)等檢測(cè)手段已不能滿足檢測(cè)需求，而氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)雖能實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的多組分測(cè)定，但存在操作繁瑣、儀器昂貴、應(yīng)用范圍有限等缺點(diǎn)。因此需要一種低成本、簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)方法對(duì)食用油是否摻假進(jìn)行快速的鑒定。

2、crispr-cas系統(tǒng)最初來(lái)源于細(xì)菌和古菌中的一種天然免疫機(jī)制，用于抵御外來(lái)遺傳物質(zhì)，如質(zhì)粒和噬菌體的入侵。近年來(lái)，crispr-cas系統(tǒng)作為一種革命性的基因編輯技術(shù)，在生物科學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。該技術(shù)以其簡(jiǎn)便、高效的特點(diǎn)，為基因編輯、基因調(diào)控和核酸檢測(cè)等領(lǐng)域提供了強(qiáng)大的工具。該系統(tǒng)通過(guò)利用cas核酸酶與crrna的引導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定dna序列的識(shí)別和切割，具有極高的靶點(diǎn)特異性。

3、crispr-cas檢測(cè)技術(shù)作為一種新興的檢測(cè)手段，在病毒檢測(cè)、疾病診斷、金屬離子檢測(cè)、真菌毒素檢測(cè)等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。但是由于cas12a變體仍面臨切割活性不足，限制了其在實(shí)際應(yīng)用中的推廣。因此需要發(fā)現(xiàn)或改良現(xiàn)有的cas12a蛋白，找到切割活性更好、更方便使用的新型cas12a蛋白酶。將crispr-cas檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于鑒定食用油是否摻假。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種cas蛋白在食用油鑒別中的應(yīng)用，本發(fā)明的cas蛋白具有較好的切割活性，對(duì)于不同食用油中含有的小分子構(gòu)象敏感；小分子構(gòu)象的細(xì)小差異可以通過(guò)cas蛋白的酶活信號(hào)體現(xiàn)出來(lái)，每種食用油具有與之相對(duì)應(yīng)的熒光值，以熒光值作為標(biāo)準(zhǔn)，用于鑒別各種不同類別的食用油，解決目前市場(chǎng)上的食用油摻假問(wèn)題。

2、本發(fā)明提供了一種cas蛋白食用油鑒別中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括：將cas蛋白的溶液、靶標(biāo)核酸的溶液、向?qū)na(crrna)的溶液、核酸探針的溶液、無(wú)核酸酶水和核糖核酸酶抑制劑分散在緩沖液中，再加入待鑒別食用油，孵育，進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，將檢測(cè)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行聚類分析。

3、進(jìn)一步的，所述cas蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

4、進(jìn)一步的，所述核酸探針的序列為ttaatt，核酸探針的n端修飾有熒光基團(tuán)，核酸探針的c端修飾有猝滅基團(tuán)。

5、進(jìn)一步的，所述熒光基團(tuán)為5’-fam。

6、進(jìn)一步的，所述猝滅基團(tuán)為3’-bhq1。

7、進(jìn)一步的，所述靶標(biāo)核酸具有與向?qū)na可結(jié)合的片段。

8、進(jìn)一步的，所述靶標(biāo)核酸具有與cas蛋白特異性結(jié)合的片段。

9、進(jìn)一步的，所述靶標(biāo)核酸、cas蛋白和向?qū)na結(jié)合時(shí)，cas蛋白被激活，能切割核酸探針中的單鏈dna。

10、進(jìn)一步的，所述靶標(biāo)核酸的序列如seq?id?no.2所示。

11、進(jìn)一步的，所述向?qū)na的序列如seq?id?no.3所示。

12、進(jìn)一步的，以體積計(jì)，cas蛋白的溶液、向?qū)na的溶液、核酸探針的溶液、無(wú)核酸酶水、緩沖液、靶標(biāo)核酸的溶液和核糖核酸酶抑制劑的比為2:2:1:22:2:1:1。

13、進(jìn)一步的，所述cas蛋白的溶液的摩爾濃度為20nm。

14、進(jìn)一步的，所述cas蛋白的溶液的制備方法具體為：將cas蛋白溶解分散于無(wú)核酸酶水中。

15、進(jìn)一步的，所述靶標(biāo)核酸的溶液的摩爾濃度為125nm。

16、進(jìn)一步的，所述靶標(biāo)核酸的溶液的制備方法具體為：將靶標(biāo)核酸溶解分散于無(wú)核酸酶水中。

17、進(jìn)一步的，所述向?qū)na的溶液的摩爾濃度為20nm。

18、進(jìn)一步的，所述向?qū)na的溶液的制備方法具體為：將向?qū)na溶解分散于無(wú)核酸酶水中。

19、進(jìn)一步的，所述核酸探針的的溶液摩爾濃度為200nm。

20、進(jìn)一步的，所述向?qū)na的溶液的制備方法具體為：將向?qū)na溶解分散于無(wú)核酸酶水中。

21、進(jìn)一步的，所述核糖核酸酶抑制劑的濃度為40u/μl。

22、進(jìn)一步的，在本發(fā)明中的核糖核酸酶抑制劑購(gòu)買于生工生物工程(上海)股份有限公司，產(chǎn)品的cas號(hào)為b600478。

23、進(jìn)一步的，所述緩沖液的制備方法：10mm?tris-hcl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)，10mm氯化鎂，10mm氯化鈉，100g/ml牛血清白蛋白溶液(bsa)。

24、進(jìn)一步的，所述牛血清蛋白溶液的制備方法具體為將牛血清蛋白溶液分散于去離子水中。

25、進(jìn)一步的，所述孵育的溫度為36℃-38℃，孵育的時(shí)間為14min-16min。

26、進(jìn)一步的，所述熒光強(qiáng)度檢測(cè)采用酶標(biāo)儀，激發(fā)波長(zhǎng)為480nm-500nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510nm-540nm。

27、進(jìn)一步的，所述食用油包括橄欖油、菜籽油、葵花籽油、山茶油、大豆油、玉米油、亞麻籽油、山核桃油、紅棕櫚油、棕櫚油、花生油、芝麻油、魚油中的一種或多種。

28、進(jìn)一步的，所述食用油包括橄欖油、菜籽油、葵花籽油、山茶油、大豆油、玉米油、亞麻籽油、山核桃油、紅棕櫚油、棕櫚油、芝麻油中的一種或多種。

29、本發(fā)明實(shí)施例具有以下技術(shù)效果：

30、1.本發(fā)明中靶標(biāo)核酸、crrna和cas蛋白形成三元復(fù)合體時(shí)，cas蛋白的切割活性就會(huì)被激活，核酸探針上的熒光基團(tuán)就會(huì)被cas蛋白切割，從而獲得熒光強(qiáng)度；在本發(fā)明中，cas蛋白由于具有較高的活性，因此對(duì)不同食用油中含有的小分子構(gòu)象很敏感，小分子構(gòu)象會(huì)讓cas蛋白的活性發(fā)生改變，所以小分子構(gòu)象的細(xì)小差異可以通過(guò)cas蛋白的酶活信號(hào)體現(xiàn)出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)每種食用油具有與之相對(duì)應(yīng)的熒光值，以熒光值作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)食用油中是否摻假進(jìn)行鑒定。

31、2.本發(fā)明獲得的cas蛋白具有較高的切割活性，能成功應(yīng)用于食用油的鑒別中。

技術(shù)特征：

1.一種cas蛋白在食用油鑒別中的應(yīng)用，其特征在于，將cas蛋白的溶液、靶標(biāo)核酸的溶液、向?qū)na的溶液、核酸探針的溶液、無(wú)核酸酶水和核糖核酸酶抑制劑分散在緩沖液中，再加入待鑒別食用油，孵育，進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，將檢測(cè)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行聚類分析；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述核酸探針的序列為ttaatt，核酸探針的n端修飾有熒光基團(tuán)，核酸探針的c端修飾有猝滅基團(tuán)；所述熒光基團(tuán)為5’-fam；所述猝滅基團(tuán)為3’-bhq1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述靶標(biāo)核酸具有與向?qū)na可結(jié)合的片段；

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述靶標(biāo)核酸的序列如seq?id?no.2所示；

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，以體積計(jì)，cas蛋白的溶液、向?qū)na的溶液、核酸探針的溶液、無(wú)核酸酶水、緩沖液、靶標(biāo)核酸的溶液和核糖核酸酶抑制劑的比為2:2:1:22:2:1:1；

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述孵育的溫度為36℃-38℃，孵育的時(shí)間為14min-16min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述熒光強(qiáng)度檢測(cè)采用酶標(biāo)儀，激發(fā)波長(zhǎng)為480nm-500nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510nm-540nm。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述食用油包括橄欖油、菜籽油、葵花籽油、山茶油、大豆油、玉米油、亞麻籽油、山核桃油、紅棕櫚油、棕櫚油、花生油、芝麻油、魚油中的一種或多種。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及食用油鑒別技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種Cas蛋白在食用油鑒別中的應(yīng)用，所述Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明的Cas蛋白具有較好的切割活性，對(duì)于不同食用油中含有的小分子構(gòu)象敏感；小分子構(gòu)象的細(xì)小差異可以通過(guò)cas蛋白的酶活信號(hào)體現(xiàn)出來(lái)，以熒光值作為標(biāo)準(zhǔn)，用于鑒別各種不同類別的食用油，解決目前市場(chǎng)上的食用油摻假問(wèn)題。

技術(shù)研發(fā)人員：吳麗娜,黃和,徐詩(shī)琦,沈偉健,段章群
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京師范大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6