本發(fā)明屬于番荔枝花粉檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢定番荔枝花粉生活力的方法。

背景技術(shù)：

1、番荔枝又稱(chēng)釋迦，為番荔枝科（annonaceae）番荔枝屬（ annona）多年生半落葉性小喬木，在我國(guó)熱帶及亞熱帶地區(qū)（福建、廣東、廣西、云南、海南等地）擁有超過(guò)400年栽培歷史，近年來(lái)隨著香蕉、芒果、甘蔗等傳統(tǒng)熱區(qū)作物/果樹(shù)種植發(fā)展趨于飽和，番荔枝逐年受到追捧，成為新的增長(zhǎng)點(diǎn)。然而其相關(guān)栽培技術(shù)在我國(guó)仍處于初級(jí)階段，理論研究與實(shí)際生產(chǎn)種植仍然存在很多待優(yōu)化的方面。介于此，對(duì)番荔枝生產(chǎn)及科研中一些關(guān)鍵問(wèn)題開(kāi)展針對(duì)性的探索意義重大。

2、人工授粉是是指用人工將植物花粉傳送到柱頭上完成受精的技術(shù)措施，在生產(chǎn)上它是提升番荔枝品種座果率和果實(shí)品質(zhì)的重要手段，同時(shí)對(duì)于番荔枝種質(zhì)資源創(chuàng)新而言，其也是新種質(zhì)創(chuàng)制的重要實(shí)現(xiàn)技術(shù)之一。現(xiàn)有的番荔枝授粉的方法主要有以下兩種：

3、1.自然授粉（風(fēng)媒蟲(chóng)媒等）：利用空氣流動(dòng)及昆蟲(chóng)等自然行為完成授粉。優(yōu)點(diǎn)：前期省工；缺點(diǎn)：針對(duì)生產(chǎn)主栽品種ap番荔枝、鳳梨釋迦等，產(chǎn)量極低，果形不端正，果實(shí)成熟時(shí)期分散，采收不便，低投入低產(chǎn)出。

4、2.人工授粉方法：手工收集花粉，對(duì)可授狀態(tài)的雌蕊進(jìn)行人工授粉操作。具體為：

5、分批次修剪（按照市場(chǎng)需求及果實(shí)發(fā)育期進(jìn)行計(jì)算），待群體臨開(kāi)花前雌花進(jìn)行可授狀態(tài)檢查（環(huán)境溫濕度是否適合，柱頭是否發(fā)育正常，是否濕潤(rùn)有粘液覆蓋），開(kāi)花前約4-6h進(jìn)行授粉樹(shù)集中臨成熟花朵的收集，陰涼處批量分散存放，待雄蕊花藥自然爆開(kāi)后，收集花粉

6、對(duì)開(kāi)花前一日處于雌蕊成熟狀態(tài)的花朵進(jìn)行涂抹授粉。優(yōu)點(diǎn)：可根據(jù)市場(chǎng)批量集中授粉，集中優(yōu)化管理，同步化果實(shí)成熟期，果實(shí)端正，品質(zhì)高，投入產(chǎn)出比較前兩種方式高。缺點(diǎn)：花粉收集需要每個(gè)授粉日提前進(jìn)行，需要耗費(fèi)人工。且花粉存在較明顯的花粉活力波動(dòng)，甚至出現(xiàn)花粉敗育，導(dǎo)致授粉效果不佳費(fèi)時(shí)費(fèi)工的問(wèn)題產(chǎn)生。

7、上述比較可以看出，對(duì)番荔枝花人工授粉是目前最佳生產(chǎn)解決方案。對(duì)于人工授粉而言，充分的授粉和座果率高度依賴(lài)于足夠的花粉活力，對(duì)于儲(chǔ)存?zhèn)溆没蛘吲R成熟階段的花粉的精確活力判斷無(wú)論對(duì)番荔枝雜交試驗(yàn)科學(xué)研究的順利開(kāi)展或者生產(chǎn)上人工授粉均具有重要意義。

8、多數(shù)番荔枝存在修剪后固定天數(shù)抽稍成花的特性，因此在合適的季節(jié)人工差異化修剪可對(duì)不同番荔枝花期進(jìn)行同步化調(diào)控。但僅此無(wú)法獲得理想授粉結(jié)果。雌雄蕊的互作在臨開(kāi)花時(shí)候是復(fù)雜的，番荔枝花是完全花（每朵花包括功能完整的雌蕊群與雄蕊群），存在明確的雌性期與雄性期，大部分品種為雌蕊先熟，開(kāi)花過(guò)程包括花瓣開(kāi)裂、快速?gòu)堥_(kāi)（雌蕊成熟期），柱頭粘液消失、雌蕊群褐化（雌蕊衰老、可授性喪失），花藥爆裂、花粉釋放（雄蕊成熟期），這樣的特性注定了花粉與柱頭最適授粉時(shí)期存在天然時(shí)間差，無(wú)法同步。主栽品種ap番荔枝和鳳梨釋迦的花粉一般在下午或傍晚成熟，晚間8-11點(diǎn)為生產(chǎn)上的授粉時(shí)間。

9、花粉活力主要取決于環(huán)境溫度、濕度與花粉狀態(tài)（水分含量、成熟度、內(nèi)容物）以及上述諸因素的綜合。番荔枝科植物花粉由于花粉含水量高，對(duì)干燥敏感，其開(kāi)裂后不能長(zhǎng)時(shí)間存活。花期溫度濕度對(duì)發(fā)育進(jìn)程及雌雄蕊活力影響十分明顯，干旱高溫會(huì)導(dǎo)致花發(fā)育異常，花粉敗育，而過(guò)高濕度亦能影響花藥開(kāi)裂散粉。因此對(duì)于花粉活力的判斷和快速，對(duì)于番荔枝人工授粉效率的提高具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種快速檢定番荔枝花粉生活力及發(fā)育階段的染色方法，不僅能對(duì)花粉進(jìn)行活力檢測(cè)，亦能進(jìn)一步對(duì)其發(fā)育時(shí)期及細(xì)胞核動(dòng)態(tài)進(jìn)行示蹤，為生產(chǎn)上花粉活力檢測(cè)及開(kāi)展花粉萌發(fā)過(guò)程理論研究提供方便。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

3、一種用于番荔枝花粉染色的混合液，以混合液計(jì)，包括以下質(zhì)量濃度的組分：蔗糖6-16%、椰子乳（ccm）0.1-1%、硝酸鈣（ca(no3?)?2·4h2o）250μg/ml、硫酸鎂（mgso?4·7h2o）200μg/ml、硝酸鉀（kno3）100μg/ml、硼酸（h3bo3）100μg/ml、peg8000?5%，熒光素二乙酸酯（fda）20-50μg/ml、碘化丙啶（pi）3-10μg/ml。

4、進(jìn)一步，所述的用于番荔枝花粉染色的混合液，以混合液計(jì)，包括以下質(zhì)量濃度的組分：蔗糖6-16%、椰子乳0.1-1%、硝酸鈣?250μg/ml、硫酸鎂?200μg/ml、硝酸鉀100μg/ml、硼酸100μg/ml、peg8000?5%，熒光素二乙酸酯20-50μg/ml、碘化丙啶3-5μg/ml。

5、進(jìn)一步，所述的用于番荔枝花粉染色的混合液，以混合液計(jì)，包括以下質(zhì)量濃度的組分：蔗糖6-16%、椰子乳0.1-1%、硝酸鈣250μg/ml、硫酸鎂?200μg/ml、硝酸鉀100μg/ml、硼酸100μg/ml、peg8000?5%，熒光素二乙酸酯20μg/ml、碘化丙啶3μg/ml。

6、以上所述的一種用于番荔枝花粉染色的混合液的制備方法，包括以下步驟：

7、（1）取配方量的熒光素二乙酸酯先使用少量丙酮溶解完全，以剛好將溶質(zhì)全部溶解為上限，備用；

8、（2）取配方量的碘化丙啶使用去離子水溶解；按照配比添加蔗糖、椰子乳、硝酸鈣、硫酸鎂、硝酸鉀、硼酸和peg8000，加入去離子水溶解蔗糖、椰子乳、硝酸鈣、硫酸鎂、硝酸鉀、硼酸、peg8000，直至體積約為總體積的95%，加入步驟（1）已經(jīng)溶解的熒光素二乙酸酯，統(tǒng)一定容即可。

9、一種快速檢定番荔枝花粉生活力的方法，包括以下步驟：

10、（1）雄蕊預(yù)處理

11、將花藥分散備用；

12、（2）試劑混合孵育

13、將待測(cè)花粉轉(zhuǎn)移至硅膠染色板樣品槽內(nèi)，滴加以上所述的混合液，移液槍反復(fù)吸吐以充分反應(yīng)，避光靜置30s后滴加至載玻片，加蓋蓋玻片；

14、（3）熒光鏡檢

15、寬場(chǎng)熒光顯微鏡：選擇bf、wg與wb通道分別作明場(chǎng)、紅色熒光與綠色熒光觀察與圖像采集，明場(chǎng)用于花粉外觀、聚合情況檢測(cè)，紅色熒光用于花粉細(xì)胞核數(shù)量檢測(cè)、綠色熒光用于花粉活力檢測(cè)；

16、激光共聚焦顯微鏡：激發(fā)光選擇488nm激光束，檢測(cè)光波長(zhǎng)520nm處收集熒光素二乙酸酯的綠色熒光、647nm處收集碘化丙啶的紅色熒光；同時(shí)補(bǔ)充收集esid的明場(chǎng)信號(hào)觀察花粉外觀；對(duì)上述三個(gè)信號(hào)進(jìn)行圖像采集；

17、（4）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

18、對(duì)獲得的不同通道圖像使用軟件進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì)，計(jì)算花粉活力。

19、進(jìn)一步，所述的步驟（1）中，如果是臨開(kāi)花花粉爆出（爆粉）的狀態(tài)，或者是貯存的花藥，直接取出花藥即可下一步處理；如果是更早的未離體的花藥，需要使用鑷子將花藥打散，以便從花上分離下來(lái)。

20、進(jìn)一步，所述的步驟（2）中，每10枚花藥滴加9-20μl以上所述的混合液。

21、進(jìn)一步，所述的步驟（2）中，移液槍反復(fù)吸吐5次；避光靜置30s；蓋玻片為6mm直徑圓形蓋玻片。

22、進(jìn)一步，所述的步驟（4），所述的花粉活力的計(jì)算方法為：花粉活力=產(chǎn)生綠色熒光的花粉數(shù)目/花粉數(shù)目*100%，和/或花粉活力=花粉內(nèi)不被著色的花粉數(shù)目/花粉數(shù)目*100%以綜合判定）

23、進(jìn)一步，所述的步驟（4）采用imagej軟件進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì)。

24、本發(fā)明的有益效果：

25、本發(fā)明所述的混合液及檢測(cè)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

26、采用本發(fā)明所述的混合液進(jìn)行花粉活力檢測(cè)，比傳統(tǒng)的fda-pi雙染色擁有更持久的熒光壽命，花粉一定時(shí)間內(nèi)維持形態(tài)不爆裂，最長(zhǎng)可以維持10h，能持續(xù)觀察到體外萌發(fā)過(guò)程，利于對(duì)花粉活力的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

27、混合液用量每次可以低至10μl（試劑濃度f(wàn)da?20μl/mg及pi?3.0μl/mg）熒光試劑用量大幅度降低，毒性減低，總消耗量相對(duì)于常規(guī)的100μl每次可以大大降低。

28、除了能佐證fda對(duì)細(xì)胞活力的鑒定結(jié)果，亦能夠部分充當(dāng)細(xì)胞核染色的角色，本混合液對(duì)于細(xì)胞核的染色能力可部分取代dapi。對(duì)于活力低的樣品直接染色wg通道或647nm觀察統(tǒng)計(jì)細(xì)胞核情況，對(duì)于高活力樣品僅需要增加一步額外的滅活處理亦能數(shù)出花粉細(xì)胞核數(shù)目，幫助花粉發(fā)育階段的確定，與花粉活力檢測(cè)結(jié)果可以相互印證，便于綜合判斷花粉活力。

29、相較清水分散外觀檢定、ttc、碘碘化鉀常規(guī)染色鑒定而言，結(jié)果更可靠。

30、染色速度更快，沒(méi)有離心等過(guò)程，對(duì)于牛心番荔枝、黃龍番荔枝、非洲驕傲、鳳梨釋迦、泰國(guó)番荔枝等均可以實(shí)現(xiàn)染色，操作更加簡(jiǎn)便。