本發(fā)明涉及毒性分析，尤其涉及一種通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法。

背景技術(shù)：

1、合成孕激素廣泛應用于各個領域中，包括醫(yī)學上的激素治療和畜牧業(yè)中增加肉類的產(chǎn)量。然而，隨著近年來孕激素生產(chǎn)和消費的增加，未被使用的孕激素可能會隨著糞便排入生活廢水中，一些孕激素也無法被污水處理廠處理并有效地去除。

2、孕二烯酮、左炔諾孕酮和去甲睪酮被認為是在水生環(huán)境中最受關(guān)注的三種孕激素，其中孕二烯酮在人體中的活性最高，經(jīng)常被用作激素療法或避孕藥，且消費普遍。

3、斑馬魚是常見的模式生物，其喂養(yǎng)和維持的費用便宜，易于室內(nèi)大規(guī)模繁殖。斑馬魚作為小型魚具有個體小、易獲取、易飼養(yǎng)、生命周期相對較短的特點，是相較于青蛙、小白鼠等更加理想的受試生物。目前，斑馬魚已成為國內(nèi)外熱門研究工具，尤其是毒理學領域的應用，如利用斑馬魚探究孕激素的毒性效應研究。

4、現(xiàn)有技術(shù)中，如專利技術(shù)文獻cn109900884a公開了一種基于代謝組學的短鏈氯化石蠟斑馬魚胚胎毒性效應的研究方法，該發(fā)明中首先通過短鏈氯化石蠟對斑馬魚胚胎的暴露，利用液相色譜-高分辨率質(zhì)譜法對胚胎體內(nèi)代謝產(chǎn)物進行分析，再結(jié)合統(tǒng)計學處理及代謝通路富集分析反映短鏈氯化石蠟對斑馬魚胚胎代謝通路的影響。該發(fā)明基于代謝組學對斑馬魚的進行研究，成本低、易于操作，但僅從分子水平上分析環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對斑馬魚的影響較為片面。

5、因此，根據(jù)上述中的相關(guān)技術(shù)，亟需研發(fā)一種通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中分析環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對斑馬魚的影響較為片面的問題。

2、基于上述目的，本發(fā)明提供了一種通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法。

3、一種通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法，包括以下步驟：

4、步驟s1.選取40只體型相近的成年雌性斑馬魚置于水箱中飼養(yǎng)14天，均分為四份，再分別轉(zhuǎn)移到魚缸a、魚缸b、魚缸c和魚缸d中，分別飼養(yǎng)60天，得到斑馬魚a組、斑馬魚b組、斑馬魚c組和斑馬魚d組；

5、步驟s2.分別從斑馬魚a組、斑馬魚b組、斑馬魚c組和斑馬魚d組中隨機選擇一條雌性斑馬魚單獨放入水箱中，觀察10-20min并使用斑馬魚跟蹤系統(tǒng)記錄其運動行為，斑馬魚的平均速度，總移動距離與底部總停留時間；

6、步驟s3.分別從斑馬魚a組、斑馬魚b組、斑馬魚c組和斑馬魚d組中隨機選取一條雌性斑馬魚，冷凍麻醉后取魚尾血液，第一次離心后取得血漿樣本后，第二次離心得到斑馬魚a組上清液、斑馬魚b組上清液、斑馬魚c組上清液和斑馬魚d組上清液，再分別測量各組斑馬魚上清液中乙酰膽堿酯酶、甲狀腺激素t3、甲狀腺激素t4和促甲狀腺激素的含量；

7、步驟s4.分別從斑馬魚a組、斑馬魚b組、斑馬魚c組和斑馬魚d組中隨機選取一條斑馬魚并取其腸道置于波恩固定液中，經(jīng)脫水、透明和浸蠟處理后，再經(jīng)染色、封片和鏡檢拍照后，統(tǒng)計各組斑馬魚的腸絨毛長度；

8、步驟s5.分別從斑馬魚a組、斑馬魚b組、斑馬魚c組和斑馬魚d組中隨機選取一條成年雌性斑馬魚與兩條未暴露的成年雄性斑馬魚置于繁殖池隔板兩邊，先置于黑暗條件下10-12h，再移除隔板，用光照刺激雌性斑馬魚產(chǎn)卵，1.5-2h后收集受精卵并置于e3培養(yǎng)基中孵化144-148h，記錄各組斑馬魚的孵化率、存活率與畸形率。

9、優(yōu)選的，步驟s1中所述成年雌性斑馬魚的月齡為三個月，水箱中飼養(yǎng)條件為每天用豐年蝦幼蟲喂養(yǎng)兩次，每次喂食5分鐘后清除殘余食物；

10、所述魚缸a中孕二烯酮濃度為0ng/l；

11、所述魚缸b中孕二烯酮濃度為5ng/l；

12、所述魚缸c中孕二烯酮濃度為50ng/l；

13、所述魚缸d中孕二烯酮濃度為500ng/l。

14、優(yōu)選的，步驟s1中所述魚缸中水溫設置為25-27℃，ph為6.9-7.5，溶解氧為6-15mg/l，光暗周期比為12.5-14：10-11.5，光照強度為54-324lux。

15、優(yōu)選的，步驟s1中所述魚缸中飼養(yǎng)條件為每天喂食2次脫殼豐年蝦卵，每隔24h換半水并添加孕二烯酮使孕二烯酮在水中濃度保持一致。

16、優(yōu)選的，步驟s3中所述第一次離心轉(zhuǎn)速設置為2000-2500rpm，離心時間為15-20min，離心溫度為2-5℃。

17、優(yōu)選的，步驟s3中所述第二次離心轉(zhuǎn)速設置為1500-2000rpm，離心時間為10-15min，離心溫度為2-5℃。

18、優(yōu)選的，步驟s4中所述波恩固定液由72-75ml質(zhì)量濃度為1.22％苦味酸飽和液、22-25ml質(zhì)量濃度為40％甲醛和3-5ml冰醋酸混合得到。

19、優(yōu)選的，步驟s5中所述光照強度為100-240lux，e3培養(yǎng)基由氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、亞甲基藍和去離子水混合得到。

20、優(yōu)選的，步驟s5中所述孵化時溫度設置為27.5-28.5℃，ph為6.9-7.5，溶解氧為6-15mg/l，光暗周期比為12.5-14：10-11.5。

21、本發(fā)明的有益效果：

22、本發(fā)明提供了一種通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法，本發(fā)明通過分子層面、細胞層面和個體形態(tài)分析了孕二烯酮對斑馬魚的影響，具體分析了經(jīng)孕二烯酮處理后斑馬魚的運動行為、繁殖、激素含量和組織切片。研究結(jié)果表明，孕二烯酮損害了斑馬魚的生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，并且對甲狀腺功能產(chǎn)生了影響，進一步表明，孕二烯酮暴露介質(zhì)不僅對斑馬魚的生長發(fā)育有潛在的負面影響，還可能對它們的長期生存和繁殖能力造成嚴重威脅。

23、因此，本發(fā)明為進一步理解孕二烯酮等環(huán)境激素對水生生物的潛在風險提供了重要的科學依據(jù)。此外，還揭示了斑馬魚作為一種模式生物在環(huán)境毒理學研究中的應用價值。通過對其行為、生理和組織結(jié)構(gòu)的細致觀察，我們能夠更深入地了解環(huán)境污染物對生物體的影響機制。對于制定環(huán)境保護政策和減少環(huán)境污染具有重要的指導意義。與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有廣泛的應用前景。

技術(shù)特征：

1.一種通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法，其特征在于，步驟s1中所述成年雌性斑馬魚的月齡為三個月，水箱中飼養(yǎng)條件為每天用豐年蝦幼蟲喂養(yǎng)兩次，每次喂食5分鐘后清除殘余食物；

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法，其特征在于，步驟s1中所述魚缸中水溫設置為25-27℃，ph為6.9-7.5，溶解氧為6-15mg/l，光暗周期比為12.5-14：10-11.5，光照強度為54-324lux。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法，其特征在于，步驟s1中所述魚缸中飼養(yǎng)條件為每天喂食2次脫殼豐年蝦卵，每隔24h換半水并添加孕二烯酮使孕二烯酮在水中濃度保持一致。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法，其特征在于，步驟s3中所述第一次離心轉(zhuǎn)速設置為2000-2500rpm，離心時間為15-20min，離心溫度為2-5℃。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法，其特征在于，步驟s3中所述第二次離心轉(zhuǎn)速設置為1500-2000rpm，離心時間為10-15min，離心溫度為2-5℃。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法，其特征在于，步驟s4中所述波恩固定液由72-75ml質(zhì)量濃度為1.22％苦味酸飽和液、22-25ml質(zhì)量濃度為40％甲醛和3-5ml冰醋酸混合得到。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法，其特征在于，步驟s5中所述光照強度為100-240lux，e3培養(yǎng)基由氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、亞甲基藍和去離子水混合得到。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法，其特征在于，步驟s5中所述孵化時溫度設置為27.5-28.5℃，ph為6.9-7.5，溶解氧為6-15mg/l，光暗周期比為12.5-14：10-11.5。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及毒性分析技術(shù)領域，具體涉及一種通過斑馬魚評估孕二烯酮甲狀腺毒性的方法，本發(fā)明通過分子層面、細胞層面和個體形態(tài)分析了孕二烯酮對斑馬魚的影響，具體分析了經(jīng)孕二烯酮處理后斑馬魚的運動行為、繁殖、激素含量和組織切片。結(jié)果表明，孕二烯酮暴露介質(zhì)不僅對斑馬魚的生長發(fā)育有潛在的負面影響，還可能對它們的長期生存和繁殖能力造成嚴重威脅。本發(fā)明為進一步理解孕二烯酮等環(huán)境激素對水生生物的潛在風險提供了重要的科學依據(jù)，還揭示了斑馬魚作為一種模式生物在環(huán)境毒理學研究中的應用價值，對于制定環(huán)境保護政策和減少環(huán)境污染具有重要的指導意義。與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有廣泛的應用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：侯麗萍,陳雨瀅,周益成,張翎翊,黃愛琪,鄒弘,葉美欣,鄔俊豪
受保護的技術(shù)使用者：廣州大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9