本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種高靈敏度elisa法檢測人血清中水痘-帶狀皰疹病毒ge蛋白特異性igg抗體的方法。

背景技術(shù)：

1、水痘-帶狀皰疹病毒(vzv)是引起人類水痘(chickenpox)和帶狀皰疹(herpeszoster)疾病的病原體，屬皰疹病毒科，是雙鏈dna病毒；vzv病毒顆粒呈準(zhǔn)圓球形，直徑有150～200nm，由內(nèi)及外分為四層，依次為病毒核心、核衣殼、皮層和囊膜。在病毒的囊膜上包含至少9種糖蛋白，包括ge、gb、gh、gi、gc、gl、gk、gm和gn，這些糖蛋白在病毒感染宿主中發(fā)揮重要作用。

2、目前最為有效的避免感染該病毒的方法為免疫接種疫苗。當(dāng)前，vzv疫苗主要有減毒疫苗、重組蛋白疫苗，在研的還有核酸疫苗；1974年，日本的高橋理明建立了水痘減毒病毒oka株，世界衛(wèi)生組織認(rèn)為，目前只有oka株適用于水痘減毒活疫苗的制備，世界各國均采用oka株水痘減毒活疫苗預(yù)防和控制水痘，研究表明，oka株在傳代至50代，生物學(xué)特性依然保持良好的穩(wěn)定性。

3、目前，用于預(yù)防帶狀皰疹病毒的疫苗主要是gsk的亞單位疫苗(shingrix，欣安立適)和長春百克的減毒活疫苗；shingrix疫苗是由vzv中抗原性最強(qiáng)，含量最高的ge糖蛋白和as01b佐劑系統(tǒng)構(gòu)成，可以激發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫；通過查看fda發(fā)布shingrix的review，在疫苗免疫原性評價(jià)方面其主要關(guān)注了anti-ge?antibody水平(elisa)、ge特異性細(xì)胞因子水平(ics)，這兩個(gè)指標(biāo)被作為該疫苗免疫原性效果的主要終點(diǎn)指標(biāo)；在其一項(xiàng)iii期臨床試驗(yàn)中，gsk建立了一套cut-off值為97miu/ml(即陽轉(zhuǎn)判斷閾值)的elisa方法檢測其臨床樣本；同時(shí)，在細(xì)胞免疫評價(jià)方面，gsk評估了生物樣本中滿足至少2個(gè)特異性細(xì)胞因子水平的cd4+細(xì)胞比例，即the?frequencies?of?glycoprotein?e-specific?cd4[2+]t?cells。其cut-off為320cd4[2+]t?cells?per?106cd4?t?cellscounted。

4、查看cde關(guān)于gsk“重組帶狀皰疹疫苗(jxss1800039)申請上市技術(shù)審評報(bào)告”可以發(fā)現(xiàn)，cde并不支持gsk使用anti-ge?antibody水平(elisa)用于直接推斷保護(hù)效力，僅能用于參考；因此，fama法作為水痘特異性抗體檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在國內(nèi)越來越受到監(jiān)管層的重視。

5、而水痘-帶狀皰疹病毒疫苗免疫原性研究主要關(guān)注的糖蛋白抗體為ge蛋白抗體，也有研究者對gb和gh蛋白抗體進(jìn)行了檢測，而fama法則可以檢測針對vzv的全部特異性的igg抗體，其靈敏度、特異性等均優(yōu)于elisa法；但fama法檢測過程較復(fù)雜，通量低，重現(xiàn)性相比elisa更難，因此，國內(nèi)臨床試驗(yàn)一般均會(huì)使用兩種方法對疫苗的體液免疫進(jìn)行評價(jià)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)也利用臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)評估兩種方法的相關(guān)性，以評估疫苗免疫原性。

6、建立的elisa法檢測ge抗原特異性抗體水平的方法使用nibsc國際標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本和質(zhì)控樣本，如果是非臨床評價(jià)則需要陽性血清或陽性抗體；將重組vzv-ge蛋白包被于酶標(biāo)板上，封閉后加入標(biāo)品、質(zhì)控品以及待測樣品孵育，再次加入抗人igg二抗，最后洗板后tmb顯色，以國際標(biāo)準(zhǔn)品來計(jì)算待測樣品中的vzv-ge蛋白特異性igg抗體濃度。

7、fama法同樣需要使用則是利用將感染了vzv病毒的細(xì)胞固定在載玻片上，加入標(biāo)品、待測樣品孵育，加入熒光二抗后顯微鏡下觀察，呈熒光圓環(huán)的孔為陽性孔；其結(jié)果判定可依據(jù)一定數(shù)量的陰性血清孔檢測結(jié)果進(jìn)行判定，臨床上一般以≥1：4判定為陽性，即具有vzv保護(hù)力。

8、在方法學(xué)驗(yàn)證方面，目前文獻(xiàn)中主要是方法學(xué)的建立而缺少系統(tǒng)性的方法學(xué)驗(yàn)證；中國食品藥品檢定研究院發(fā)表過相關(guān)的vzv?igg抗體國家標(biāo)準(zhǔn)品制作和驗(yàn)證的文獻(xiàn)，其使用nibsc國際標(biāo)準(zhǔn)品對中檢院陽性參考品進(jìn)行賦值，以評估vzv相關(guān)體外診斷試劑盒性能；周志軍等等使用商品化試劑盒對vzv病毒igg檢測方法進(jìn)行了驗(yàn)證，其驗(yàn)證主要內(nèi)容包括線性及線性范圍、精密度和準(zhǔn)確度、添加試驗(yàn)等，但其驗(yàn)證指標(biāo)無法滿足臨床試驗(yàn)申報(bào)要求；根據(jù)ich?m10及2020年版《中國藥典》要求，配體結(jié)合定量分析方法驗(yàn)證至少包括校準(zhǔn)曲線和范圍、準(zhǔn)確度和精密度、特異性、選擇性、稀釋線性和鉤狀效應(yīng)、穩(wěn)定性等，并且還應(yīng)對樣品進(jìn)行isr；而定性抗體檢測方法則按照《疫苗臨床試驗(yàn)抗體分析方法研究技術(shù)指導(dǎo)原則(征求意見稿)》進(jìn)行cut-off值、專屬性、檢測限，定量和半定量檢測方法則應(yīng)進(jìn)行專屬性、檢測限、線性、線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度的驗(yàn)證。

9、對于fama的方法學(xué)驗(yàn)證則缺乏國家標(biāo)準(zhǔn)，一般來說可以參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行開展，但其總體上應(yīng)盡量遵循抗體檢測相關(guān)指導(dǎo)原則，袁典等對建立的fama法進(jìn)行了靈敏度、特異性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度的驗(yàn)證，其靈敏度達(dá)到31.25miu/ml，gsv％分別為29.95％和26.71％，同時(shí)特異性驗(yàn)證總發(fā)現(xiàn)未與hsv-1/2型抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，證明特異性良好。

10、park?r，hwang?jy,leeki等考慮到fama需要p2實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)病毒，嘗試建立一種基于ge蛋白的fama，但這種方法很難獲得監(jiān)管層的認(rèn)可；liu?jj等使用fama對實(shí)驗(yàn)室592份血清進(jìn)行分析檢測，但是方法建立后僅對靈敏度和特異性進(jìn)行了驗(yàn)證；michalik?de等使用elisa和fama對臨床試驗(yàn)148名兒童血清樣本進(jìn)行了檢測，其未對fama方法學(xué)驗(yàn)證指標(biāo)進(jìn)行描述。

11、綜上所述，現(xiàn)有針對人血清中水痘-帶狀皰疹病毒ge蛋白特異性igg抗體的檢測方法無法同時(shí)滿足高靈敏度、特異性優(yōu)以及通量高，重現(xiàn)性優(yōu)的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種高靈敏度elisa法檢測人血清中水痘-帶狀皰疹病毒ge蛋白特異性igg抗體的方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中針對人血清中水痘-帶狀皰疹病毒ge蛋白特異性igg抗體的檢測方法無法同時(shí)滿足高靈敏度、特異性優(yōu)以及通量高，重現(xiàn)性優(yōu)的技術(shù)問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的一種高靈敏度elisa法檢測人血清中水痘-帶狀皰疹病毒ge蛋白特異性igg抗體的方法，包括以下步驟：

3、抗原包被：用1×pbs磷酸鹽緩沖液將含量為2170μg/ml的ge蛋白稀釋至0.5μg/ml，按100μl/孔加入96孔板中，低溫過夜；

4、洗板：取出包被過夜的酶標(biāo)板，棄去孔內(nèi)液體，拍干后洗液300μl/孔加入，靜置后拍干，重復(fù)三次；

5、封閉：封閉液300μl/孔加入，蓋上封板膜孵育；

6、重復(fù)洗板過程；

7、加樣：配制好的質(zhì)控樣本100μl/孔加入，蓋上封板膜孵育；

8、重復(fù)洗板過程；

9、加酶：酶工作液100μl/孔加入，蓋上封板膜孵育；

10、重復(fù)洗板過程；

11、顯色：tmb?100μl/孔加入，蓋上封板膜避光顯色；

12、終止：終止液50μl/孔加入，輕微振蕩；

13、讀數(shù)：在450nm波長下讀取od值。

14、其中，低溫過夜的溫度為2-8℃。

15、其中，在取出包被過夜的酶標(biāo)板，棄去孔內(nèi)液體，拍干后洗液300μl/孔加入，靜置后拍干中，靜止的時(shí)間為1min。

16、其中，在封閉液300μl/孔加入，蓋上封板膜孵育中，孵育過程于37℃，400rpm條件下孵育2h。

17、其中，在配制好的質(zhì)控樣本100μl/孔加入，蓋上封板膜孵育中，孵育過程于37℃，400rpm條件下孵育1h。

18、其中，在酶工作液100μl/孔加入，蓋上封板膜孵育過程中，孵育于37℃，400rpm條件下孵育30min。

19、其中，在tmb?100μl/孔加入，蓋上封板膜避光顯色中，避光顯色于37℃，400rpm條件下避光顯色15min。

20、本發(fā)明的一種高靈敏度elisa法檢測人血清中水痘-帶狀皰疹病毒ge蛋白特異性igg抗體的方法，本方法采用重組vzv-ge蛋白包被酶標(biāo)板，自建間接elisa方法，通過對包被濃度、封閉條件、孵育時(shí)間、二抗?jié)舛鹊冗M(jìn)行篩選，成功建立人血清中vzv-ge蛋白igg抗體濃度檢測方法；繼而使用該方法和nibsc國際標(biāo)準(zhǔn)品(nibsc?code：w1044)對陽性混合人血清進(jìn)行標(biāo)定，標(biāo)定后的陽性混合血清作為企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，以用于測定人血清中的vzv-ge蛋白特異性igg抗體濃度；

21、以此方式解決了現(xiàn)有技術(shù)中針對人血清中水痘-帶狀皰疹病毒ge蛋白特異性igg抗體的檢測方法無法同時(shí)滿足高靈敏度、特異性優(yōu)以及通量高，重現(xiàn)性優(yōu)的技術(shù)問題。