本發(fā)明涉及的是雞蛋樣品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種quechersemr-lipid結(jié)合lc-ms/ms快速測定雞蛋中磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的方法。
背景技術(shù)：
磺胺類抗生素(sulfonamides，sas)是人工合成的具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類抗菌藥物，喹諾酮類(4-quinolones)是一類含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥物，兩類藥物都因具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣、高效、低毒、價格低、使用方便等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用到養(yǎng)殖業(yè)上，用來治療和預(yù)防動物的疾病感染，并越來越受到養(yǎng)殖戶的重視。但由于生產(chǎn)者用藥不規(guī)范或不遵守正確的休藥期等因素，導(dǎo)致sas和fqs在畜禽體內(nèi)過量積聚殘留，污染了動物性食品，間接對人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)、泌尿系統(tǒng)損害等危害，重者可導(dǎo)致休克甚至死亡，某些藥物還存在潛在的致癌性質(zhì)。為此，世界各國普遍對食品中的sas和fqs的限量提出了嚴格要求，并被許多國家列入抗生素禁用清單。目前，歐盟、美國、日本、韓國等國家均將磺胺類藥物列為動物飼養(yǎng)過程中限制使用的藥物，美國則禁止喹諾酮類藥物應(yīng)用于動物源性食品，我國農(nóng)業(yè)部《獸藥停藥期規(guī)定》中也指出多種喹諾酮藥物制劑在產(chǎn)蛋雞中禁用，農(nóng)業(yè)部公告第235號對動物源性食品中使用磺胺類藥物的規(guī)定限量為總量不得大于100μg·kg-1。
目前，國內(nèi)外對sas和fqs的分析檢測方法主要有微生物檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法、毛細管電泳法(ce)、高效液相色譜法(hplc)及高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(hplc-ms/ms)等，其中，hplc-ms/ms法是檢測動物源性食品中獸藥殘留的重要方法，這種方法結(jié)合液相保留時間，并采用多重反應(yīng)監(jiān)測(mrm)模式，對特征離子進行定量和定性分析，適合于復(fù)雜基質(zhì)樣品的檢測，但目前檢測sas和fqs的lc-ms/ms方法主要集中在水產(chǎn)品、雞肉、豬肉和牛奶等方面，未有文獻報道雞蛋中磺胺類藥物的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法，可以同時檢測雞蛋中磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的快捷方法更未見文獻報道。基于此，結(jié)合最新quechersemr-lipid快速樣品提取技術(shù)的高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀法檢測禽蛋中多種磺胺類藥物和多種氟喹諾酮類藥物的殘留含量是食品安全技術(shù)發(fā)展所趨。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)上存在的不足，本發(fā)明目的是在于提供一種快速測定雞蛋中磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的方法，簡單易行，便于操作，方法精密度高，可以滿足對雞蛋中磺胺類藥物和喹諾酮類藥物快速、準(zhǔn)確的檢測要求，適合大批量樣品的準(zhǔn)確定性和定量分析，易于推廣使用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過如下的技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種快速測定雞蛋中磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的方法，其步驟為：
(1)準(zhǔn)備材料與試劑：quechersemr-lipid快速萃取管，乙腈、甲醇、甲酸(均為hplc純試劑)，蒸餾水，以及目標(biāo)分析物：磺胺噻唑(st)、磺胺二甲異惡唑(siz)、磺胺多辛(sdm’)、磺胺甲基嘧啶(sm1)、磺胺氯噠嗪(scp)、磺胺吡啶(spd)、磺胺甲噻二唑(smt)、磺胺甲氧噠嗪(smp)、磺胺嘧啶(sd)、磺胺間甲氧嘧啶(smm)、磺胺地索辛(sdm)、磺胺甲惡唑(smz)、磺胺喹惡啉(sq)、磺胺二甲嘧啶(sm2)、麻保沙星、洛美沙星、培氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、二氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星、吡哌酸、惡喹酸(奧索利酸)、依諾沙星(氟啶酸)、萘啶酸、氟甲喹、西諾沙星；
(2)樣品提取凈化：準(zhǔn)確稱取5g雞蛋樣品，加入2％甲酸乙腈8ml，漩渦震蕩1min，再加入ph7.0、0.1mol/l的edta緩沖液0.5ml，漩渦震蕩1min，10000r/min離心3min，將上清液轉(zhuǎn)移至quechersemr-lipid快速萃取提取管中，劇烈震蕩1min，10000r/min離心3min，將上清液轉(zhuǎn)移至quechersemr-lipid反萃取管中，劇烈震蕩1min，10000r/min離心3min，吸取1ml上清液到樣品瓶中，50℃下氮氣吹至近干；
(3)上機測定：濃縮液用0.2％甲酸乙腈溶液定容至1.0ml，渦旋混勻，過0.22μm過濾膜轉(zhuǎn)移至進樣瓶中上機檢測；
(4)儀器條件：
色譜條件：色譜柱：agilentporoshellec-c18柱，2.1mm×100mm，2.7μm；流動相：a相為0.2％甲酸溶液，b相為乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～0.5min，4％b；0.5～4.5min，4％b～8％b；4.5～5min，8％b；5～10min，8％b～18％b；10～13min，18％b～40％b；13～13.4min，40％b～70％b；13.4～13.5min，70％b～90％b；b瞬時變化為10％，并保持2min；流速：0.4ml/min；進樣量：5.0μl；
質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描，動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測，碰撞能量為380v，霧化氣壓力為50psi，毛細管壓力4000v，干燥氣流速10l/min，干燥氣溫度350℃,同時優(yōu)化各物質(zhì)的質(zhì)譜檢測參數(shù)；
(5)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限與定量限測定：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的實際含量換算標(biāo)準(zhǔn)品的實際稱重量，分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品，置于相應(yīng)容量瓶中，以10ml水溶解，并用0.1％甲酸乙腈定容至刻度(其中惡喹酸10ml水加1.5ml氨水溶解，再用0.1％甲酸乙腈定容)，即成100.00μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃冰箱中避光保存，臨用前可將其用流動相稀釋至工作濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液；
配置一系列濃度的混標(biāo)溶液，用處理好的空白樣品基質(zhì)，配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，上機檢測獲得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)處理獲得線性相關(guān)系數(shù)，按3倍信噪比計算方法檢測限，10倍信噪比計算方法定量限；
(6)添加回收率、精密度測定：準(zhǔn)確稱取5.00g雞蛋樣品，分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液混合溶液8、16、32μg/kg濃度，每個添加濃度做6個平行樣品，按上述方法進行處理分析，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。
作為優(yōu)選，所述樣品提取凈化步驟中將上清液轉(zhuǎn)移至quechersemr-lipid快速萃取提取管前需用ph2.4、0.1mol/l的乙酸銨溶液5ml活化。
作為優(yōu)選，所述上機測定步驟中甲酸乙腈溶液的甲酸水與乙腈的配比為4：1。
本發(fā)明的有益效果：操作步驟簡單，減少操作過程中的各種誤差，不僅提高了方法的靈敏度，還提高了樣品的回收率和精密度，大大節(jié)省了樣品前處理的時間，方法精密度高，不僅提高了磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的檢測靈敏度，也通過二級質(zhì)譜掃描對藥物進行了準(zhǔn)確的定性分析，滿足對雞蛋中磺胺類藥物和喹諾酮類藥物快速、準(zhǔn)確的檢測要求，適合大批量樣品的準(zhǔn)確定性和定量分析，對于大批量樣品的檢測具有很高的實用性。
具體實施方式
為使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施方式，進一步闡述本發(fā)明。
本具體實施方式采用以下技術(shù)方案：一種快速測定雞蛋中磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的方法，其步驟為：
(1)準(zhǔn)備材料與試劑：quechersemr-lipid快速萃取管，乙腈、甲醇、甲酸(均為hplc純試劑)，蒸餾水，以及目標(biāo)分析物：磺胺噻唑(st)、磺胺二甲異惡唑(siz)、磺胺多辛(sdm’)、磺胺甲基嘧啶(sm1)、磺胺氯噠嗪(scp)、磺胺吡啶(spd)、磺胺甲噻二唑(smt)、磺胺甲氧噠嗪(smp)、磺胺嘧啶(sd)、磺胺間甲氧嘧啶(smm)、磺胺地索辛(sdm)、磺胺甲惡唑(smz)、磺胺喹惡啉(sq)、磺胺二甲嘧啶(sm2)、麻保沙星、洛美沙星、培氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、二氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星、吡哌酸、惡喹酸(奧索利酸)、依諾沙星(氟啶酸)、萘啶酸、氟甲喹、西諾沙星。
(2)樣品提取凈化：準(zhǔn)確稱取5g(精確至0.05g)雞蛋樣品，加入2％甲酸乙腈8ml，漩渦震蕩1min，再加入ph7.0、0.1mol/l的edta緩沖液0.5ml，漩渦震蕩1min，10000r/min離心3min，將上清液轉(zhuǎn)移至quechersemr-lipid快速萃取提取管中(此管提前用ph2.4、0.1mol/l的乙酸銨溶液5ml活化)，劇烈震蕩1min，10000r/min離心3min，將上清液轉(zhuǎn)移至quechersemr-lipid反萃取管中，劇烈震蕩1min，10000r/min離心3min，吸取1ml上清液到樣品瓶中，50℃下氮氣吹至近干。
(3)上機測定：濃縮液用0.2％甲酸乙腈溶液(甲酸水與乙腈配比為4：1)定容至1.0ml，渦旋混勻，過0.22μm過濾膜轉(zhuǎn)移至進樣瓶中上機檢測。
(4)儀器條件：
色譜條件：色譜柱：agilentporoshellec-c18柱，2.1mm×100mm，2.7μm；流動相：a相為0.2％甲酸溶液，b相為乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～0.5min，4％b；0.5～4.5min，4％b～8％b；4.5～5min，8％b；5～10min，8％b～18％b；10～13min，18％b～40％b；13～13.4min，40％b～70％b；13.4～13.5min，70％b～90％b；b瞬時變化為10％，并保持2min；流速：0.4ml/min；進樣量：5.0μl。
質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描，動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測，碰撞能量為380v，霧化氣壓力為50psi，毛細管壓力4000v，干燥氣流速10l/min，干燥氣溫度350℃,同時優(yōu)化各物質(zhì)的質(zhì)譜檢測參數(shù)。
(5)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限與定量限測定：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的實際含量換算標(biāo)準(zhǔn)品的實際稱重量，分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品，置于相應(yīng)容量瓶中，以10ml水溶解，并用0.1％甲酸乙腈定容至刻度(其中惡喹酸10ml水加1.5ml氨水溶解，再用0.1％甲酸乙腈定容)，即成100.00μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃冰箱中避光保存，臨用前可將其用流動相稀釋至工作濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。
配置一系列濃度的混標(biāo)溶液，用處理好的空白樣品基質(zhì)，配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，上機檢測獲得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)處理獲得線性相關(guān)系數(shù)，按3倍信噪比計算方法檢測限，10倍信噪比計算方法定量限。
(6)添加回收率、精密度測定：準(zhǔn)確稱取5.00g雞蛋樣品，分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液混合溶液8、16、32μg/kg濃度，每個添加濃度做6個平行樣品，按上述方法進行處理分析，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。
本具體實施方式的結(jié)果與分析如下：
(1)色譜柱選擇：使用agilentporoshellec-c18柱(2.1mm×100mm，2.7μm)對配制0.1mg/l的標(biāo)準(zhǔn)溶液混合溶液柱進樣上機，同樣色譜質(zhì)譜條件下，agilentporoshellec-c18柱的響應(yīng)值和多種藥物成分的分離度更好。
(2)質(zhì)譜條件選擇：
磺胺類藥物是人工合成的氨苯磺胺衍生物，基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為對氨基苯磺酰胺，喹諾酮類藥物則都是具有吡啶酮酸共同結(jié)構(gòu)的一組藥物，根據(jù)兩類藥物的分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)，選擇esi(+)作為電離模式。采用直接進樣方式，0.1mg/l單標(biāo)溶液進樣5μl，正離子掃描模式對各藥物進行全掃描，選擇響應(yīng)最佳的準(zhǔn)分子離子峰為母離子，再對母離子進行二級質(zhì)譜掃描，得到各個化合物響應(yīng)值最佳的碎片子離子。最后再對得到的每種藥物的二級質(zhì)譜的碰撞能量(ce)、電噴霧電壓(is)、霧化氣、噴霧壓力、毛細管溫度和電壓等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，從而使每種藥物的分子離子與特征離子碎片產(chǎn)生的離子強度達到最大時為最佳，使化合物的響應(yīng)最高(見表1)。
(3)色譜條件選擇：
磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的結(jié)構(gòu)對ph值都有嚴格的要求，0.2％甲酸溶液體系能使磺胺類藥物和喹諾酮類藥物在質(zhì)譜中有更好的響應(yīng)值，這是由于甲酸可以為陽離子的形成提供必需的質(zhì)子來源，從而提高其離子化效率，因此選用0.2％甲酸溶液作為流動相。此外，由于喹諾酮類藥物熱穩(wěn)定性差，柱溫太高可能會分解，而當(dāng)柱溫太低時流動相粘度大、色譜柱的理論塔板數(shù)低、目標(biāo)物質(zhì)出峰慢，因此柱溫選為40℃。
(4)樣品前處理的優(yōu)化：
磺胺類藥物和喹諾酮類藥物都含有較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，微溶于水和甲醇等有機溶液，尤其是在酸性環(huán)境下穩(wěn)定,選擇2％甲酸乙腈溶液作為提取液，其提取樣品所得的提取液最清，蛋白除去效果最好，磺胺藥物的提取效果也較好。喹諾酮類含有吡啶酮酸基本結(jié)構(gòu)，其羧基和酮基極易和金屬離子形成絡(luò)合物，所以單純2％甲酸乙腈溶液提取時，喹諾酮類藥物的回收率幾乎沒有，所有在樣品提取過程中加入乙二胺四乙酸二鈉(edta)去絡(luò)合提取管中的金屬離子，從而提高喹諾酮類藥物的回收率，0.1mol/ledta作為絡(luò)合劑時喹諾酮類藥物的回收率最好；所以在提取過程中，選擇2％甲酸乙腈溶液和0.1mol/ledta共同提取樣品。
(5)樣品凈化：
使用quechersemr-lipid快速提取對樣品進行凈化，quechersemr-lipid對脂質(zhì)的去除率較好，而且分析物的回收率也較高。在使用quechersemr-lipid萃取管進行樣品凈化時，quechersemr-lipid快速萃取提取管的活化效果直接影響了檢測結(jié)果的好壞，對比純水、ph2.40.1mol/l乙酸銨、ph2.40.1mol/ledta、ph40.1mol/ledta、ph70.1mol/ledta活化提取管：純水活化時，只有磺胺類藥物有回收；ph40.1mol/ledta活化時喹諾酮類藥物開始有回收，但較低；ph70.1mol/ledta活化時喹諾酮類藥物回收較好，但磺胺類藥物又沒有了回收；而ph2.40.1mol/ledta活化時，由于溶液太酸，edta有析出現(xiàn)象；而用ph2.40.1mol/l乙酸銨活化萃取管中，磺胺類藥物和喹諾酮類藥物均有回收，而且回收率較好，所以最終選擇ph2.40.1mol/l乙酸銨作為萃取管的活化液進行活化。
(6)檢測方法的線性關(guān)系、檢測限(lod)與定量限(loq)的確定
配制一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，做基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量分析，其線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表1，按3倍信噪比計算定為檢測限(lod)，10倍信噪比定為定量限(loq)，結(jié)果見表1。
表1目標(biāo)分析物的質(zhì)譜檢測參數(shù)、工作曲線線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限
(7)檢測方法回收率和精密度確定
準(zhǔn)確稱取空白樣品，分別添加高、中、低三個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加濃度平行測定6次，進行樣品分析。在添加的所有藥物中，除了磺胺藥物沒有回收率外，其他藥物的回收率較好，回收率范圍為41.65％～115.86％之間，精密度也較好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20％，結(jié)果見表2。
表2空白樣品中30種獸藥的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(％，n＝6)
本具體實施方式建立了同時檢測禽蛋中14種磺胺類藥物和16中喹諾酮類藥物多殘留量的hplc-ms/ms分析檢測方法，為禽蛋中的磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的殘留檢測提供了理論依據(jù)，食品中抗生素殘留檢測屬于較為復(fù)雜的痕量組分分析技術(shù)，最顯著的特點是需要嚴格的樣本前處理步驟，因為前處理的操作直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，所以能集采樣、萃取、凈化、濃縮、預(yù)分離、進樣于一身的聯(lián)用和自動化分析等將是未來發(fā)展的趨勢。而本方法中的檢測樣品禽蛋中的蛋白質(zhì)含量較高，在前處理過程中去除脂肪的步驟也非常關(guān)鍵，其脂肪去除的干凈程度直接影響了最終結(jié)果。但目前現(xiàn)有技術(shù)所用的多數(shù)方法通常都會在去除脂質(zhì)的損失一部分目標(biāo)物，從而使目標(biāo)物的回收率受到的影響，所以本方法在樣品前處理過程中，采用quechersemr-lipid萃取技術(shù)凈化樣品，可針對任意樣品前處理產(chǎn)品實現(xiàn)最徹底的脂質(zhì)去除和分析物回收，與其他樣品前處理方法不同，它是一種能夠選擇性去除復(fù)雜基質(zhì)中脂質(zhì)并挑戰(zhàn)鱷梨等高脂肪含量樣品的獨特吸附劑，可以在不損失分析物的前提下去除脂質(zhì)，而且其操作步驟也比較簡單，從而減少了操作過程中的各種誤差，避免了以往方法中人工操作較多，前處理繁瑣，檢測限較高，結(jié)果不夠理想的現(xiàn)象，不僅提高了方法的靈敏度，還提高了樣品的回收率和精密度。而且其樣品前處理時間也較短，大大節(jié)省了樣品前處理的時間，適用于大批量產(chǎn)品的快速檢測。
本方法利用高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測禽蛋中磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的多殘留含量，不僅具有液相色譜對藥物的高效分離特點，也具有質(zhì)譜對分析物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的定性分析特性，同時達到了定性和定量的檢測目的，特別適用于獸藥痕量殘留的確證性分析檢測，而且在檢測結(jié)果上大大提高了方法的靈敏度和精確度，所得檢測限也比較低，磺胺類藥物檢測限為0.0013～0.0166μg/kg，定量限0.0044～0.0552μg/kg；喹諾酮類藥物檢測限為0.0018～0.0972μg/kg，定量限0.0060～0.3239μg/kg，遠遠小于歐美國家和我國農(nóng)業(yè)部制定的最高殘留限量，與其他液質(zhì)聯(lián)用法相比，檢測限也有所降低。所以本方法建立的檢測方法不僅提高了磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的檢測靈敏度，也通過二級質(zhì)譜掃描對藥物進行了準(zhǔn)確的定性分析，即使動物性食品的樣品中含有復(fù)雜的基質(zhì)，也可以做到準(zhǔn)確的確證分析，同時本方法前處理操作簡便，節(jié)省了大量人力和時間，對于大批量樣品的檢測具有很高的實用性，在理論和生產(chǎn)實踐上都具有重要意義，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。