本發(fā)明屬于毒性評價(jià)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用斑馬魚胚胎評價(jià)中成藥潛在致畸性的方法。

背景技術(shù)：

中成藥根據(jù)傳統(tǒng)中藥的藥方利用現(xiàn)代技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，在生產(chǎn)過程中可能會產(chǎn)生與傳統(tǒng)炮制方法不同的藥物相互作用，可能產(chǎn)生新的毒性。傳統(tǒng)評價(jià)致畸性的方法是利用哺乳類模式生物大鼠和小鼠的胚胎進(jìn)行評價(jià)，但由于哺乳類動(dòng)物胚胎的發(fā)育周期長且不易觀察，難以進(jìn)行快速且大規(guī)模評價(jià)。通常中藥中能吸收進(jìn)入體內(nèi)的主要是水溶性成分，在水溶液中發(fā)育斑馬魚胚胎是適用與中藥的毒性評價(jià)新模型。過去利用斑馬魚評價(jià)中藥發(fā)育毒性方法中，也未確立潛在致畸性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，特別未有對中成藥評價(jià)的方法，實(shí)用性低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，適用于快速且大規(guī)模評價(jià)中成藥潛在致畸性的方法技術(shù)。本發(fā)明的目的通過中成藥水溶性物質(zhì)提取、中成藥對斑馬魚胚胎培養(yǎng)和致畸性評價(jià)三步實(shí)現(xiàn)，具體方案如下：

(1)中成藥的處理方法：將中成藥的包衣/膠囊去除，研成細(xì)粉。中成藥粉末精密稱量，在超聲清洗儀中用dmso萃取30分鐘，在室溫放置24小時(shí)。提取物加入e3培養(yǎng)液稀釋到所需濃度(胚胎死亡率為100％的濃度)，離心后取上清液，用e3培養(yǎng)液稀釋至多個(gè)濃度，用于培養(yǎng)斑馬魚胚胎。

(2)斑馬魚胚胎的培養(yǎng)：取受精后3小時(shí)的斑馬魚胚胎，按照每孔一枚地分裝于孔板中，孔中加入中成藥的溶液，每個(gè)濃度的溶液培養(yǎng)若干胚胎。將孔板置于28.5攝氏度、光照/黑暗循環(huán)12/12(小時(shí))的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24小時(shí)更換一次溶液，培養(yǎng)至受精后72小時(shí)。

(3)致畸性評價(jià)：在顯微鏡下觀察胚胎的發(fā)育情況，記錄每個(gè)濃度下死亡胚胎和畸形胚胎的個(gè)數(shù)，根據(jù)probit模型對半數(shù)致死濃度(lc50)和半數(shù)致畸濃度(ec50)進(jìn)行求解，通過計(jì)算lc50和ec50的比值得到致畸指數(shù)，根據(jù)指數(shù)的大小判斷藥物是否具有潛在致畸性。

附圖說明

圖1是毒性評價(jià)技術(shù)的流程圖。

圖中：1、中成藥，2、中成藥粉末，3、中成藥溶液，4、斑馬魚胚胎，5、96孔板，6、培養(yǎng)，7、顯微觀察，8、顯微下斑馬魚發(fā)育狀態(tài)、9、統(tǒng)計(jì)與分析

具體實(shí)施方式

為了詳細(xì)說明本發(fā)明的特點(diǎn)，現(xiàn)舉以下實(shí)例說明：

實(shí)施例1：

1、取婦樂顆粒研磨成細(xì)粉，精密稱定250毫克，加入250微升dmso，在超聲清洗儀中提取30分鐘后，在室溫下靜置24小時(shí)，用e3培養(yǎng)稀釋至50毫升，在4000rpm下離心，取上清，上清液濃度為5毫克/毫升。用e3培養(yǎng)液稀釋，得到一系列濃度為0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.5和5毫克/毫升的藥物溶液。

2、將受精后3小時(shí)的斑馬魚胚胎置于96孔板中，每孔放置1枚胚胎，每個(gè)孔加入200微升的藥液，每個(gè)濃度藥液培養(yǎng)30枚胚胎?？装逯糜?8.5攝氏度和光照/黑暗循環(huán)12/12(小時(shí))的環(huán)境下培養(yǎng)，每24小時(shí)更新一次藥液，培養(yǎng)至受精后72小時(shí)。

3、在顯微鏡下觀察每個(gè)濃度的斑馬魚胚胎的形態(tài)并記錄死亡胚胎和畸形胚胎畸形的數(shù)目，計(jì)算死亡率和畸形率，并用軟件計(jì)算得到半數(shù)致死濃度和半數(shù)致畸濃度分別為0.74和0.484毫克/毫升，致畸指數(shù)為1.54，呈現(xiàn)出弱潛在致畸性。

實(shí)施例2：

1、取婦炎凈膠囊若干，去除膠囊取藥芯粉末，精密稱定400毫克，加入250微升dmso，在超聲清洗儀中提取30分鐘后，在室溫下靜置24小時(shí)，用e3培養(yǎng)稀釋至50毫升，在每分鐘4000轉(zhuǎn)下離心20分鐘，取上清，上清液濃度為8毫克/毫升。溶液用e3培養(yǎng)液稀釋，得到濃度為0.5、1、2、4、6和8毫克/毫升的藥物溶液。

2、將受精后3小時(shí)的斑馬魚胚胎置于96孔板中，每孔放置1枚胚胎，每個(gè)孔加入200微升的藥液，每個(gè)濃度藥液培養(yǎng)30枚胚胎?？装逯糜?8.5攝氏度和光照/黑暗循環(huán)12/12(小時(shí))的環(huán)境下培養(yǎng)，每24小時(shí)更新一次藥液，培養(yǎng)至受精后72小時(shí)。

3、在顯微鏡下觀察每個(gè)濃度的斑馬魚胚胎的形態(tài)并記錄死亡胚胎和畸形胚胎畸形的數(shù)目，計(jì)算死亡率和畸形率，并用軟件計(jì)算得到半數(shù)致死濃度和半數(shù)致畸濃度分別為5.23和3.51毫克/毫升，致畸指數(shù)為1.49，呈現(xiàn)出弱潛在致畸性。

實(shí)施例3：

1、將安宮牛黃丸剪成顆粒狀，精密稱定250毫克，加入250微升dmso，在超聲清洗儀中提取30分鐘后，在室溫下靜置24小時(shí)，用e3培養(yǎng)稀釋至50毫升，在4000rpm下離心，取上清，上清液濃度為5毫克/毫升。用e3培養(yǎng)液稀釋，得到濃度為0.25、0.38、0.5、0.75、1、1.5和2毫克/毫升。

2、將受精后3小時(shí)的斑馬魚胚胎置于96孔板中，每孔放置1枚胚胎，每個(gè)孔加入200微升的藥液，每個(gè)濃度藥液培養(yǎng)30枚胚胎?？装逯糜?8.5攝氏度和光照/黑暗循環(huán)12/12(小時(shí))的環(huán)境下培養(yǎng)，每24小時(shí)更新一次藥液，培養(yǎng)至受精后72小時(shí)。

3、在顯微鏡下觀察每個(gè)濃度的斑馬魚胚胎的形態(tài)并記錄死亡胚胎和畸形胚胎畸形的數(shù)目，計(jì)算死亡率和畸形率，并用軟件計(jì)算得到半數(shù)致死濃度和半數(shù)致畸濃度分別為0.633和0.743毫克/毫升，致畸指數(shù)為0.85，無致畸性。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種快速中成藥潛在致畸性的評價(jià)測試方法，其特征是：采用斑馬魚胚胎為毒性模型，將胚胎暴露于中成藥的水溶液中，觀察斑馬魚胚胎的發(fā)育在中成藥的刺激下是否產(chǎn)生發(fā)育毒性，并根據(jù)中成藥對斑馬魚胚胎的毒性指標(biāo)判斷是否具有潛在致畸性。該方法成功地對多種婦科常用中成藥進(jìn)行了毒性評價(jià)，有效地測試出中成藥的潛在致畸性，從而為中成藥臨床安全使用提供了有意義的指導(dǎo)。

技術(shù)研發(fā)人員：姚美村;陳潔烽;陳纘光;廖敏;劉彤;劉夢萍;黃丹萍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中山大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2017.05.21
技術(shù)公布日：2017.10.03