(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于天然藥物提取分析技術(shù)領(lǐng)域。它涉及一種溫郁金中揮發(fā)油類成分的微量提取檢測方法，具體地說，它涉及由分子篩ts-1作吸附劑，結(jié)合微量基質(zhì)固相萃取分散技術(shù)和高效毛細(xì)管電色譜技術(shù)，用來檢測中藥溫郁金中揮發(fā)油類有效成分含量的新方法。

(二)

背景技術(shù)：

溫郁金(curcumawenyujiny.h.chenetc.ling)為姜科姜黃屬植物，主產(chǎn)浙江瑞安，多為栽培，少有野生。2015版中國藥典收載了溫郁金來源的三味中藥，包括溫郁金，溫莪術(shù)和片姜黃。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，溫郁金來源的藥材具有活血化瘀、清心解郁、利膽退黃的功效，主要用于治療經(jīng)閉、痛經(jīng)、腹脹痛、熱病、刺痛、癲病發(fā)狂和黃疸尿赤等癥。溫郁金是著名的道地藥材“浙八味”之一，其主要成分包括揮發(fā)油類和姜黃素類成分，其中揮發(fā)油類成分主要包括倍半萜類成分莪術(shù)醇、吉馬酮、莪術(shù)二酮、呋喃二烯、β-欖香烯等?，F(xiàn)代藥理及臨床研究表明，β-欖香烯、莪術(shù)二酮、吉馬酮、莪術(shù)醇等對于多種腫瘤細(xì)胞肝癌、乳腺癌、肺癌等具有良好的抑制作用，此外這些倍半萜類成分具有抗炎、抗氧化、抗血栓及保肝等多種藥理活性。因此，針對以上幾種活性成分建立快速、簡單、低成本、環(huán)保的含量測定方法對控制溫郁金來源藥材的質(zhì)量有很重要的意義。

中藥揮發(fā)油類成分沸點(diǎn)低，極不穩(wěn)定，存在著許多影響揮發(fā)油含量的因素，如產(chǎn)地、品種、加工方法和提取方法等。目前對于溫郁金的樣品前處理方法主要集中在超聲提取上。該方法雖然簡單易行，但對目標(biāo)分子的提取效率較為低下，且受基質(zhì)干擾影響較大，使得分析結(jié)果相應(yīng)較低。而且這一方法存在的缺陷也顯而易見：實(shí)驗(yàn)過程會消耗大量有毒害的有機(jī)溶劑，既耗時又耗溶劑，且對實(shí)驗(yàn)操作人員身體有害，對環(huán)境污染嚴(yán)重，不符合“綠色化學(xué)”的理念。

鑒于上述局限，諸多建立在固相萃取基礎(chǔ)上的新型提取方法應(yīng)運(yùn)而生，基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)就是其中一種。基質(zhì)固相分散萃取(mspd)是建立在固相萃取基礎(chǔ)上的一種新型樣品處理技術(shù)，與傳統(tǒng)的固相萃取方法相比，它使用有機(jī)溶劑量少，對環(huán)境污染少，萃取時間短，萃取效率簡潔高效，逐漸成為近年來國內(nèi)外研究的一個熱門領(lǐng)域，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于天然產(chǎn)物分析檢測領(lǐng)域。

當(dāng)前文獻(xiàn)中報道的基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)，特別是在天然產(chǎn)物領(lǐng)域，藥材用量、吸附劑及洗脫劑的用量較大，且大多是有毒害的有機(jī)試劑，對操作員的身體有害，對環(huán)境也會造成污染?；|(zhì)固相分散萃取的核心是吸附劑，吸附劑種類的不同將直接影響實(shí)驗(yàn)效果。常規(guī)的基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)中，所用到的吸附劑多數(shù)以c18反相硅膠、弗羅里硅土、氧化鋁等為主。

分子篩是指其內(nèi)部具有均勻的微孔，其孔徑與一般分子大小相當(dāng)?shù)囊活愇镔|(zhì)。由于具有孔徑均勻、高比表面積、高吸附能力、強(qiáng)熱穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，分子篩的應(yīng)用非常廣泛，例如可以作選擇性吸附劑、高效干燥劑、催化劑、離子交換劑等。

截至目前，以分子篩作為吸附劑結(jié)合基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)在中藥活性成分的提取檢測方面報道較少，是一種較為新穎的提取方法。而已報道的專利號cn104297026a一種提取中藥陳皮中的黃酮類有效成分的方法及專利號cn10456919a一種檢測含中藥黃芩的牙膏中黃酮類有效成分含量的方法分別以分子篩sba-15、kit-6為吸附劑，集中在對黃酮類成分的提取檢測上。目前為止，尚未有將分子篩作為吸附劑應(yīng)用于揮發(fā)油成分的提取檢測的報道。本發(fā)明以溫郁金中的倍半萜成分為研究對象，將分子篩ts-1引入溫郁金5種倍半萜類成分的提取中，可簡化提取步驟，提高提取效率，且可避免有機(jī)溶劑的殘留。

另一方面，目前溫郁金中倍半萜類成分的分析方法主要包括高效液相色譜法、氣相色譜法、gc-ms等，通常以高效液相色譜法為主。但由于倍半萜類成分極性低，采用反相柱分離往往分析時間長、分離效率低，而且色譜柱容易被污染，柱上沉積的污染物以雜質(zhì)峰的形式出現(xiàn)，影響分析結(jié)果。且實(shí)驗(yàn)過程中使用大量有毒害的有機(jī)溶劑，對實(shí)驗(yàn)操作人員以及環(huán)境都造成一定的危害。

毛細(xì)管電泳作為20世紀(jì)80年代以來興起的一種新的分離分析技術(shù)，在藥物分析檢測中的應(yīng)用日益廣泛。毛細(xì)管微乳電動色譜(meekc)是在膠束電動毛細(xì)管色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，以微乳液為分離介質(zhì)的一種較為新型的電泳分離模式。和hplc相比，meekc進(jìn)樣體積小(nl)、分析時間快、流動相用量少(ml)、分離效率高。此外，meekc分離的物質(zhì)的極性范圍很寬，可以同時分離水溶性、脂溶性、帶電或不帶電的物質(zhì)，所以meekc在分離倍半萜類揮發(fā)油成分時具有獨(dú)特優(yōu)勢。

綜上，本發(fā)明建立了基于分子篩ts-1的基質(zhì)分散固相萃取結(jié)合毛細(xì)管微乳電動色譜技術(shù)測定溫郁金中五種倍半萜類成分的含量，以期為溫郁金來源藥材的質(zhì)量控制提供一種更加綠色、簡便、快速、高效的新方法。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于尋求一種比常規(guī)方法更快速、更綠色環(huán)保的溫郁金來源藥材中倍半萜類成分提取及含量測定方法。本發(fā)明要點(diǎn)在于將基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)和微乳液電動毛細(xì)管色譜技術(shù)結(jié)合，分子篩作為基質(zhì)固相分散萃取的吸附劑與基質(zhì)固相分散混合物中的目標(biāo)分子吸附結(jié)合，從而使得目標(biāo)分子從復(fù)雜基質(zhì)中分離出來，得到含有目標(biāo)分子的洗脫液。樣品提取方法簡單，溶劑用量少，綠色環(huán)保，同時避免了高溫提取對沸點(diǎn)低的倍半萜類成分的損失。洗脫液采用meekc進(jìn)行分離檢測。meekc所分離的物質(zhì)的極性范圍很寬，可以同時分離水溶性、脂溶性、帶電或不帶電的物質(zhì)。相比已報道的分析方法，meekc對色譜柱無污染，溶劑使用綠色環(huán)保。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種溫郁金中倍半萜成分的檢測方法，所述倍半萜類成分為莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、呋喃二烯或β-欖香烯中的一種或兩種以上的混合，所述方法為：(1)提?。簩赜艚饋碓此幉姆勰┡c吸附劑混合，研磨，將研磨后的固體混合物轉(zhuǎn)移至固相萃取柱，加入洗脫劑，底部用離心管收集洗脫液即為溫郁金提取液；所述吸附劑為下列之一：硅藻土、中性al2o3、硅膠、c18、分子篩ts-1、分子篩mcm-48、分子篩sba-15、分子篩sapo-11或分子篩zcm-5；所述洗脫劑為下列之一：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、體積比1:1的甲醇-乙醇混合液或體積比1:1的甲醇-水混合液；所述溫郁金來源藥材粉末與吸附劑質(zhì)量比為1:2～4；(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別將莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、呋喃二烯和β-欖香烯用色譜甲醇配制成終濃度分別為1.356mg/ml、0.328mg/ml、1.00mg/ml、8.20mg/ml、1.63mg/ml的對照品混合溶液儲備液，將儲備液用電泳運(yùn)行緩沖液梯度稀釋成不同濃度的對照品溶液，通過微乳液電動毛細(xì)管色譜法(meekc)測定對照品溶液中各個對照品的峰面積，以對照品溶液中各個對照品的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，制備各個對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線；微乳液電動毛細(xì)管色譜法所用電泳運(yùn)行緩沖液濃度組成為：表面活性劑0.003～0.018g/ml、輔助表面活性劑0.034～0.066g/ml、油相0.005g/ml、有機(jī)添加劑0.1ml/ml，溶劑為5～20mmol/l硼砂緩沖液，ph值為9；所述表面活性劑為十二烷基硫酸鈉(sds)，所述輔助表面活性劑為下列之一：甲醇、乙醇、正丁醇、異丙醇或正丙醇；所述油相為下列之一：乙酸乙酯、正庚烷、正己烷、正辛烷或二氯甲烷；所述有機(jī)添加劑為乙腈；(3)檢測：將步驟(1)溫郁金提取液揮干溶劑并用電泳運(yùn)行緩沖液復(fù)溶，0.22μm濾膜過濾，取濾液即為待測樣品，采用微乳液電動毛細(xì)管色譜法檢測待測樣品中各個有效成分的峰面積，分別根據(jù)莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、呋喃二烯和β-欖香烯各個對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得溫郁金待測樣品中莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、呋喃二烯和β-欖香烯的含量。

進(jìn)一步，步驟(1)所述溫郁金來源藥材包括溫郁金，溫莪術(shù)和片姜黃，所述溫郁金來源藥材粉末與吸附劑質(zhì)量比優(yōu)選1:1。

進(jìn)一步，步驟(1)所述吸附劑優(yōu)選為分子篩ts-1。

進(jìn)一步，步驟(1)所述研磨采用研缽研磨90～180s，優(yōu)選150s。

進(jìn)一步，步驟(1)所述洗脫劑優(yōu)選為甲醇，所述洗脫劑的體積用量為500μl～2000μl/3ml柱體積，優(yōu)選洗脫劑用量1000μl/3ml柱體積。

進(jìn)一步，步驟(1)所述固相萃取柱底部放置篩板，同時在添加研磨后的固體粉末后用另一塊篩板將粉末壓實(shí)；洗脫劑采用加壓加入的方式進(jìn)行洗脫。即將混合物轉(zhuǎn)移到固相萃取柱中，柱子底部和混合物的上方各放一個篩板，防止混合物損失，然后將填料壓緊。取洗脫劑，注入萃取柱內(nèi)，采用注射器適當(dāng)加壓，對萃取柱進(jìn)行洗脫，底部用離心管收集洗脫液。所述固相萃取小柱有不同體積規(guī)格，根據(jù)溫郁金藥材粉末和分子篩吸附劑研磨后固體的體積量來選擇合適體積的固相萃取小柱即可，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

進(jìn)一步，步驟(2)所述微乳液電動毛細(xì)管色譜法運(yùn)行電壓為10～25kv(優(yōu)選25kv)，檢測溫度為15～30℃(優(yōu)選25℃)，進(jìn)樣條件：50mbar，3s，檢測波長215nm。

進(jìn)一步，步驟(2)所述輔助表面活性劑優(yōu)選為正丁醇。

進(jìn)一步，步驟(2)所述油相優(yōu)選為乙酸乙酯。

進(jìn)一步，步驟(2)所述電泳運(yùn)行緩沖液終濃度組成為：sds0.013g/ml、正丁醇濃度0.05g/ml、乙酸乙酯濃度0.005g/ml、乙腈體積濃度0.1ml/ml，溶劑為ph9.0、10mmol/l硼砂緩沖液。所述運(yùn)行緩沖液各個組分混合后，超聲20min。

進(jìn)一步，步驟(3)較優(yōu)的檢測條件是：采用壓力進(jìn)樣：50mbar，3s；運(yùn)行電壓25kv；檢測溫度25℃；檢測波長215nm條件下對提取液進(jìn)行分析檢測，得到提取液的電泳譜圖。進(jìn)樣前用運(yùn)行緩沖液溶解溫郁金提取液殘?jiān)?，所有溶液使用前?.22μm濾膜過濾。

在最佳檢測條件下，莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、呋喃二烯、β-欖香烯在40min內(nèi)達(dá)到基線分離：遷移時間和峰面積的重復(fù)性rsd值分別為0.9～1.6％和1.2～4.9％；遷移時間和峰面積的日間精密度rsd值分別為2.5～3.3％和1.2～4.6％，日內(nèi)精密度rsd值分別為1.4～3.2％和1.2～4.2％；遷移時間和峰面積的日內(nèi)穩(wěn)定性rsd值分別為1.0～2.8％和1.1～4.0％。

本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明方法將基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)用于中藥揮發(fā)油類成分的提取，采用分子篩這一獨(dú)特的吸附材料，相對于常規(guī)的基質(zhì)固相分散萃取吸附劑更具有創(chuàng)新性，并且由于其具備一系列優(yōu)異突出的物理化學(xué)性質(zhì)：高比表面積、高吸附率、化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性良好，耐酸堿腐蝕，對人體無毒、不污染環(huán)境，不燃，使得操作人員的實(shí)驗(yàn)環(huán)境安全可靠。

2、本發(fā)明的方法使用的有機(jī)溶劑僅為1.0ml甲醇/3ml柱體積，顯著減少了有機(jī)溶劑的使用和使用有機(jī)溶劑之后對環(huán)境產(chǎn)生的污染，大大提高了環(huán)境保護(hù)效益。在基質(zhì)固相分散萃取的洗脫環(huán)節(jié)，所消耗時間僅在3min左右，這就使得整個萃取流程效率高，而且整體流程快速便捷。

3、本發(fā)明方法將微乳液電泳毛細(xì)管色譜技術(shù)用于溫郁金藥材中揮發(fā)油有效成分的檢測，meekc作為一種新型的毛細(xì)管分離模式，具有分辨率高、樣品用量少、操作自動化、有機(jī)溶劑用量少、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，并且可以同時分離水溶性、脂溶性、帶電或不帶電的物質(zhì)。相比液相色譜法更適用于復(fù)雜基質(zhì)的中藥成分分析、更環(huán)保、符合綠色化學(xué)。

即本發(fā)明創(chuàng)造性地提供了一種中藥中揮發(fā)油類成分的微量提取檢測方法。該方法采用分子篩作為吸附劑的基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)，結(jié)合微乳液電動毛細(xì)管色譜技術(shù)，能高效、環(huán)保地提取和檢測溫郁金藥材中揮發(fā)油類有效成分含量。

(四)附圖說明

圖1為本發(fā)明基質(zhì)固相分散萃取方法的工藝流程圖。

圖2為微乳液電動毛細(xì)管色譜分離示意圖。

圖3為考察不同種類吸附劑的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖，橫坐標(biāo)為不同種類吸附劑，縱坐標(biāo)為峰面積，單位mau·s。圖中1、2、3、4、5分別代表溫郁金中不同的揮發(fā)油類成分，分別為：1：莪術(shù)二酮；2：莪術(shù)醇；3：吉馬酮；4：呋喃二烯；5：β-欖香烯。a、b、c、d、e、f、g、h、i代表不同的吸附劑，分別為：a：分子篩mcm-48、b：分子篩sba-15、c：分子篩sapo-11、d：分子篩zcm-5、e：分子篩ts-1、f：硅膠、g：硅藻土、h：al2o3、i：c18。

圖4為考察溫郁金藥材和分子篩之間不同質(zhì)量比的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖，橫坐標(biāo)為不同溫郁金藥材與分子篩質(zhì)量比，縱坐標(biāo)為峰面積，單位mau·s。圖中，1、2、3、4、5分別代表溫郁金中不同的揮發(fā)油類成分，分別為：1：莪術(shù)二酮；2：莪術(shù)醇；3：吉馬酮；4：呋喃二烯；5：β-欖香烯。a、b、c、d、e代表不同的質(zhì)量比例(溫郁金藥材：分子篩)，分別為：a：4:1、b：2:1、c：1:1、d：2:3、e：1:2。

圖5為考察不同研磨時間的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖，橫坐標(biāo)為不同研磨時間，單位s，縱坐標(biāo)為峰面積，單位單位mau·s。圖中，1、2、3、4、5分別代表溫郁金中不同的揮發(fā)油類成分，分別為：1：莪術(shù)二酮；2：莪術(shù)醇；3：吉馬酮；4：呋喃二烯；5：β-欖香烯。

圖6為考察不同種類洗脫劑的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖，橫坐標(biāo)為不同種類洗脫劑，縱坐標(biāo)為峰面積，單位單位mau·s。圖中，1、2、3、4、5分別代表溫郁金中不同的揮發(fā)油類成分，分別為：1：莪術(shù)二酮；2：莪術(shù)醇；3：吉馬酮；4：呋喃二烯；5：β-欖香烯。a、b、c、d、e、f代表不同的洗脫液，分別為：a：甲醇、b：乙醇、c：乙腈、d：丙酮、e：乙酸乙酯、f:甲醇-乙醇(50:50)、g:甲醇-水(50:50)。

圖7為考察不同體積洗脫劑的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖，橫坐標(biāo)為洗脫劑體積，單位ml，縱坐標(biāo)為峰面積，單位mau·s。圖中，1、2、3、4、5分別代表溫郁金中不同的揮發(fā)油類成分，分別為：1：莪術(shù)二酮；2：莪術(shù)醇；3：吉馬酮；4：呋喃二烯；5：β-欖香烯。

圖8為考察不同濃度表面活性劑sds的微乳液電泳毛細(xì)管色譜分離效果折線圖。圖中橫坐標(biāo)為sds濃度，單位g/ml，縱坐標(biāo)為保留時間，單位min。

圖9為考察不同種類輔助表面活性劑(甲醇、乙醇、正丁醇、異丙醇或正丙醇)的微乳液電泳毛細(xì)管色譜分離效果疊加圖。圖中，a、b、c、d、e分別代表不同的輔助表面活性劑的混合對照品電泳圖，分別為：a：甲醇；b：異丙醇；c：乙醇；d：正丙醇；e：正丁醇。

圖10為考察不同濃度輔助表面活性劑正丁醇的微乳液電動毛細(xì)管色譜分離效果折線圖。圖中，1、2、3、4、5分別代表溫郁金中不同的揮成分，分別為：1：莪術(shù)二酮；2：莪術(shù)醇；3：吉馬酮；4：呋喃二烯；5：β-欖香烯。圖中橫坐標(biāo)為正丁醇濃度，單位g/ml，縱坐標(biāo)為保留時間，單位min。

圖11為考察不同種類油相(環(huán)己烷、正辛烷、正庚烷、正己烷、二氯甲烷或乙酸乙酯)的微乳液電泳毛細(xì)管色譜分離效果疊加圖。圖中，a、b、c、d、e、f分別代表不同的輔助表面活性劑的混合對照品電泳圖，分別為：a：乙酸乙酯；b：正己烷；c：二氯甲烷；d：環(huán)己烷；e：正庚烷；f：正辛烷。

圖12為考察不同濃度緩沖溶液的微乳液電動毛細(xì)管色譜分離效果折線圖。圖中，1、2、3、4、5分別代表溫郁金中不同的揮成分，分別為：1：莪術(shù)二酮；2：莪術(shù)醇；3：吉馬酮；4：呋喃二烯；5：β-欖香烯。圖中橫坐標(biāo)為硼砂濃度，單位mmol/l，縱坐標(biāo)為保留時間，單位min。

圖13為溫郁金混合對照品的色譜圖。圖中，1、2、3、4、5分別代表溫郁金中不同的揮發(fā)油類成分，分別為：1：莪術(shù)二酮；2：莪術(shù)醇；3：吉馬酮；4：呋喃二烯；5：β-欖香烯。

圖14為不同提取方法提取的溫郁金提取液的疊加色譜圖。圖中，1、2、3、4、5分別代表溫郁金中不同的有效成分，分別為：1：莪術(shù)二酮；2：莪術(shù)醇；3：吉馬酮；4：呋喃二烯；5：β-欖香烯。圖中，a、b分別代表經(jīng)不同提取方法得到的溫郁金4提取液的毛細(xì)管電泳色譜圖，分別為：a：超聲提??；b：固相基質(zhì)分散萃取(以溫郁金4為例)。

圖15為8種不同批次溫郁金來源藥材的有效成分提取液的疊加色譜圖。圖中，1、2、3、4、5分別代表溫郁金中不同的有效成分，分別為：1：莪術(shù)二酮；2：莪術(shù)醇；3：吉馬酮；4：呋喃二烯；5：β-欖香烯。圖中，a、b、c、d、e、f、g、h分別代表不同批溫郁金的毛細(xì)管電泳色譜圖，分別為：a：片姜黃1；b：溫莪術(shù)1；c：溫莪術(shù)2；d：片姜黃2；e：溫郁金1；f：溫郁金2；g：溫郁金3；h：溫郁金4。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

本發(fā)明實(shí)施例所用溫郁金來源的藥材粉末根據(jù)中國藥典2015年版制備。

本發(fā)明實(shí)施例所用固相萃取小柱為3ml柱管，材質(zhì)為pp，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

本發(fā)明實(shí)施例所用小柱篩板規(guī)格為3ml，材質(zhì)為pe，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

本發(fā)明實(shí)施例所用分子篩ts-1孔徑為0.56-0.58nm，硅鈦比20-300：1，bet比表面積(m²/g)≥350，相對結(jié)晶度(％)≤95，灼減(5)≤5，優(yōu)選購自南京吉倉納米科技有限公司。

本發(fā)明實(shí)施例所用硅藻土sio2·nh2o，優(yōu)選購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

本發(fā)明實(shí)施例所用中性al2o3，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

本發(fā)明實(shí)施例所用硅膠msio2·nh2o，優(yōu)選購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

本發(fā)明實(shí)施例所用c18，購自上海正亞化工有限公司。

本發(fā)明實(shí)施例所用不同種類分子篩，購自南京吉倉納米科技有限公司。

溫郁金對照品混合液的制備方法具體步驟為：分別精密稱取適量莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、呋喃二烯、β-欖香烯對照品，用甲醇混合溶解定容至1ml容量瓶中，制成上述各種對照品終濃度分別為0.678mg/ml、0.164mg/ml、0.500mg/ml、4.100mg/ml、0.817mg/ml的對照品混合液。

實(shí)施例1吸附劑的選擇

平行稱取9份溫郁金藥材粉末各200mg分別加入5組研缽中，并稱取不同種類的吸附劑(分子篩ts-1、硅藻土、中性al2o3、硅膠、c18、分子篩mcm-48、分子篩sba-15、分子篩sapo-11、分子篩zcm-5)各200mg，分別加入9組研缽中與溫郁金藥材粉末研磨150s。取9支3ml規(guī)格固相萃取柱，底部均加入篩板，分別用研磨好的固體填充萃取柱，將填料填實(shí)后頂部均加入篩板。取1.0ml甲醇，注入萃取柱內(nèi)，采用注射器適當(dāng)加壓，對萃取柱進(jìn)行洗脫，底部用1.5ml規(guī)格離心管收集洗脫液，洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)洗脫液揮干甲醇，用250μl電泳運(yùn)行緩沖液復(fù)溶，用0.22μm濾膜過濾后，用高效毛細(xì)管電泳儀(hpce)檢測分析。

實(shí)施例所用儀器為agilent7100毛細(xì)管電泳儀(dad檢測器、控溫裝置、自動進(jìn)樣器)。毛細(xì)管柱：未涂層石英毛細(xì)管(56cm×50μm,i.d.,河北永年銳豐色譜器件有限公司)。

電泳運(yùn)行緩沖液：配制10ml含sds0.013g、正丁醇0.05g、乙酸乙酯0.005g、乙腈1ml的10mmol/l硼砂緩沖液(ph9.0)的電泳運(yùn)行緩沖液；壓力進(jìn)樣：50mbar，3s；運(yùn)行電壓25kv；檢測溫度25℃；檢測波長215nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1，表1中的數(shù)據(jù)為峰面積(單位：mau·s)。

表1不同吸附劑提取的揮發(fā)油有效成分峰面積(單位mau·s)

1代表莪術(shù)二酮、2代表莪術(shù)醇、3代表吉馬酮、4代表呋喃二烯、5代表β-欖香烯。

不同種類吸附劑的固相萃取效果柱狀圖如圖3所示。結(jié)果顯示，分子篩ts-1的富集效果較優(yōu)?？赡苡捎诜肿雍Y相對其他幾種傳統(tǒng)的吸附劑具有孔徑細(xì)小和高比表面積的優(yōu)異性能，能夠更好地吸附溫郁金中的倍半萜類成分。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較而言，分子篩ts-1的提取效果相對較好。

實(shí)施例2吸附劑用量的選擇

平行稱取5份溫郁金藥材粉末各200mg分別加入5組研缽中，并稱取不同質(zhì)量(50mg、100mg、200mg、300mg、400mg)的分子篩ts-1，分別加入5組研缽中與溫郁金藥材粉末研磨150s。取5支3ml規(guī)格固相萃取柱，底部均加入篩板，分別用研磨好的固體填充萃取柱，將填料填實(shí)后頂部均加入篩板。取1.0ml甲醇，注入萃取柱內(nèi)，采用注射器適當(dāng)加壓，對萃取柱進(jìn)行洗脫，底部用1.5ml規(guī)格離心管收集洗脫液，洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)洗脫液揮干甲醇，用250μl電泳運(yùn)行緩沖液復(fù)溶，用0.22μm濾膜過濾后，用高效毛細(xì)管電泳儀(hpce)檢測分析，同實(shí)施例1，橫坐標(biāo)表示溫郁金與吸附劑的比值，縱坐標(biāo)表示峰面積(單位mau·s)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2不同吸附劑量提取的揮發(fā)油有效成分峰面積(單位mau·s)

1代表莪術(shù)二酮、2代表莪術(shù)醇、3代表吉馬酮、4代表呋喃二烯、5代表β-欖香烯。

不同的藥材與分子篩之間質(zhì)量比例，對基質(zhì)固相分散萃取效果的影響如圖4所示。隨著分子篩加入量的增大，基質(zhì)固相分散萃取的效果逐步增大，直到藥材和分子篩質(zhì)量比例為1:1時達(dá)到最佳，后隨著分子篩加入量的增大，分子篩的效果趨向飽和，萃取效果趨于平緩甚至略有下降?？赡艿脑蚴请S著吸附劑用量增加，能更好的吸附混合固體中的活性成分，但活性成分可吸附的總量有限，吸附劑用量達(dá)到最優(yōu)后，過多的吸附劑會導(dǎo)致活性成分從吸附劑中解吸困難，反而影響萃取效果。

實(shí)施例3研磨時間選擇

平行稱取4份溫郁金藥材粉末各200mg分別加入4組研缽中，并稱取4份200mg分子篩ts-1，分別加入4組研缽中與溫郁金藥材粉末研磨不同的時間(90s、120s、150s、180s)。取4支3ml規(guī)格固相萃取柱，底部均加入篩板，分別用研磨好的固體填充萃取柱，將填料填實(shí)后頂部均加入篩板。取1.0ml甲醇，注入萃取柱內(nèi)，采用注射器適當(dāng)加壓，對萃取柱進(jìn)行洗脫，底部用1.5ml規(guī)格離心管收集洗脫液，洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)洗脫液揮干甲醇，用250μl電泳運(yùn)行緩沖液復(fù)溶，用0.22μm濾膜過濾后，用高效毛細(xì)管電泳儀(hpce)檢測分析，同實(shí)施例1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。

表3不同研磨時間獲得的揮發(fā)油有效成分峰面積(單位mau·s)

1代表莪術(shù)二酮、2代表莪術(shù)醇、3代表吉馬酮、4代表呋喃二烯、5代表β-欖香烯。

不同研磨時間下的基質(zhì)固相分散萃取效果折線圖見圖5。結(jié)果顯示，隨著研磨時間增長，萃取效果變好，可能由于時間變久能將藥材粉末和分子篩更加充分的混勻，使得活性成分更好地被吸附到分子篩中。研磨時間大于150s后，基質(zhì)固相分散萃取的效果趨于平緩，可能原因是兩者混合程度在150s處達(dá)到飽和，溫郁金中活性成分已經(jīng)基本被分子篩完全吸附，再增加研磨時間，不會增加萃取效果，反而稍微下降，因?yàn)榛钚猿煞直贿^度吸附到分子篩的孔道中，變得難以洗脫下來。

實(shí)施例4不同種類洗脫劑的選擇

平行稱取7份溫郁金藥材粉末各200mg分別加入7組研缽中，并稱取7份200mg分子篩ts-1，分別加入7組研缽中與溫郁金藥材粉末研磨150s。取7支3ml規(guī)格固相萃取柱，底部均加入篩板，分別用研磨好的固體填充萃取柱，將填料填實(shí)后頂部均加入篩板。取1ml不同種類洗脫劑(甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、甲醇—乙醇(50:50，v/v)、甲醇-水(50:50，v/v))，分別注入萃取柱內(nèi)，采用注射器適當(dāng)加壓，對萃取柱進(jìn)行洗脫，底部用1.5ml規(guī)格離心管收集洗脫液，洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)洗脫液揮干甲醇，用250μl電泳運(yùn)行緩沖液復(fù)溶，用0.22μm濾膜過濾后，用高效毛細(xì)管電泳儀(hpce)檢測分析，同實(shí)施例1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4。

表4為不同種類洗脫劑提取的揮發(fā)油有效成分峰面積(單位mau·s)

1代表莪術(shù)二酮、2代表莪術(shù)醇、3代表吉馬酮、4代表呋喃二烯、5代表β-欖香烯。

不同種類洗脫劑的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖見圖6。結(jié)果顯示，甲醇的富集效果較優(yōu)，這可能與溶劑的穿透能力及待測成分的極性等因素相關(guān)，溫郁金中倍半萜類成分極性較小，但甲醇的穿透能力較其他溶劑更強(qiáng)，綜合比較這7類溶劑，甲醇的效果最佳。

實(shí)施例5洗脫劑用量的選擇

平行稱取4份溫郁金藥材粉末各200mg分別加入4組研缽中，并稱取4份200mg分子篩ts-1，分別加入4組研缽中與溫郁金藥材粉末研磨150s。取4支3ml規(guī)格固相萃取柱，底部均加入篩板，分別用研磨好的固體填充萃取柱，將填料填實(shí)后頂部均加入篩板。取不同體積(500μl、1000μl、1500μl、2000μl)的甲醇，分別注入萃取柱內(nèi)，采用注射器適當(dāng)加壓，對萃取柱進(jìn)行洗脫，底部用1.5ml規(guī)格離心管收集洗脫液，洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)洗脫液揮干甲醇，用250μl電泳運(yùn)行緩沖液復(fù)溶，0.22μm濾膜過濾后，用高效毛細(xì)管電泳儀(hpce)檢測分析，同實(shí)施例1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5。

表5不同洗脫劑用量下?lián)]發(fā)油有效成分峰面積(單位mau·s)

1代表莪術(shù)二酮、2代表莪術(shù)醇、3代表吉馬酮、4代表呋喃二烯、5代表β-欖香烯。

不同體積洗脫劑的基質(zhì)固相分散萃取效果折現(xiàn)圖如圖7所示。結(jié)果顯示，洗脫液體積低于1000μl時，未能充分將分子篩中的活性成分洗脫下來，而當(dāng)體積增大至1000μl時，已可將目標(biāo)物質(zhì)洗脫完全。隨著洗脫劑量的繼續(xù)增加，萃取效果基本達(dá)到平緩狀態(tài)，綜合考慮，洗脫液最優(yōu)體積為1000μl。

實(shí)施例6表面活性劑濃度的選擇

將實(shí)施例1中電泳運(yùn)行緩沖液改為分別配制10ml含不同濃度sds0.013～0.018g、正丁醇0.05g、乙酸乙酯0.005g、乙腈1ml的10mmol/l硼砂緩沖液(ph9.0)的電泳運(yùn)行緩沖液。經(jīng)超聲20min后形成微乳液，使用毛細(xì)管電泳儀考察不同的sds濃度對溫郁金藥材中五種揮發(fā)油成分分離的影響，其他操作同實(shí)施例1(分子篩ts-1)。

不同濃度表面活性劑sds的微乳液電動毛細(xì)管色譜分離效果折線圖如圖8所示。結(jié)果顯示，各個組分的遷移時間隨著sds濃度的增加而增加，因?yàn)閟ds濃度增加，使緩沖液離子強(qiáng)度增加，電滲流減小，微乳液滴的個數(shù)增加，從而使各組分的遷移時間隨之延長。但當(dāng)sds過低時，微乳液滴的穩(wěn)定性下降，峰形相對較差，基線不穩(wěn)。同時，在所試驗(yàn)的sds濃度范圍內(nèi)，溫郁金的五種組分之間的分離度基本不改變，即5種成分之間并不能通過改變sds的濃度實(shí)現(xiàn)分離度的提高。最終選擇sds最佳濃度為1.3％。

實(shí)施例7輔助表面活性劑種類的選擇

將實(shí)施例1中電泳運(yùn)行緩沖液改為分別配制10ml含不同種類輔助表面活性劑的電泳運(yùn)行緩沖液，組成為：0.013g/mlsds、0.05g/ml(甲醇、乙醇、正丁醇、正丙醇、異丙醇)、0.005g/ml乙酸乙酯、0.1ml/ml乙腈的10mmol/l硼砂緩沖液(ph9.0)的電泳運(yùn)行緩沖液，經(jīng)超聲20min后形成微乳液，采用毛細(xì)管電泳儀在壓力進(jìn)樣：50mbar，3s；運(yùn)行電壓25kv；檢測溫度25℃；檢測波長215nm條件下考察不同種類的輔助表面活性劑對溫郁金藥材中五種揮發(fā)油成分分離的影響，其他操作同實(shí)施例1(分子篩ts-1)。

不同種類輔助表面活性劑(甲醇、乙醇、正丁醇、正丙醇、異丙醇)的微乳液電動毛細(xì)管色譜分離效果疊加圖如圖9所示，結(jié)果顯示，正丁醇為最佳輔助表面活性。圖9中，a、b、c、d、e分別代表不同輔助表面活性劑的毛細(xì)管電泳分離效果圖，分別為：a：甲醇；b：正丙醇；c：異丙醇；d：乙醇；e：正丁醇。

實(shí)施例8輔助表面活性劑濃度的選擇

將實(shí)施例1中電泳運(yùn)行緩沖液改為分別配制10ml含不濃度正丁醇的運(yùn)行緩沖液，組成為：0.013g/mlsds、(0.034g/ml、0.042g/ml、0.05g/ml、0.058g/ml、0.066g/ml)正丁醇、0.005g/ml乙酸乙酯、0.1ml/ml乙腈的10mmol/l硼砂緩沖液(ph9.0)的電泳運(yùn)行緩沖液，經(jīng)超聲20min后形成微乳液，采用毛細(xì)管電泳儀在壓力進(jìn)樣：50mbar，3s；運(yùn)行電壓25kv；檢測溫度25℃；檢測波長215nm條件下考察不同的正丁醇濃度對溫郁金藥材中五種揮發(fā)油成分分離的影響。其他操作同實(shí)施例1(分子篩ts-1)。

不同濃度輔助表面活性劑正丁醇的微乳液電動毛細(xì)管色譜分離效果折線圖如圖10所示，結(jié)果顯示，5種成分中莪術(shù)二酮遷移時間基本穩(wěn)定，莪術(shù)醇、吉馬酮和呋喃二烯隨著正丁醇濃度的增加遷移時間有明顯的增加趨勢，直至正丁醇濃度為0.05g/ml。繼續(xù)加大正丁醇濃度，四種揮發(fā)油類成分遷移時間有減少的趨勢。整體來看，隨著正丁醇濃度增加，遷移時間窗口增大，分離度也逐漸增加。但正丁醇濃度過高會降低微乳體系的穩(wěn)定性，產(chǎn)生破乳?？紤]到遷移時間以及微乳液體系的穩(wěn)定性和對實(shí)際樣品的分離情況，綜合考慮最終選定正丁醇濃度為0.05g/ml。

實(shí)施例9油相種類的選擇

將實(shí)施例1中電泳運(yùn)行緩沖液改為分別配制10ml含不同種類油相的電泳運(yùn)行緩沖液，組成為：0.013g/mlsds、0.05g/ml正丁醇、0.005g/ml(乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、環(huán)己烷、正庚烷、正辛烷)、0.1ml/ml乙腈的10mmol/l硼砂緩沖液(ph9.0)的電泳運(yùn)行緩沖液，經(jīng)超聲20min后形成微乳液，采用毛細(xì)管電泳儀在壓力進(jìn)樣：50mbar，3s；運(yùn)行電壓25kv；檢測溫度25℃；檢測波長215nm條件下考察不同種類的油相對溫郁金藥材中五種揮發(fā)油成分分離的影響，其他操作同實(shí)施例1(分子篩ts-1)。

不同種類油相(乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、環(huán)己烷、正庚烷、正辛烷)的微乳液電動毛細(xì)管色譜分離效果疊加圖如圖11所示，結(jié)果顯示，乙酸乙酯為較優(yōu)。

圖11中，a、b、c、d、e、f分別代表不同油相的毛細(xì)管電泳分離效果圖，分別為：a：環(huán)己烷；b：正辛烷；c：正庚烷；d：正己烷；e：二氯甲烷；f：乙酸乙酯。

實(shí)施例10硼砂濃度的選擇

將實(shí)施例1中電泳運(yùn)行緩沖液改為分別配制10ml含不同濃度硼砂的電泳運(yùn)行緩沖液，組成為：0.013g/mlsds、0.05g/ml正丁醇、0.005g/ml乙酸乙酯、0.1ml/ml乙腈的(5mmol/l、10mmol/l、15mmol/l、20mmol/l)硼砂緩沖液(ph9.0)的電泳運(yùn)行緩沖液，經(jīng)超聲20min后形成微乳液，采用毛細(xì)管電泳儀在壓力進(jìn)樣：50mbar，3s；運(yùn)行電壓25kv；檢測溫度25℃；檢測波長215nm條件下考察不同的硼砂濃度對溫郁金藥材中五種揮發(fā)油成分分離的影響。其他操作同實(shí)施例1(分子篩ts-1)。

不同濃度硼砂的微乳電動毛細(xì)管色譜分離效果折線圖如圖12所示，結(jié)果顯示，幾種揮發(fā)油類成分均隨著硼砂濃度的增大遷移時間增大，同時兩組分的分離度也有逐漸增大的趨勢，當(dāng)緩沖溶液濃度達(dá)到10mmol/l時，五種揮發(fā)油類組分已達(dá)到分離。因此，實(shí)驗(yàn)選擇了在最短時間內(nèi)各組分彼此都能得到有效分離的硼砂濃度為10mmol/l作為緩沖液體系中緩沖溶液的濃度。

實(shí)施例11最優(yōu)微乳液條件

在最佳電泳運(yùn)行緩沖液：含0.013g/mlsds、0.05g/ml正丁醇、0.005g/ml乙酸乙酯、0.1ml/ml乙腈的10mmol/l硼砂緩沖液(ph9.0)的電泳運(yùn)行緩沖液10ml；最佳檢測條件：壓力進(jìn)樣：50mbar，3s；運(yùn)行電壓25kv；檢測溫度25℃；檢測波長215nm。采用實(shí)施例1方法(ts-1做吸附劑)對溫郁金對照品混合液進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，獲得對照品混合液的電泳圖譜(圖13)，結(jié)果表明，5種有效成分之間分離度均>1.5，且在40min以內(nèi)全部出峰。確定了該檢測條件的可實(shí)施性。

實(shí)施例12不同提取方法的比較

為進(jìn)一步探究以分子篩ts-1作吸附劑的固相基質(zhì)萃取法的對溫郁金倍半萜成分的提取效率，對其與超聲提取法做了比較。固相基質(zhì)萃取法提取溫郁金倍半萜的操作同實(shí)施例1(ts-1做吸附劑，以表12中溫郁金4為例)。超聲提取法提取溫郁金倍半萜的操作如下：精密稱量溫郁金藥材粉末2.0g置于燒杯中，并準(zhǔn)確量取甲醇10ml浸沒藥材粉末；置于超聲波清洗儀超聲20min后補(bǔ)足重量。取上清液1ml于離心管，揮干甲醇內(nèi)后用250μl電泳運(yùn)行緩沖液復(fù)溶，過0.22μm濾膜后，用高效毛細(xì)管電泳儀(hpce)檢測分析。對經(jīng)兩種不同提取方法的溫郁金提取液進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，獲得不同提取方法的電泳圖譜疊加圖。

不同提取方法的溫郁金提取液電泳疊加圖如圖14所示，結(jié)果顯示，倍半萜類成分在基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)下能更充分地提取出來，確定了基質(zhì)固相分散技術(shù)對溫郁金來源藥材中倍半萜類成分提取的可行性。

1代表莪術(shù)二酮、2代表莪術(shù)醇、3代表吉馬酮、4代表呋喃二烯、5代表β-欖香烯。

實(shí)施例13

1、參照實(shí)施例1操作，在最佳提取條件：溫郁金來源藥材藥材粉末200mg、分子篩ts-1為200mg(按質(zhì)量比，樣品：分子篩1:1)、研磨時間為150s、洗脫劑類型為甲醇、洗脫劑體積為1000μl，最佳電泳運(yùn)行緩沖液條件：含0.013g/mlsds、0.05g/ml正丁醇、0.005g/ml乙酸乙酯、0.1ml/ml乙腈的10mmol/l硼砂緩沖液(ph9.0)的電泳運(yùn)行緩沖液10ml；壓力進(jìn)樣：50mbar，3s；運(yùn)行電壓25kv；檢測溫度25℃；檢測波長215nm。采用實(shí)施例1方法，對8個不同批次的溫郁金(收集信息如表12所示)提取液進(jìn)行微乳電動毛細(xì)管色譜分離分析，其他操作同實(shí)施例1，獲得不同樣品的色譜圖。

8種不同批次溫郁金來源的藥材(溫郁金、溫莪術(shù)和片姜黃)5種倍半萜類成分提取液的含量測定結(jié)果如表11，不同批次溫郁金來源藥材的電泳疊加譜圖如圖15。結(jié)果表明，8種不同批次的溫郁金來源藥材中5種目標(biāo)成分在含量上有所不同，同一批次片姜黃和溫莪術(shù)中揮發(fā)油類成分含量相對較高，而溫郁金中揮發(fā)油類成分相對較低，不同批次溫郁金中揮發(fā)油類成分含量也有一定差別。推測與藥材的不同藥用部位及藥材的加工方法相關(guān)。這一研究為更好控制溫郁金藥材的內(nèi)在質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：

分別精密稱取莪術(shù)二酮對照品6.78mg、莪術(shù)醇對照品1.64mg、吉馬酮對照品5.00mg、呋喃二烯對照品41.00mg和β-欖香烯對照品8.17mg，用甲醇溶解并定容至5ml，配制成含莪術(shù)二酮1.356mg/ml、莪術(shù)醇0.328mg/ml、吉馬酮1.00mg/ml、呋喃二烯8.20mg/ml、β-欖香烯1.634mg/ml的混合對照品儲備液，備用。分別精密量取混合對照品儲備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9μl于1ml容量瓶，用電泳運(yùn)行緩沖液定容至刻度。在最佳檢測條件下，對上述莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、呋喃二烯和β-欖香烯的混合對照品儲備液進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。以分析物的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、呋喃二烯和β-欖香烯的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢測限如下表6。

表6各成分制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

3、重復(fù)性考察

稱取溫郁金過篩粉末200mg，分子篩ts-1為200mg，加入研缽中研磨150s，取3ml規(guī)格固相萃取柱，底部加入篩板，用研磨好的固體填充萃取柱，將填料填實(shí)后頂部再加入篩板。取1.0ml甲醇，注入萃取柱內(nèi)，對萃取柱進(jìn)行洗脫。底部用1.5ml離心管收集。洗脫結(jié)束后揮干甲醇，取電泳運(yùn)行緩沖液250μl復(fù)溶。按照上述方法平行制樣6個，在最佳檢測條件下考察其重復(fù)性，其他操作同實(shí)施例1，結(jié)果見表7。

表7五種倍半萜類組分保留時間及峰面積(單位mau·s)

4、精密度試驗(yàn)

稱取溫郁金過篩粉末200mg，分子篩ts-1為200mg，加入研缽中研磨150s，取3ml規(guī)格固相萃取柱，底部加入篩板，用研磨好的固體填充萃取柱，將填料填實(shí)后頂部再加入篩板。取1.0ml甲醇，注入萃取柱內(nèi)，對萃取柱進(jìn)行洗脫。底部用1.5ml離心管收集。洗脫結(jié)束后揮干甲醇，取電泳運(yùn)行緩沖液250μl復(fù)溶。在一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其保留時間和峰面積，考察日內(nèi)精密度。在連續(xù)三天內(nèi)進(jìn)樣6次，記錄保留時間和峰面積，考察日間精密度，采用步驟1的條件及實(shí)施例1檢測方法，結(jié)果見表8。

表8五種倍半萜類組分保留時間及峰面積(單位mau·s)

5、穩(wěn)定性考察

稱取溫郁金過篩粉末200mg，分子篩ts-1為200mg，加入研缽中研磨150s，取3ml規(guī)格固相萃取柱，底部加入篩板，用研磨好的固體填充萃取柱，將填料填實(shí)后頂部再加入篩板。取1.0ml甲醇，注入萃取柱內(nèi)，對萃取柱進(jìn)行洗脫。底部用1.5ml離心管收集。洗脫結(jié)束后揮干甲醇，取電泳運(yùn)行緩沖液250μl復(fù)溶。得到溫郁金供試品溶液，室溫放置0、4、8、12、24h后，在最佳檢測條件下進(jìn)行ce分析，采用步驟1的條件及實(shí)施例1檢測方法，測定5種揮發(fā)油的峰面積。莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、呋喃二烯、β-欖香烯在不同時間保留時間和峰面積的rsd結(jié)果見表9。

表9五種倍半萜類組分保留時間及峰面積(單位mau·s)

6、加樣回收率考察

(1)稱取溫郁金藥材粉末200mg與200mg分子篩ts-1混合研磨150s。取1支3ml規(guī)格固相萃取柱，底部均加入篩板，分別用研磨好的固體填充萃取柱，將填料填實(shí)后頂部均加入篩板。取1.0ml甲醇進(jìn)行洗脫，底部用1.5ml離心管收集。洗脫結(jié)束后揮干甲醇，取電泳運(yùn)行緩沖液250μl復(fù)溶。經(jīng)過0.22μm濾膜過濾，得到空白溫郁金提取液。

(2)分別精密稱取莪術(shù)二酮對照品1.054mg、莪術(shù)醇對照品0.3mg、吉馬酮對照品0.422mg、呋喃二烯對照品9.42mg和β-欖香烯對照品0.7mg，用甲醇溶解并定容至1ml，配成莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、呋喃二烯、β-欖香烯終濃度分別為1.05mg/ml、0.3mg/ml、0.42mg/ml、9.42mg/ml、0.70mg/ml的混合對照品溶液，備用。

(3)精密稱取溫郁金樣品100mg，共6份，在步驟1的最佳提取條件下進(jìn)行提取并得到其甲醇洗脫液。精密量取混合對照品溶液100μl分別加入6份提取液中，揮干甲醇后用250μl電泳運(yùn)行緩沖液復(fù)溶，經(jīng)過0.22μm濾膜過濾，得到加標(biāo)溫郁金對照品提取液。

在最佳檢測條件下(步驟1所示)，對空白溫郁金提取液及加標(biāo)溫郁金對照品提取液進(jìn)樣分析，根據(jù)其峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、呋喃二烯、β-欖香烯的加標(biāo)回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表10。

表10加樣回收率考察結(jié)果(n＝6)

表11不同溫郁金來源藥材種倍半萜類成分含量測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表12不同溫郁金來源藥材收集信息表

綜合以上結(jié)果，本發(fā)明中應(yīng)用了一種比常規(guī)方法更快速且綠色環(huán)保的溫郁金來源藥材中倍半萜類成分提取及含量測定方法。本方法將基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)和微乳液電動毛細(xì)管色譜技術(shù)結(jié)合，分子篩作為基質(zhì)固相分散萃取的吸附劑與基質(zhì)固相分散混合物中的倍半萜類成分吸附結(jié)合，使得目標(biāo)分子從復(fù)雜基質(zhì)中分離出來，得到含有目標(biāo)分子的洗脫液。洗脫液采用meekc進(jìn)行分離檢測。本發(fā)明在一個微量體系中實(shí)施，相比藥典提取方法，有機(jī)溶劑使用量大大減少，安全，經(jīng)濟(jì)，環(huán)保，操作過程簡單，分析時間短，且可用于實(shí)際藥材的分析，為溫郁金來源的藥材中倍半萜類成分的定量分析提供了一種可靠的方法。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。