本發(fā)明涉及藥物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種藥物組合物的檢測方法。
背景技術(shù)：
：貫葉金絲桃已經(jīng)有2400年的使用歷史，近年來對貫葉金絲桃的研究熱點放在抗抑郁功效方面含有多種具生物活性的化學(xué)成分，其中主要是苯并二蒽酮類化合物、金絲桃素和偽金絲桃素；多種蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、間苯三酚類化合物等；其中以蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素為主要化合物?，F(xiàn)代藥理證明，蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素等均對在小鼠fst中均表現(xiàn)出明顯的抗抑郁活性，是貫葉金絲桃抗抑郁癥的主要活性成分。舒肝解郁膠囊是由貫葉金絲桃和刺五加為原料，采用現(xiàn)代制藥工藝制備而成的中成藥，具有疏肝解郁、健脾安神的功效，臨床常用于輕、中度抑郁癥屬肝郁脾虛證者，癥見情緒低落、興趣下遲滯、入睡困難、早醒、多夢、緊張不安、急躁易怒、食少納呆、胸悶、疲乏無力、多汗、疼痛、舌苔白或膩，脈弦或細。由于舒肝解郁膠囊同時包含了貫葉金絲桃和刺五加兩種藥材的多種化學(xué)成分，包括：金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、刺五加苷e、紫丁香苷及異嗪皮啶等，在定性和定量檢測中常?；ハ喔蓴_，同時由于貫葉金絲桃提取物中主要活性物質(zhì)金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素母核結(jié)構(gòu)相同、性質(zhì)相似，要利用hplc方法準確將目標物質(zhì)同其他雜質(zhì)有效分離并且定量分析存在較大難度，成方制劑的質(zhì)量控制更為困難?！吨袊幍?2015版)》和韓林等所介紹的高效液相色譜檢測方法[金絲桃苷含量的rp-hplc法測定，時珍國醫(yī)國藥2012年第23卷第10期]均無法檢測出槲皮素；例如錢秋霞等所報道的方法[錢秋霞等，hplc法測定不同干燥方法的貫葉連翹中黃酮類化合物的含量，中草藥,2001，32,5]其分離度達不到分離要求(分離度一般要求大于1.5)，其主要物質(zhì)峰中還包含大量雜質(zhì)。因此，建立一種簡單、有效、靈敏度高的多成分高效液相色譜檢測方法，對于貫葉金絲桃及含有貫葉金絲桃的成方制劑的質(zhì)量控制和檢測來說具有十分重要的意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的技術(shù)問題之一是針對含有貫葉金絲桃的藥物組合物，如何快速、有效且能準確的檢測有效成分，從而更好的控制藥物組合物質(zhì)量，為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了下述技術(shù)方案：本發(fā)明一方面提供一種藥物組合物檢測方法，該方法包括以下步驟：取適量藥物組合物制備成供試品溶液，利用液相色譜法對其進行檢測，其中所述液相色譜的色譜條件為：色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相a為乙腈，流動相b為0.1％磷酸溶液，檢測波長為360nm，采用梯度洗脫；其中所述藥物組合物為含有貫葉金絲桃提取物的藥物組合物。本發(fā)明提供的藥物組合物的檢測方法，其所述的梯度洗脫條件優(yōu)選為：本發(fā)明提供的藥物組合物的檢測方法，其中所述液相色譜檢測條件中，柱溫優(yōu)選為30-35℃，更優(yōu)選為30℃；流速優(yōu)選為0.8-1.2ml/min，更優(yōu)選為1.0ml/min。本發(fā)明提供的藥物組合物的檢測方法，其中所述供試品溶液的制備方法優(yōu)選為，取適量藥物組合物，用含醇溶液溶解，提取，過濾，即得；其中所述含醇溶液為含有60％或以上的甲醇或乙醇的溶液；更優(yōu)選為60％乙醇溶液；所述提取方法優(yōu)選為超聲提取。上述供試品溶液的制備方法優(yōu)選含有如下步驟：取藥物組合物適量，研細，稱取約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，稱定重量，超聲提取，放冷，再稱定重量，用60％乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。上述含貫葉金絲桃的藥物組合物中活性成分優(yōu)選為貫葉金絲桃和刺五加制備而成；更優(yōu)選為舒肝解郁膠囊。本發(fā)明所使用的色譜柱為常規(guī)的以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，如c18(2)5um250x4.6mm、shimadzuvp-ods(250×4.6mm,5μm)、agilentc18(250×4.6mm,5μm)、phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)、phenomenexlunac18(150×4.6mm,5μm)等；以規(guī)格為250×4.6mm,5μm效果更優(yōu)。本發(fā)明通過考察二極管陣列檢測器(dad檢測器檢測)檢測含有貫葉金絲桃提取物的藥物組合物(如舒肝解郁膠囊內(nèi)容物)時，獲知吸收波長在254nm、300nm和360nm附近均出現(xiàn)吸收峰值，其中檢測波長為254nm時，梯度基線漂移大；檢測波長為300nm時，各目標物質(zhì)峰的吸收度較小；檢測波長為360nm時，背景以及其它雜峰干擾小，且出峰結(jié)果穩(wěn)定，檢測效果最佳。本發(fā)明申請人考察了柱溫對含有貫葉金絲桃提取物的藥物組合物(如舒肝解郁膠囊內(nèi)容物)檢測效果的影響，包括25℃、30℃、35℃等不同溫度，結(jié)果顯示30℃、35℃均能達到較好的分離效果，30℃的分離效果最佳。本發(fā)明申請人考察流速對含有貫葉金絲桃提取物的藥物組合物(如舒肝解郁膠囊內(nèi)容物)檢測效果的影響，包括0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min等不同流速，結(jié)果顯示，各目標物質(zhì)峰均能達到較好的分離效果，其中流速為1.0ml/min的分離效果最優(yōu)。本發(fā)明藥物組合物在制備成供試品溶液時，其提取方式可以采用常規(guī)提取方法如：超聲、回流、振搖等提取方式，其中超聲提取效果更優(yōu)。針對提取液考察發(fā)現(xiàn)含醇溶液如甲醇、60％甲醇、乙醇、60％乙醇溶液用以提取含有貫葉金絲桃提取物的藥物組合物(如舒肝解郁膠囊內(nèi)容物)，都能達到提取效果，其中60％乙醇溶液提取的效果更好。本發(fā)明申請人還進一步考察了當(dāng)藥物組合物為0.2g時，提取溶劑量對提取含有貫葉金絲桃提取物的藥物組合物(如舒肝解郁膠囊內(nèi)容物)的影響，當(dāng)利用10ml、25ml、50ml、75ml、100ml的60％乙醇溶液時，結(jié)果顯示，上述提取溶劑量均能實現(xiàn)提取目的，其中提取溶劑用量為25-100ml時[即所述藥物組合物與含醇溶液的質(zhì)量體積比(g/ml)為0.2:25-100]提取效果更優(yōu)；當(dāng)提取溶劑用量為25ml[即所述藥物組合物與含醇溶液的質(zhì)量體積比(g/ml)為0.2:25]提取效果最好。本發(fā)明更進一步提供一種藥物組合物的檢測方法，其包含以下步驟：1)、供試品溶液的制備：取舒肝解郁膠囊內(nèi)容物，研細，稱取約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，稱定重量，超聲提取，放冷，再稱定重量，用60％乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；2)、對照品溶液的制備：取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含蘆丁80μg、金絲桃苷60μg、異槲皮苷60μg、槲皮素80μg的混合溶液，即得；3)、含量檢測：取對照品和供試品溶液各10μl注入液相色譜柱，進行檢測，其中色譜條件為：色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相a為乙腈，流動相b為0.1％磷酸溶液，檢測波長為360nm，柱溫為30℃，流速為1.0ml/min，梯度洗脫條件如下：本發(fā)明所提供的藥物組合物檢測方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下顯著優(yōu)勢：1、檢測時間合理，目標物質(zhì)出峰時間短，大大提高了樣品的檢測效率；2、分離度好，基線波動不大，背景干擾小，能夠準確檢測供試樣品中的成分；3、通過對該藥物組合物測定方法重復(fù)性、回收率、線性等發(fā)明考察，結(jié)果顯示該檢測方法穩(wěn)定性高，重復(fù)性好，線性好，回收率高。附圖說明圖1對比例1中供試品的高效液相色譜圖，其中1為蘆丁，2為金絲桃苷，3為異槲皮苷，4為槲皮素，5為萹蓄苷，6為槲皮苷；圖2對比例2供試品的高效液相色譜圖；圖3對比例3供試品的高效液相色譜圖；圖4對比例4供試品的高效液相色譜圖；圖5對比例5貫葉金絲桃提取物的高效液相色譜圖；圖6對比例6貫葉金絲桃提取物的高效液相色譜圖；圖7實施例1供試品的高效液相色譜圖；圖8實施例2供試品的高效液相色譜圖；圖9實施例3供試品的高效液相色譜圖；圖10實施例4供試品的高效液相色譜圖；圖11實施例5供試品的高效液相色譜圖；圖12實施例6供試品的高效液相色譜圖；圖13實施例7供試品的高效液相色譜圖；圖14實施例8供試品的高效液相色譜圖；圖15實施例9多批樣品的的高效液相色譜圖；具體實施方式本發(fā)明通過以下實施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進一步的詳細說明，該說明并不能用于限制本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明采用的試劑皆為普通市售品，皆可于市場購得。其中，高效液相色譜儀，(agilent1100、agilent1200，美國安捷倫公司)；agilentchemstation化學(xué)工作站；十萬分之一電子天平(bp-211d，德國賽多利斯sartorius)；超聲波清洗器(kq250de，昆山市儀器有限公司)；超純水機(uphw-ⅱ-90t，四川優(yōu)普超純水科技有限公司)；乙腈色譜級，美國fisher公司；磷酸為分析純，成都科龍化學(xué)試劑有限公司；超純水；對照品：蘆丁，供含量測定用，91.9％，批號100080-201409；金絲桃苷，供含量測定用，92.5％，批號111521-201406；異槲皮苷，供含量測定用，92.9％，批號111809-201403；槲皮素，供含量測定用，99.1％，批號100081-201408)；槲皮苷，供含量測定用，98％，批號111538-201105)。上述對照品均購自于中國食品藥品檢定研究院。萹蓄苷，供含量測定用，98％，購于上?？祈樕锟萍加邢薰尽悠罚菏娓谓庥裟z囊(成都康弘藥業(yè)集團股份有限公司委托四川濟生堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，生產(chǎn)批號(150405、150416、150509、150518、150614、150619、150712、150727、150817、150824)。分離度(r)檢測方法：分離度(r)為相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。r越大，表明相鄰兩組分分離越好。一般說當(dāng)r<1時，兩峰有部分重疊；當(dāng)r＝1.0時，分離度可達98％；當(dāng)r＝1.5時，分離度可達99.7％。通常用r＝1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標志。當(dāng)r＝1時，稱為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4％，內(nèi)側(cè)峰基重疊約2％。r＝1.5時，稱為6σ分離，裸露峰面積為99.7％。r≥1.5稱為完全分離。根據(jù)《中國藥典》規(guī)定，r應(yīng)大于1.5。分離度(r)計算公式如下：r＝2(tr2-tr1)/(w1+w2)tr2:相鄰兩峰中后一峰的保留時間；tr1:相鄰兩峰中前一峰的保留時間；w1、w2:此相鄰兩峰的峰寬對比例11)供試品溶液制備：取舒肝解郁膠囊內(nèi)容物，研細，稱取約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，稱定重量，超聲提取，放冷，再稱定重量，用60％乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；2)對照品溶液制備：取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷和槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含蘆丁80μg、金絲桃苷60μg、異槲皮苷60μg、槲皮素80μg、萹蓄苷10μg和槲皮苷5μg的混合溶液，即得；3)含量檢測：供試品溶液10μl注入液相色譜柱，進行檢測。其中色譜條件：色譜柱為phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)；以乙腈-0.1％磷酸溶液(16：84)為流動相；檢測波長為360nm；理論板數(shù)按金絲桃苷峰計算應(yīng)不低于3000；按照上述方法進行高效液相色譜檢測，結(jié)果如圖1所示。根據(jù)圖1結(jié)果可知，無法檢測出槲皮素。對比例2色譜條件：色譜柱為ywg-c18(250×4.6mm,5μm,天津特納科學(xué)儀器有限公司)，流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液(70:30，v/v),流速：1.0ml/min,檢測波長370nm,柱溫：室溫。供試品溶液和對照品溶液制備如對比例1。按照上述方法進行高效液相色譜檢測，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)圖2結(jié)果可知，蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素4個色譜峰全部重疊在一起，無法有效分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素等成分。對比例3色譜條件：色譜柱為agilentzorbaxsb-c18(250×4.6mm,5μm,)；流動相乙腈-0.1％磷酸溶液(15：85)，流速1.2ml/min，檢測波長256nm,柱溫35℃，進樣量20μl.在該色譜條件下，理論板數(shù)按金絲桃苷峰計算不低于3000，分離度大于1.5；供試品溶液和對照品溶液制備如對比例1。按照上述方法進行高效液相色譜檢測，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)圖3結(jié)果可知，無法檢測出槲皮素。對比例4色譜條件：色譜柱為：shim-pack，clc-ods(150*6.0mm，5μm，日本島津)，檢測波長254nm流動相為：流動相a：水(用磷酸調(diào)解ph3.1-3.5)，流動相b：乙腈，并按照如下洗脫程序進行梯度洗脫：時間(分鐘)流動相a％流動相b％0-28821828-35703035-40604040-506040供試品溶液和對照品溶液制備如對比例1。按照上述方法進行高效液相色譜檢測，結(jié)果如圖4所示。根據(jù)圖4結(jié)果可知，異槲皮苷的分離度小于1.5，且槲皮素的檢測基線有漂浮。對比例5貫葉金絲桃提取物的制備：貫葉金絲桃提取物的制備(常規(guī)工藝)：1800克貫葉金絲桃加70％乙醇加入多功能提取罐回流提取2次，第一次加入10倍的量(體積重量比)，第二次加入8倍的量(體積重量比)，每次1小時，合并提取液，濾過，濾液濃縮至三效節(jié)能濃縮器相對密度為1.10(70℃)，在高速離心噴干機噴霧干燥得到貫葉金絲桃提取物。供試品溶液和對照品溶液制備如對比例1。色譜條件：色譜柱為：shim-pack，clc-ods(150*6.0mm，5μm，日本島津)，檢測波長254nm流動相為：流動相a：水(用磷酸調(diào)解ph3.1-3.5)，流動相b：乙腈，并按照如下洗脫程序進行梯度洗脫：時間(分鐘)流動相a％流動相b％0-28821828-35703035-40604040-506040按照上述方法進行高效液相色譜檢測，結(jié)果如圖5所示。根據(jù)圖5結(jié)果可知，異槲皮苷分離度為1.47，無法與金絲桃苷峰完全分離，且槲皮素的檢測基線有漂浮。對比例6貫葉金絲桃提取物的制備：同對比例5供試品溶液和對照品溶液制備：同對比例1。含量檢測：取對照品溶液和供試品溶液各10μl注入液相色譜儀進行檢測，其檢測條件如下：色譜條件：色譜柱為phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)，流動相為：流動相a：乙腈，流動相b：0.1％磷酸，檢測波長為360nm，柱溫為30℃，流速為1.0ml/min；按照下列程序進行梯度洗脫：按照上述方法進行高效液相色譜檢測，結(jié)果如圖6所示。根據(jù)圖6結(jié)果可知，蘆丁保留時間為21.956min，分離度為29.25，金絲桃苷保留時間為24.395min，分離度為2.89，異槲皮苷保留時間為26.255min，分離度為2.07，槲皮素保留時間為36.457，分離度為21.54。其他成分萹蓄苷保留時間為32.432，分離度為11.06，槲皮苷保留時間為32.722，分離度為1.53。以上結(jié)果顯示，該檢測方法快速，能夠準確定量分析。實施例11)供試品溶液制備：取舒肝解郁膠囊內(nèi)容物，研細，取約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，稱定重量，超聲提取，放冷，再稱定重量，用60％乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；2)對照品溶液制備：取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷和槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含蘆丁80μg、金絲桃苷60μg、異槲皮苷60μg、槲皮素80μg、萹蓄苷10μg和槲皮苷5μg的混合溶液，即得；3)含量檢測：取對照品溶液和供試品溶液各10μl注入液相色譜儀進行檢測。其中，色譜條件：流動相為；流動相a：乙腈，流動相b為0.05％磷酸,色譜柱為phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)，按照如下洗脫程序進行梯度洗脫：柱溫：30℃，流速：1.0ml/min；檢測波長為360nm；按照所述方法進行高效液相色譜檢測。結(jié)果如圖7所示,根據(jù)圖7結(jié)果可知，萹蓄苷、槲皮苷的基線較高，且無法有效分離。實施例2色譜條件：流動相為：流動相a：乙腈，流動相b為0.2％磷酸,色譜柱為phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)，按照如下洗脫程序進行梯度洗脫：柱溫：30℃，流速：1.0ml/min；檢測波長為360nm；供試品溶液和對照品溶液制備如實施例1。取對照品溶液和供試品溶液各10μl注入液相色譜儀進行檢測，結(jié)果如圖8所示。根據(jù)圖8結(jié)果可知，萹蓄苷、槲皮苷的基線較高，且無法有效分離。實施例3色譜條件：流動相為：乙腈：0.1％磷酸(25:75)，色譜柱為phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)，柱溫：30℃，流速：1.0ml/min；檢測波長為360nm；供試品溶液和對照品溶液制備如實施例1。取對照品溶液和供試品溶液各10μl注入液相色譜儀進行檢測，結(jié)果如圖9所示。根據(jù)圖9結(jié)果可知，蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的分離度較差，與旁邊的其他峰也無法有效分離，且也無法有效分離萹蓄苷和槲皮苷。實施例4色譜條件：流動相為：乙腈：0.1％磷酸(20:80)，色譜柱為phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)，柱溫：30℃，流速：1.0ml/min；檢測波長為360nm；供試品溶液和對照品溶液制備如實施例1。取對照品溶液和供試品溶液各10μl注入液相色譜儀進行檢測，結(jié)果如圖10所示。根據(jù)圖10結(jié)果可知，金絲桃苷和異槲皮苷的分離度差，未能有效分離，與旁邊的其他峰也無法有效分離。且槲皮素出峰時間接近50min左右，加上色譜柱沖洗時間，整個檢測時間需要耗費更長。實施例5色譜條件：色譜柱為phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)，流動相為：流動相a：乙腈，流動相b：0.1％磷酸，并按照下列程序進行梯度洗脫：柱溫：30℃，流速：1.0ml/min；檢測波長為360nm；供試品溶液和對照品溶液制備如實施例1。取對照品溶液和供試品溶液各10μl注入液相色譜儀進行檢測，結(jié)果如圖11所示。根據(jù)圖11結(jié)果可知，蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷等成分的分離度差，與旁邊的其他峰也無法有效分離。實施例6色譜條件：色譜柱為phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)，流動相為：流動相a：乙腈，流動相b：0.1％磷酸，并按照下列程序進行梯度洗脫：柱溫：30℃，流速：1.0ml/min；檢測波長為360nm；供試品溶液和對照品溶液制備如實施例1。取對照品溶液和供試品溶液各10μl注入液相色譜儀進行檢測，結(jié)果如圖12所示。根據(jù)圖12結(jié)果可知，槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷峰的基線較高，且分離度較差，與旁邊的其他峰也無法有效分離。實施例7色譜條件：色譜柱為phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)，流動相為：流動相a：乙腈，流動相b：0.1％磷酸，并按照下列程序進行梯度洗脫：柱溫：30℃，流速：1.0ml/min；檢測波長為360nm；供試品溶液和對照品溶液制備如實施例1。取對照品溶液和供試品溶液各10μl注入液相色譜儀進行檢測，結(jié)果如圖13所示。根據(jù)圖13結(jié)果可知，蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷等成分的分離度差，未能效分開，且蘆丁與旁邊的其他峰也無法有效分離。實施例81)供試品溶液制備：取舒肝解郁膠囊內(nèi)容物，研細，取約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，稱定重量，超聲提取，放冷，再稱定重量，用60％乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；2)對照品溶液制備：取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含蘆丁80μg、金絲桃苷60μg、異槲皮苷60μg、槲皮素80μg、萹蓄苷10μg和槲皮苷5μg的混合溶液，即得；3)含量檢測：取對照品溶液和供試品溶液各10μl注入液相色譜儀進行檢測，其檢測條件如下：色譜條件：色譜柱為phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)，流動相為：流動相a：乙腈，流動相b：0.1％磷酸，檢測波長為360nm，柱溫為30℃，流速為1.0ml/min；按照下列程序進行梯度洗脫：按照上述方法進行高效液相色譜檢測，結(jié)果如圖14所示。根據(jù)圖14結(jié)果可知，蘆丁保留時間為21.218min，分離度為12.36，金絲桃苷保留時間為23.374min，分離度為2.97，異槲皮苷保留時間為25.208min，分離度為2.37，槲皮素保留時間為36.436，分離度為23.46。其他成分萹蓄苷、槲皮苷等分離度均大于1.5。以上結(jié)果顯示，該檢測方法快速，能夠準確定量分析。實施例9對本發(fā)明所提供的藥物組合物檢測方法進行了以下方法學(xué)實驗驗證。以下方法學(xué)驗證中相對標準偏差(rsd)表示分析測試結(jié)果的精密度，其計算公式為：rsd％＝標準偏差(sd)/計算結(jié)果的算術(shù)平均值(x)該值通常用來表示分析測試結(jié)果的精密度，其中標準偏差(sd):1)供試品溶液制備：取舒肝解郁膠囊內(nèi)容物，研細，取約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，密塞，精密加入60％乙醇25ml，稱定重量，超聲提取，放冷，再稱定重量，用60％乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；2)對照品溶液制備：取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含蘆丁80μg、金絲桃苷60μg、異槲皮苷60μg、槲皮素80μg的混合溶液，即得；3)含量檢測：取對照品溶液和供試品溶液各10μl注入液相色譜儀進行檢測，其檢測條件如下：色譜條件：色譜柱為phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)，流動相為：流動相a：乙腈，流動相b：0.1％磷酸，檢測波長為360nm，柱溫為30℃，流速為1.0ml/min；按照下列程序進行梯度洗脫：線性關(guān)系：取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素混合對照品溶液(其中蘆丁濃度為0.3235mg/ml、金絲桃苷濃度為0.2322mg/ml、異槲皮苷濃度為0.3214mg/ml、槲皮素濃度為0.3439mg/ml)，用移液管精密量取0.5ml、1ml、2.5ml、5ml、10ml到10ml容量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻。按上述色譜條件，分別吸取5μl注入液相色譜儀，測定峰面積。以蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的進樣量(μg)為橫坐標，以蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的峰面積(a)為縱坐標，進行線性回歸，分別得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的標準曲線。結(jié)果表明，各成分在相應(yīng)濃度范圍呈良好線性關(guān)系，線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)參見表1重復(fù)性：取同一批舒肝解郁膠囊樣品(批號：150727)，精密稱定，按上述供試品溶液制備項下方法平行制備供試品溶液6份，按上述色譜條件，進樣測定，記錄色譜圖，計算蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素含量的rsd分別為1.657、1.544、1.586、1.847，均小于2.0％，表明該方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性：分別取(150727、150405、150416、150509、150518、150614、150619、150727、150817、150824)等10個批次舒肝解郁膠囊(成都康弘藥業(yè)集團股份有限公司委托四川濟生堂藥業(yè)有限公司委托生產(chǎn)提供)內(nèi)容物0.2g,按照上述方法進行高效液相色譜檢測。結(jié)果如圖15所示，根據(jù)圖15結(jié)果可知，該檢測方法，穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高?；厥章?取已知含量的舒肝解郁膠囊樣品(批號為150727,每粒裝0.36g)，共6份，每份約0.1g,精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素對照品適量，按上述供試品溶液制備方法，制備加樣回收供試品溶液，按上述色譜條件，進樣測定，記錄色譜圖，計算蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的加樣回收率，結(jié)果見表2。表2回收率測定(n＝6)以上表可以看出，蘆丁的平均回收率為98.33％，rsd％為1.88％，金絲桃苷的平均回收率為100.15％，rsd％為1.45％，異槲皮苷的平均回收率為98.91％，rsd％為1.56％，槲皮素的平均回收率為97.32％，rsd％為2.01％，樣品各個成分的加樣回收率在95％-105％之間，rsd％均小于3.0％，試驗結(jié)果表明加樣回收率良好。當(dāng)前第1頁12