本發(fā)明屬于體外遺傳毒性測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，更具體而言，本發(fā)明涉及1,3-丁二烯的遺傳毒性測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

1,3-丁二烯是一種常見的大氣和環(huán)境污染物，可以通過(guò)吸入途徑誘導(dǎo)多器官腫瘤。此外，1,3-丁二烯環(huán)氧代謝產(chǎn)物可以形成dna加合物，誘導(dǎo)hprt(次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)基因突變等。目前世界衛(wèi)生組織(who)下屬的國(guó)際癌癥研究組織(iarc)已經(jīng)將1,3-丁二烯列為1類致癌物，同時(shí)世界衛(wèi)生組織煙草控制框架公約(fctc)將1,3-丁二烯列為煙氣優(yōu)先級(jí)管制污染物之一。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)1,3-丁二烯氣體對(duì)細(xì)胞dna的損傷，對(duì)于1,3-丁二烯遺傳毒性和危害性評(píng)價(jià)具有較為重要的意義。

dna雙鏈斷裂是dna最嚴(yán)重的一種損傷形式，如果這種損傷不能被正確或者及時(shí)修復(fù)就可能會(huì)導(dǎo)致染色體畸變或者細(xì)胞凋亡等。作為dna雙鏈斷裂的一種生物標(biāo)志物，磷酸化組蛋白γh2ax已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于臨床醫(yī)藥學(xué)、放射學(xué)及毒理學(xué)等研究方面。包括很多單體化合物和混合物通過(guò)γh2ax實(shí)驗(yàn)對(duì)其遺傳毒性進(jìn)行了測(cè)定和評(píng)價(jià)。例如，tanaka等利用γh2ax實(shí)驗(yàn)對(duì)卷煙煙氣冷凝物的遺傳毒性進(jìn)行了檢測(cè)和評(píng)價(jià)；smart等采用γh2ax實(shí)驗(yàn)對(duì)依托泊苷、米托蒽醌及甲基亞硝脲的dna雙鏈斷裂的劑量-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行了研究，并且通過(guò)已知的不同類型遺傳毒性化合物對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。該實(shí)驗(yàn)因其靈敏性高、結(jié)合其他儀器檢測(cè)技術(shù)可以進(jìn)行大規(guī)模分析檢測(cè)，擁有其他遺傳毒性檢測(cè)技術(shù)并不具備的多種優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于化合物和有毒物質(zhì)的遺傳毒性篩選和評(píng)價(jià)。

目前對(duì)γh2ax進(jìn)行分析檢測(cè)的主要方法有流式細(xì)胞儀、elisa(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))、westernblot(蛋白質(zhì)印跡)、顯微鏡技術(shù)等。流式細(xì)胞儀和westernblot操作繁瑣，檢測(cè)前需要將貼壁細(xì)胞酶解成單細(xì)胞懸液，破壞了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完整性，且檢測(cè)通量較低。elisa不能提供細(xì)胞內(nèi)熒光焦點(diǎn)的分布情況且需要額外添加其他檢測(cè)蛋白對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正，而顯微鏡技術(shù)的檢測(cè)通量低，且人為計(jì)數(shù)的誤差較大。

由于技術(shù)和條件的限制，傳統(tǒng)上對(duì)于氣態(tài)類物質(zhì)的暴露和毒性檢測(cè)通常將氣態(tài)物質(zhì)溶解于液體中，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和氣體的接觸暴露，即氣-液混合暴露方式。這種暴露方式雖然對(duì)于很多物質(zhì)有用，但并不是經(jīng)常有效。這是因?yàn)橛行怏w溶解于液體(通常是水)中的溶解度有限，從而限制了暴露濃度的上限；第二，有些氣態(tài)物質(zhì)能和水發(fā)生反應(yīng)，從而間接改變了檢測(cè)目的；第三，氣-液混合暴露雖然對(duì)于懸浮細(xì)胞來(lái)說(shuō)能使溶解于液體基質(zhì)中的氣體與細(xì)胞充分接觸，但是對(duì)于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞很難實(shí)現(xiàn)充分接觸。

氣-液界面暴露系統(tǒng)的發(fā)展極大地避免了傳統(tǒng)的氣-液混合暴露方式存在的問題，極大地提高了貼壁細(xì)胞體外暴露的有效性。因此，氣-液界面系統(tǒng)目前已經(jīng)被廣泛用來(lái)研究揮發(fā)性物質(zhì)或者氣溶膠類物質(zhì)的暴露。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種無(wú)需破壞細(xì)胞、簡(jiǎn)單、有效且靈敏度高的1,3-丁二烯dna損傷的定量檢測(cè)方法，該方法可以采用直接的氣體暴露方式進(jìn)行，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確并且可視化，以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。

本發(fā)明的目的通過(guò)將氣-液界面暴露技術(shù)和高內(nèi)涵檢測(cè)γh2ax技術(shù)相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。具體而言，本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種氣-液界面暴露系統(tǒng)聯(lián)合高內(nèi)涵技術(shù)定量檢測(cè)1,3-丁二烯致細(xì)胞dna損傷的方法，所述方法包括以下步驟：

1)細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞接種在底部為滲透性濾膜的裝置中，然后將所述裝置在細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使細(xì)胞在滲透性濾膜上單層生長(zhǎng)；

2)細(xì)胞染毒：移除所述裝置中的細(xì)胞培養(yǎng)液，取出裝置并置于包含細(xì)胞染毒液和毒性氣體的染毒倉(cāng)中，使得裝置中的滲透性濾膜底部與細(xì)胞染毒液接觸，同時(shí)滲透性濾膜上的細(xì)胞表面暴露于毒性氣體，其中所述毒性氣體包含1,3-丁二烯和空氣；

3)免疫熒光標(biāo)記：從染毒倉(cāng)中取出所述裝置，進(jìn)行細(xì)胞中γh2ax的免疫熒光標(biāo)記與細(xì)胞核的dapi染色；

4)高內(nèi)涵技術(shù)定量檢測(cè)：分別進(jìn)行所述細(xì)胞的細(xì)胞核和γh2ax的熒光測(cè)定，以所識(shí)別的有效細(xì)胞的有效細(xì)胞核內(nèi)檢測(cè)到的平均熒光強(qiáng)度來(lái)表征γh2ax的含量。

優(yōu)選地，所述步驟1)中，所述細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞；更優(yōu)選地，接種時(shí)，所述細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以單細(xì)胞懸液接種于所述裝置中；

更優(yōu)選地，所述細(xì)胞以單細(xì)胞懸液接種于底部為滲透性濾膜的裝置中，然后在細(xì)胞培養(yǎng)液中于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)24h；

優(yōu)選地，關(guān)于本發(fā)明采用的底部為滲透性濾膜的裝置，所述滲透性濾膜為滌綸膜，膜上小孔的孔徑為0.4μm。因此，將所述裝置在細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液可以通過(guò)滲透性濾膜浸沒接種其上的細(xì)胞；

優(yōu)選地，在細(xì)胞接種之前，用細(xì)胞培養(yǎng)液或pbs將所述裝置在37℃下平衡1-2h。

優(yōu)選地，所述步驟2)中，所述染毒倉(cāng)中的細(xì)胞染毒液包含步驟1)中的細(xì)胞培養(yǎng)液，優(yōu)選與步驟1)中的細(xì)胞培養(yǎng)液相同；

優(yōu)選地，所述毒性氣體由空氣與1,3-丁二烯組成；

更優(yōu)選地，所述毒性氣體中1,3-丁二烯的濃度為0-43.98mmol/l、優(yōu)選>0且≤43.98mmol/l，更優(yōu)選8.80-43.98mmol/l；

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述毒性氣體中1,3-丁二烯的濃度可以是0、8.80、17.59、26.39、35.18或43.98mmol/l。

優(yōu)選地，所述毒性氣體的流量為10-50ml/min，優(yōu)選20ml/min，優(yōu)選與毒性氣體接觸≤2h，優(yōu)選1h。染毒倉(cāng)中含有細(xì)胞染毒液，但是滲透性濾膜上的細(xì)胞部分暴露于細(xì)胞染毒液的氣液界面上，從而實(shí)現(xiàn)該暴露部分與染毒倉(cāng)中的毒性氣體接觸。

優(yōu)選地，所述步驟3)包括：

3-1)從染毒倉(cāng)中取出所述裝置，洗滌，然后置于托盤內(nèi)，向裝置內(nèi)的細(xì)胞中加入多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定；

3-2)洗滌所述裝置和托盤，然后向裝置內(nèi)的細(xì)胞中加入triton-100x以使細(xì)胞通透；

3-3)洗滌所述裝置和托盤，然后向裝置內(nèi)的細(xì)胞中加入血清白蛋白封閉，之后加入一抗即抗γh2ax抗體進(jìn)行孵育；

3-4)洗滌所述裝置和托盤，然后向裝置內(nèi)的細(xì)胞中加入免疫熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育；

3-5)洗滌所述裝置和托盤，然后向裝置內(nèi)的細(xì)胞中加入dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)進(jìn)行染色；

3-6)洗滌所述裝置和托盤，保存。

優(yōu)選地，所述步驟4)中，所述細(xì)胞的細(xì)胞核和γh2ax的熒光測(cè)定分別在兩組不同的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下進(jìn)行；

優(yōu)選地，所述步驟3-4)中，免疫熒光標(biāo)記的二抗為alexafluor488標(biāo)記的二抗，并且所述步驟4)中，在通道一中以激發(fā)波長(zhǎng)358nm和發(fā)射波長(zhǎng)461nm進(jìn)行細(xì)胞核的熒光測(cè)定，在通道二中以激發(fā)波長(zhǎng)495nm和發(fā)射波長(zhǎng)519nm進(jìn)行γh2ax的熒光測(cè)定，以獲得通道一所識(shí)別的有效細(xì)胞的有效細(xì)胞核內(nèi)通道二所檢測(cè)的平均熒光強(qiáng)度，由此表征γh2ax的含量；

更優(yōu)選地，在兩個(gè)通道中，測(cè)量倍數(shù)為100倍，每孔分析和測(cè)定9個(gè)視野。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，步驟4)采用高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)進(jìn)行，例如購(gòu)自thermoscientific的型號(hào)為arrayscanvti600的高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)。

任選地，本發(fā)明的方法還包括，設(shè)置在步驟3-3)中沒有加入一抗、僅在步驟3-4)中加入二抗的空白對(duì)照組，從而在步驟4)中得到由非特異吸附引起的空白信號(hào)，由此從檢測(cè)到的熒光測(cè)定信號(hào)中扣除空白信號(hào)。

本發(fā)明的方法還可包括劑量-效應(yīng)曲線的繪制。即，通過(guò)在步驟2)中設(shè)置多種包含不同濃度的1,3-丁二烯的毒性氣體，進(jìn)行所述方法，最后根據(jù)γh2ax的平均熒光強(qiáng)度和1,3-丁二烯的濃度繪制劑量-效應(yīng)曲線。

或者，本發(fā)明的方法還可包括時(shí)間-效應(yīng)曲線的繪制。即，通過(guò)在步驟2)中使細(xì)胞在染毒倉(cāng)中接觸包含相同濃度的1,3-丁二烯的毒性氣體達(dá)不同時(shí)間，進(jìn)行所述方法，最后根據(jù)γh2ax的平均熒光強(qiáng)度和接觸毒性氣體的時(shí)間繪制時(shí)間-效應(yīng)曲線。

優(yōu)選地，所述毒性氣體經(jīng)過(guò)0.2μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)入所述染毒倉(cāng)內(nèi)。在排出時(shí)，所述毒性氣體仍可經(jīng)過(guò)0.2μm濾膜過(guò)濾后排出到排氣管道中。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，在本發(fā)明的方法中采用的底部為滲透性濾膜的裝置與托盤是可商購(gòu)的transwell插件，例如購(gòu)自corning的型號(hào)為3450的transwell插件，裝置為transwell插件頂部，托盤為transwell插件底部。當(dāng)細(xì)胞為人肺癌細(xì)胞株a549時(shí)，可以如下進(jìn)行本發(fā)明的方法：

1)細(xì)胞培養(yǎng)：采用含10％fbs和2mmol/ll-谷氨酰胺的rpmi-1640培養(yǎng)液于37℃、5％co2條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株a549，當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)到70-80％時(shí)，采用0.25％的胰蛋白酶進(jìn)行消化后獲得單細(xì)胞懸液；

接種前，在transwell插件頂部和底部分別加入0.5和2ml的pbs(磷酸鹽緩沖液，ph7.2～7.4；全文同)，于37℃的條件下平衡1-2h；吸棄transwell插件頂部和底部的pbs，于插件頂部加入0.5ml濃度為4×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml的單細(xì)胞懸液，在插件底部加入2ml含有0.01mol/lhepes、2mmol/ll-谷氨酰胺和10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)液；將插件頂部放入底部中，并于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)24h。

2)細(xì)胞染毒：移除transwell插件頂部的培養(yǎng)液，取出transwell插件頂部放入體外暴露裝置的染毒倉(cāng)內(nèi)，使得transwell插件中的滲透性濾膜與細(xì)胞染毒液接觸，滲透性濾膜上的細(xì)胞表面暴露于染毒倉(cāng)中的毒性氣體1h；所述毒性氣體通過(guò)采用空氣將1,3-丁二烯分別稀釋成0、8.80、17.59、26.39、35.18和43.98mmol/l的濃度，流量為20ml/min。

3)免疫熒光標(biāo)記：

3-1)染毒結(jié)束后，從染毒倉(cāng)取出transwell插件頂部，然后在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌兩次，每次至少5min；然后將transwell插件頂部放入底部中，向頂部中加入0.5ml4％的多聚甲醛溶液在室溫下固定15min；

3-2)在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌兩次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5ml0.5％的triton-100x溶液(在pbs中)，在室溫下通透15min；

3-3)在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌兩次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5ml的3％bsa溶液(在pbs中)，于37℃下封閉1h，然后向transwell插件頂部加入0.5ml含有小鼠抗人γh2ax抗體溶液(1:200，v/v)于37℃下恒溫孵育2h；

3-4)在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌三次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5mlalexafluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體溶液(1:200，v/v)于37℃下避光孵育2h；

3-5)在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌三次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入500μl1μg/ml的dapi溶液(在pbs中)在室溫下避光染核10min；

3-6)在transwell插件頂部和底部分別加入2mlpbs洗滌三次后，再分別加入0.5和2mlpbs，4℃避光保存，待測(cè)。

4)高內(nèi)涵技術(shù)定量檢測(cè)：通道一(細(xì)胞核熒光測(cè)定)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為358nm和461nm，通道二(目標(biāo)物γh2ax的熒光測(cè)定)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為495nm和519nm，測(cè)量倍數(shù)為100，每孔分析和測(cè)定9個(gè)視野，以通道一所識(shí)別的有效細(xì)胞的有效細(xì)胞核內(nèi)通道二所檢測(cè)的平均熒光強(qiáng)度表征γh2ax的含量。

5)數(shù)據(jù)處理：設(shè)置在步驟3-3)中沒有加入一抗、僅在步驟3-4)中加入二抗的空白對(duì)照組，在步驟4)中所檢測(cè)信號(hào)即為由非特異吸附引起的空白信號(hào)，從所有樣品測(cè)試孔的檢測(cè)信號(hào)中扣除空白信號(hào)；最后根據(jù)目標(biāo)物γh2ax的熒光強(qiáng)度和1,3-丁二烯的濃度繪制劑量-效應(yīng)曲線。

參見圖1，本發(fā)明提供了一種基于氣-液界面暴露系統(tǒng)和高內(nèi)涵技術(shù)來(lái)定量檢測(cè)1,3-丁二烯致細(xì)胞dna損傷的方法，克服了現(xiàn)有1,3-丁二烯氣體體外染毒和dna損傷檢測(cè)方法的不足。具體而言，本發(fā)明提供了一種評(píng)估染毒毒物為1,3-丁二烯氣體時(shí)所導(dǎo)致的dna雙鏈斷裂情況的方法，其中磷酸化組蛋白γh2ax作為1,3-丁二烯誘導(dǎo)的dna雙鏈斷裂的生物標(biāo)志物，并且采用體外氣-液界面暴露方式實(shí)現(xiàn)了氣態(tài)1,3-丁二烯使細(xì)胞體外染毒的高效和準(zhǔn)確控制，采用高內(nèi)涵技術(shù)對(duì)γh2ax進(jìn)行檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率和靈敏度。在本發(fā)明的方法中，生長(zhǎng)于滲透性濾膜上的貼壁細(xì)胞在氣-液界面暴露系統(tǒng)中暴露1,3-丁二烯后，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色γh2ax和高內(nèi)涵自動(dòng)成像與分析實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞樣本的直接、高通量檢測(cè)。

本發(fā)明的方法具有以下技術(shù)特點(diǎn)：

首先，本發(fā)明的方法確定了指數(shù)期細(xì)胞在滲透性濾膜上單層生長(zhǎng)，從而在與毒性氣體的染毒過(guò)程中，確保了氣體與細(xì)胞能充分接觸，特別是相對(duì)于傳統(tǒng)的氣液混合染毒方式而言，顯著提高了貼壁細(xì)胞的染毒效率；

第二，為減少氣體沖擊對(duì)細(xì)胞活性的影響，本發(fā)明對(duì)不同氣體流量對(duì)細(xì)胞活性的影響進(jìn)行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，不同氣體流量10-50ml/min形成的沖擊對(duì)細(xì)胞的存活率均無(wú)明顯的影響(p>0.05)，如圖2所示，確保了在這一流量范圍內(nèi)細(xì)胞能有效存活，進(jìn)而保證染毒效果。結(jié)合暴露倉(cāng)體積及染毒氣體對(duì)環(huán)境的影響，本發(fā)明優(yōu)選采用20ml/min的氣體流量作為最終的染毒流量。并且，本發(fā)明還對(duì)1,3-丁二烯的使用濃度與染毒時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法還具有如下優(yōu)良效果：

1)用氣-液界面暴露方式替代了傳統(tǒng)的氣-液混合暴露方式，由此提高了貼壁細(xì)胞與1,3-丁二烯的接觸效率，進(jìn)而提升了染毒的有效性和準(zhǔn)確性；

2)檢測(cè)前無(wú)需破壞細(xì)胞，也無(wú)需酶解制備單細(xì)胞懸液或提取蛋白，所以樣本處理更為簡(jiǎn)單和快捷；

3)高內(nèi)涵技術(shù)具有高分辨率的成像獲取功能，因此γh2ax在細(xì)胞核內(nèi)的分布可直接觀測(cè)，且圖像資料也便于存儲(chǔ)以備再分析；

4)通過(guò)細(xì)胞核識(shí)別，可對(duì)每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)熒光標(biāo)記的γh2ax進(jìn)行定量分析，所以檢測(cè)結(jié)果更為靈敏和準(zhǔn)確。

附圖說(shuō)明

以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：

圖1示出了本發(fā)明方法的流程圖。

圖2示出了不同氣體流量對(duì)細(xì)胞存活率的影響。

圖3示出了1,3-丁二烯誘導(dǎo)a549細(xì)胞產(chǎn)生γh2ax的劑量-效應(yīng)曲線，其中染毒倉(cāng)中的細(xì)胞染毒液沒有添加代謝活化系統(tǒng)大鼠肝s9。

圖4示出了1,3-丁二烯誘導(dǎo)a549細(xì)胞產(chǎn)生γh2ax的劑量-效應(yīng)曲線，其中染毒倉(cāng)中的細(xì)胞染毒液添加代謝活化系統(tǒng)大鼠肝s9。

圖5示出了1,3-丁二烯誘導(dǎo)a549細(xì)胞產(chǎn)生γh2ax的時(shí)間-效應(yīng)曲線。

具體實(shí)施方式

以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥品原料、試劑材料等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。

一抗：小鼠抗人γh2ax抗體，購(gòu)自biolegend，貨號(hào)613402；

使用時(shí)配制成溶液：取100μl小鼠抗人γh2ax抗體加入1％的bsa溶液中，1:200(v/v)稀釋，充分混勻。

二抗：alexafluro488標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體，購(gòu)自武漢珈源量子點(diǎn)公司，貨號(hào)ym002；

使用時(shí)配制成溶液：取100μlalexafluro488標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體加入pbs溶液中，1:200(v/v)稀釋，充分混勻。

大鼠肝s9溶液：購(gòu)自moltox，貨號(hào)11-101.1。

使用時(shí)配制成10％s9混合物：由4體積溶液a、60體積溶液b、16體積溶液c、10體積溶液d與10體積大鼠肝s9溶液混合而成，其中溶液a含有0.2mol/l的mgcl2和0.825mol/l的kcl；溶液b含有0.176mol/l的na2h2po4和0.024mol/l的nah2po4；溶液c含有0.025mol/l的nadp。溶液d含有0.05mol/l的葡萄糖-6-磷酸鹽；溶液a-d均采用去離子水配制。

transwell插件：購(gòu)自corning，型號(hào)3450。

高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)，購(gòu)自thermoscientific，型號(hào)arrayscanvti600。

細(xì)胞暴露系統(tǒng)，購(gòu)自北京慧榮和，型號(hào)hrh-ces3969。

實(shí)施例1

在細(xì)胞染毒液中沒有添加代謝活化系統(tǒng)大鼠肝s9時(shí)，測(cè)定1,3-丁二烯暴露1h后誘導(dǎo)的γh2ax。

在transwell插件頂部和底部分別加入0.5和2ml的pbs，于37℃的條件下平衡1-2h。吸棄transwell插件頂部和底部的pbs，于插件頂部加入0.5ml濃度為4×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的a549細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，在插件底部加入2ml含有0.01mol/lhepes、2mmol/ll-谷氨酰胺和10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)液，并于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)24h。

移除transwell插件頂部的培養(yǎng)液，取出transwell插件頂部放入細(xì)胞暴露系統(tǒng)的染毒倉(cāng)內(nèi)，使得transwell插件中的滲透性濾膜與細(xì)胞染毒液(同樣為含有0.01mol/lhepes、2mmol/ll-谷氨酰胺和10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)液)接觸，滲透性濾膜上的細(xì)胞表面暴露于染毒倉(cāng)中的毒性氣體，其中毒性氣體由1,3-丁二烯與空氣組成，1,3-丁二烯的濃度分別為0、8.80、17.59、26.39、35.18和43.98mmol/l，于37℃的條件下染毒1h，氣體流量為20ml/min。

染毒結(jié)束后，從染毒倉(cāng)取出transwell插件頂部，在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌兩次，每次至少5min；然后將transwell插件頂部放入底部中，頂部加入0.5ml4％的多聚甲醛溶液在室溫下固定15min；在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌兩次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5ml0.5％的triton-100x溶液(在pbs中)，在室溫下通透15min；在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌兩次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5ml的3％bsa溶液(在pbs中)，于37℃下封閉1h，然后向transwell插件頂部加入0.5ml含有小鼠抗人γh2ax抗體溶液(1:200，v/v)于37℃下恒溫孵育2h；在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌三次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5mlalexafluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體溶液(1:200，v/v)于37℃下避光孵育2h；在transwell插件頂部和底部分別加入1mlpbs洗滌三次，每次至少5min，然后向transwell插件頂部加入0.5ml1μg/ml的dapi溶液(在pbs中)在室溫下避光染核10min；在transwell插件頂部和底部分別加入2mlpbs洗滌三次后，于頂部和底部分別加入0.5和2mlpbs，4℃避光保存，待測(cè)。

設(shè)置高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)的通道一(細(xì)胞核熒光測(cè)定)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為358nm和461nm，設(shè)置通道二(目標(biāo)物γh2ax的熒光測(cè)定)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為495nm和519nm，測(cè)量倍數(shù)為100倍，每孔分析和測(cè)定9個(gè)視野，γh2ax的含量以通道一所識(shí)別的有效細(xì)胞的有效細(xì)胞核內(nèi)通道二所檢測(cè)的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行表征。

試驗(yàn)中設(shè)置空白對(duì)照組，即沒有加入一抗，僅加入熒光標(biāo)記的二抗抗體，所檢測(cè)信號(hào)即為由非特異吸附引起的空白信號(hào)；所有樣品測(cè)試孔的檢測(cè)信號(hào)應(yīng)扣除空白信號(hào)；最后根據(jù)目標(biāo)物γh2ax的熒光強(qiáng)度和1,3-丁二烯的濃度繪制劑量-效應(yīng)曲線。

圖3所示為不同濃度的1,3-丁二烯在染毒1h后誘導(dǎo)a549細(xì)胞產(chǎn)生的γh2ax的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線。由圖可知，隨著1,3-丁二烯的濃度增大，a549細(xì)胞產(chǎn)生的γh2ax逐漸增多，呈現(xiàn)出顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)1,3丁二烯的濃度為80％(35.18mmol/l)時(shí)，其誘導(dǎo)的γh2ax超過(guò)正常組(即1,3-丁二烯濃度為0時(shí))的1.5倍。

實(shí)施例2

在細(xì)胞染毒液中添加代謝活化系統(tǒng)大鼠肝s9時(shí)，測(cè)定1,3-丁二烯暴露1h后誘導(dǎo)的γh2ax。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照實(shí)施例1所述進(jìn)行，唯一的區(qū)別是，在染毒倉(cāng)中的細(xì)胞染毒液為細(xì)胞培養(yǎng)液與10％s9混合物的混合液，使得細(xì)胞染毒液中含有1％s9混合物。

圖4所示為染毒培養(yǎng)液中添加1％s9后，不同濃度的1,3-丁二烯在誘導(dǎo)a549細(xì)胞產(chǎn)生的γh2ax的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線，與圖3所示結(jié)果基本相同。

細(xì)胞染毒液中添加s9可以增強(qiáng)1,3-丁二烯在體外的代謝轉(zhuǎn)化。由于1,3-丁二烯是一種前遺傳毒性物質(zhì)，因此添加體外代謝活化系統(tǒng)s9可以避免體外測(cè)試中由于細(xì)胞代謝能力的不足而導(dǎo)致的測(cè)試結(jié)果為假陰性的可能。因此，通過(guò)添加和不添加s9可以更準(zhǔn)確地了解1，3-丁二烯在體外對(duì)細(xì)胞dna損傷的誘導(dǎo)，并由此證明了本發(fā)明的方法是客觀、可用的。

實(shí)施例3

在細(xì)胞染毒液中沒有添加代謝活化系統(tǒng)大鼠肝s9時(shí)，測(cè)定35.18mmol/l1,3-丁二烯分別暴露15、30、45、60和90min后誘導(dǎo)的γh2ax。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照實(shí)施例1所述進(jìn)行，唯一的區(qū)別是，1,3-丁二烯的染毒濃度固定在濃度35.18mmol/l，染毒時(shí)間分別為0、15、30、45、60和90min。

圖5所示為35.18mmol/l的1,3-丁二烯在染毒0、15、30、45、60和90min后誘導(dǎo)a549細(xì)胞產(chǎn)生的γh2ax的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系曲線。由圖可知，隨著染毒時(shí)間增加，a549細(xì)胞產(chǎn)生的γh2ax逐漸增多，呈現(xiàn)出顯著的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)染毒時(shí)間超過(guò)60min時(shí)，其誘導(dǎo)的γh2ax超過(guò)正常組的1.5倍。

以上對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。