本實(shí)用新型涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體的，本實(shí)用新型涉及檢測(cè)樣品中CRP的芯片和試劑盒。
背景技術(shù)：
C反應(yīng)蛋白(CRP)于1930年被蒂利特和弗朗西斯最早從肺炎球菌肺炎感染病人身上發(fā)現(xiàn)。這種蛋白分子量為118kDa，其天然結(jié)構(gòu)由五個(gè)非共價(jià)鍵合和的相同亞基構(gòu)成。目前，CRP的已被公認(rèn)為感染或炎癥的早期指標(biāo)，同時(shí)也被認(rèn)為是許多疾病的通用生物標(biāo)記物。由于這些疾病開始發(fā)生時(shí)，體內(nèi)的CRP濃度非常低，10nM或甚至pM水平，這就要求所使用的分析方法必須具有高度靈敏度、選擇性，而且還需具備速度快，使用最小的樣品消耗等特點(diǎn)。
因此，在滿足這些要求下，靈敏地分析生物體液中CRP的水平對(duì)于診斷和監(jiān)測(cè)化療/ 個(gè)性化醫(yī)療干預(yù)的進(jìn)展至關(guān)重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本實(shí)用新型是基于發(fā)明人對(duì)以下問題和事實(shí)的發(fā)現(xiàn)而提出的：
當(dāng)前，臨床檢測(cè)CRP的主要有免疫層析、免疫比濁、酶聯(lián)免疫和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。免疫層析技術(shù)發(fā)展成熟、檢測(cè)快速、無需專業(yè)技術(shù)人員參與，但是其檢測(cè)靈敏度較低，通常只能用于定性或半定量檢測(cè)，其主要應(yīng)用在對(duì)靈敏度和特異性要求不是很高的快速體外診斷檢測(cè)項(xiàng)目中。免疫比濁法操作簡單，檢測(cè)速度快、定量效果佳、專業(yè)技能要求低，但是其靈敏度不高，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用廣度。酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)成本低，技術(shù)成熟，但其檢測(cè)時(shí)間長，檢測(cè)靈敏度不高，在西方發(fā)達(dá)國家基本已被淘汰。化學(xué)發(fā)光屬于一種自發(fā)光的檢測(cè)技術(shù)，靈敏度高，目前化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)在我國三甲醫(yī)院已經(jīng)廣泛使用，然而其通常需要昂貴復(fù)雜的大型設(shè)備，且每次只能檢測(cè)一項(xiàng)指標(biāo)，是單通量的檢測(cè)方法，其在檢測(cè)單個(gè)樣品中多項(xiàng)指標(biāo)時(shí)需耗費(fèi)多倍的時(shí)間、樣品和費(fèi)用。蛋白芯片是近十幾年來伴隨著基因芯片迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)。它通過微電子技術(shù)及表面化學(xué)技術(shù)把各種蛋白質(zhì)高密度、有序地排列在固相支持物表面，然后通過探針蛋白特異性地捕獲樣品中的靶蛋白，并運(yùn)用相應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性、定量分析，是一種新的高通量分析技術(shù)。蛋白芯片技術(shù)具有樣品耗費(fèi)少、高通量的優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的多目標(biāo)檢測(cè)方式。然而，傳統(tǒng)的蛋白芯片檢測(cè)靈敏度低，限制了它在醫(yī)療診斷中的應(yīng)用。
而表面等離子體光子學(xué)是將表面等離子體技術(shù)應(yīng)用到光子學(xué)領(lǐng)域而發(fā)展出來的一門新的學(xué)科。經(jīng)科學(xué)家特殊設(shè)計(jì)的等離子體納米顆粒可以在外界光的作用下發(fā)生共振，從而可作為一個(gè)有效的光學(xué)納米天線捕獲更多的光信號(hào)，這種特殊的物理現(xiàn)象可被應(yīng)用于熒光增強(qiáng)。
本實(shí)用新型利用等離子體基底制備等離子體熒光增強(qiáng)CRP檢測(cè)芯片，并將其應(yīng)用到臨床血液檢測(cè)中。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，所制備的等離子體熒光增強(qiáng)CRP芯片可以實(shí)現(xiàn)采集指尖血全血或血清的檢測(cè)，血液樣本體積只需1uL?？梢酝瑫r(shí)實(shí)現(xiàn)超敏CRP和常規(guī)CRP的全程檢測(cè)，檢測(cè)范圍0.2-160mg/L,其檢測(cè)時(shí)間≤15min，同時(shí)所得到的結(jié)果與現(xiàn)有常用的臨床 CRP檢測(cè)方法(免疫比濁法)具有良好的相關(guān)性。
基于此，在本實(shí)用新型的第一方面，本實(shí)用新型提出了一種檢測(cè)樣品中CRP的芯片。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述芯片包括：基底；負(fù)載層，所述負(fù)載層形成在所述基底的表面，并且所述負(fù)載層是由等離子體納米金屬顆粒形成的；捕獲層，所述捕獲層形成在所述負(fù)載層的上表面，所述捕獲層攜帶有第一CRP捕獲抗體，所述第一CRP捕獲抗體特異性針對(duì)所述CRP。利用根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片，能夠高靈敏、快速檢測(cè)樣品中的CRP。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述樣品可以全血樣品或血清樣品。利用根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片，對(duì)樣品中CRP的檢測(cè)靈敏度可低至0.2mg/L，檢測(cè)范圍為0.2～160mg/L，對(duì)樣品的用量要求可低至1μL，而檢測(cè)時(shí)間相比于現(xiàn)有技術(shù)大幅縮短，檢測(cè)用時(shí)可控制在15min 以內(nèi)，并且可實(shí)現(xiàn)對(duì)CRP的高通量檢測(cè)。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述檢測(cè)樣品中CRP的芯片還可以進(jìn)一步包括如下附件技術(shù)特征至少之一：
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述負(fù)載層為等離子體納米金層或等離子體納米銀層。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述負(fù)載層包括多個(gè)非連續(xù)的金島。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述金島由等離子體納米金顆粒形成，金島可以在外界光的作用下發(fā)生共振，可作為一個(gè)有效的光學(xué)納米天線捕獲更多的光信號(hào)，從而對(duì)熒光信號(hào)起到增強(qiáng)作用。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述多個(gè)金島在所述基底的外表面平均分布，并且所述金島的島面積為100～100000nm2。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述金島的島面積為15000～60000nm2。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述負(fù)載層的厚度為10～500nm。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述負(fù)載層的厚度為10～200nm。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述負(fù)載層的厚度為10～70nm。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述多個(gè)非連續(xù)的金島中相鄰兩個(gè)金島的距離為1～100nm納米之間。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述多個(gè)非連續(xù)的金島中相鄰兩個(gè)金島的距離為5～50nm。多個(gè)金島中相鄰兩個(gè)金島的距離在5～50nm之間，進(jìn)而可有效提高金顆粒間的局部電場(chǎng)，進(jìn)而有效增強(qiáng)熒光分子的激發(fā)。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述基底是由玻璃、硅片或塑料形成的。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述基底是由玻璃形成的。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，玻璃基底具有光學(xué)透明的特性，有利于熒光檢測(cè)，且玻璃基底表面容易進(jìn)行化學(xué)修飾，方便操作。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述捕獲層包括多個(gè)捕獲印斑。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，當(dāng)采用本實(shí)用新型的芯片檢測(cè)樣品中的CRP時(shí)，捕獲層以捕獲印斑的形式設(shè)置，捕獲印斑捕獲CRP抗原后，再與攜帶近紅外熒光染料標(biāo)記的檢測(cè)抗體(第二CRP抗體)反應(yīng)形成免疫三明治結(jié)構(gòu)，此時(shí)，檢測(cè)抗體上的近紅外熒光信號(hào)可在等離子熒光增強(qiáng)作用下放大約 100倍，從而極大地增加對(duì)CRP檢測(cè)的靈敏度。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述多個(gè)捕獲印斑呈圓形，并且所述圓形的直徑為10微米～1厘米。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述圓形的直徑為300微米～500微米。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述捕獲層進(jìn)一步攜帶有雞IgY抗體，并且所述雞IgY抗體、所述第一CRP捕獲抗體分別設(shè)置在不同的捕獲印斑上。在本申請(qǐng)的實(shí)施例中，設(shè)置有第一CRP捕獲抗體的捕獲印斑被稱為CRP檢測(cè)印斑，設(shè)置有雞IgY抗體的捕獲印斑被稱為參考印斑。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，在檢測(cè)血液樣品中的CRP實(shí)驗(yàn)中，可通過羊抗雞 IgY抗體與雞IgY抗體的特異性結(jié)合，進(jìn)而獲得可作為參考印斑上的熒光值，從而通過檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)CRP樣品，獲得CRP檢測(cè)印斑點(diǎn)上的熒光值與參考印斑上的熒光值的比值，以標(biāo)準(zhǔn)CRP樣品的濃度為橫坐標(biāo)，比值為縱坐標(biāo)，繪制“CRP濃度-比值”的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在檢測(cè)待測(cè)樣品中CRP濃度時(shí)，可依據(jù)獲得的CRP檢測(cè)印斑點(diǎn)上的熒光值與參考印斑上的熒光值的比值，對(duì)應(yīng)“CRP濃度-比值”的標(biāo)準(zhǔn)曲線，精確獲得待測(cè)樣品中CRP的濃度。利用根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片檢測(cè)樣品中的CRP，可減少干擾，提高定量檢測(cè)準(zhǔn)確性。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述捕獲印斑是利用微量點(diǎn)樣儀采用0.5～2微摩爾/升的濃度的抗體溶液進(jìn)行打印形成的。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，采用的微量點(diǎn)樣儀能夠?qū)⒌谝?CRP捕獲抗體精確地與負(fù)載層進(jìn)行結(jié)合固定，進(jìn)而能夠精確控制第一CRP捕獲抗體的點(diǎn)樣量、點(diǎn)樣斑點(diǎn)的大小，進(jìn)而對(duì)CRP的檢測(cè)更加準(zhǔn)確。根據(jù)實(shí)用新型的實(shí)施例，所述第一 CRP捕獲抗體與負(fù)載層的連接方式為物理吸附。
在本實(shí)用新型的第二方面，本實(shí)用新型提出了一種檢測(cè)樣品中CRP的芯片。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述芯片包括：玻璃基底；負(fù)載層，所述負(fù)載層形成在所述玻璃基底的外表面的至少一部分，并且所述負(fù)載層由多個(gè)金島構(gòu)成，所述多個(gè)金島在所述玻璃基底的外表面間隔設(shè)置，并且所述金島是由等離子體納米金顆粒形成的，所述多個(gè)金島在所述玻璃基底的外表面平均分布，所述多個(gè)金島中相鄰兩個(gè)的間距為5～50nm，所述金島的厚度為 10～70nm；捕獲層，所述捕獲層形成在所述多個(gè)金島的至少一個(gè)上，并且所述捕獲層攜帶第一CRP捕獲抗體，所述捕獲層是由多個(gè)間隔設(shè)置的捕獲印斑構(gòu)成的，并且一個(gè)捕獲印斑至少在一個(gè)所述金島的上表面，所述捕獲印斑呈圓形，所述圓形的直徑為300微米～500微米，任選地，所述第一CRP捕獲抗體特異性針對(duì)所述CRP。任選地，所述捕獲層進(jìn)一步攜帶雞IgY抗體，并且所述雞IgY抗體、所述第一CRP捕獲抗體分別設(shè)置在不同的捕獲印斑上，任選地，所述捕獲印斑是利用GeSim Nano-Plotter TM 2.1點(diǎn)樣儀采用0.5～2微摩爾/升的濃度的抗體溶液進(jìn)行打印形成的。利用根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片，能夠快速、高靈敏度地檢測(cè)樣品中的CRP。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述樣品可以是全血樣品或血清樣品。利用根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片，對(duì)樣品中預(yù)定抗原CRP的檢測(cè)靈敏度可低至 0.2mg/L，檢測(cè)范圍為0.2～160mg/L，對(duì)樣品的用量要求可低至1uL，而檢測(cè)時(shí)間相比于現(xiàn)有技術(shù)大幅縮短，檢測(cè)用時(shí)可控制在15min以內(nèi)，并且可實(shí)現(xiàn)對(duì)CRP的高通量檢測(cè)。
在本實(shí)用新型的第三方面，本實(shí)用新型提出了一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中CRP的試劑盒。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述試劑盒包括前面所述的檢測(cè)樣品中CRP的芯片以及任選的第二抗體容器，所述第二抗體容器中設(shè)置有第二CRP檢測(cè)抗體，所述第二CRP檢測(cè)抗體特異性針對(duì)所述CRP，并且所述第二CRP檢測(cè)抗體具有近紅外熒光染料標(biāo)記。利用根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的試劑盒，對(duì)樣品中預(yù)定抗原CRP的檢測(cè)靈敏度可低至0.2mg/L，檢測(cè)范圍為 0.2～160mg/L，對(duì)樣品的用量要求可低至1μL，而檢測(cè)時(shí)間相比于現(xiàn)有技術(shù)大幅縮短，檢測(cè)用時(shí)可控制在15min以內(nèi)，并且可實(shí)現(xiàn)對(duì)CRP的高通量檢測(cè)。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述檢測(cè)樣品中CRP的試劑盒還可以進(jìn)一步包括如下附件技術(shù)特征至少之一：
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述近紅外熒光染料標(biāo)記為IR800。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，相比于cy5 等其它染料，IRDye800標(biāo)記的第二CRP檢測(cè)抗體在前面所述的檢測(cè)樣品中CRP的芯片上可獲得高達(dá)2個(gè)數(shù)量級(jí)的熒光增強(qiáng)效果。進(jìn)而利用本實(shí)用新型實(shí)施例的試劑盒檢測(cè)樣品中預(yù)定抗原CRP，檢測(cè)靈敏度會(huì)進(jìn)一步顯著提高。
附圖說明
圖1是根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片的縱相剖面圖；
圖2是根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片的負(fù)載層的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3是根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片的捕獲層的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖4是根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖5是根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的等離子體芯片結(jié)構(gòu)的掃描隧道電子顯微鏡照片；
圖6是根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片的檢測(cè)示意圖；
圖7是根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的檢測(cè)區(qū)分布示意圖；
圖8是根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖9是根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的利用本實(shí)用新型的芯片檢測(cè)稀釋800倍后的45例血清樣本中的CRP濃度的結(jié)果與臨床結(jié)果的相關(guān)性分析；以及
圖10是根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的利用本實(shí)用新型的芯片檢測(cè)稀釋800倍后的45例全血樣本中的CRP濃度結(jié)果與臨床結(jié)果的相關(guān)性分析。
具體實(shí)施方式
下面詳細(xì)描述本實(shí)用新型的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本實(shí)用新型，而不能理解為對(duì)本實(shí)用新型的限制。
檢測(cè)樣品中CRP的芯片
在本實(shí)用新型的第一方面，本實(shí)用新型提出了一種檢測(cè)樣品中CRP的芯片。根據(jù)的本實(shí)用新型的實(shí)施例，參考圖(縱相剖面)1，所述芯片包括：基底100；負(fù)載層200，所述負(fù)載層200形成在所述基底100的表面，并且所述負(fù)載層是由等離子體納米金屬顆粒形成的；捕獲層300，所述捕獲層300形成在所述負(fù)載層的上表面，所述捕獲層300攜帶有第一CRP捕獲抗體，所述第一CRP捕獲抗體特異性針對(duì)所述CRP。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述負(fù)載層為等離子體納米金層或等離子體納米銀層。即負(fù)載層可由等離子體納米金顆粒或銀顆粒形成。當(dāng)負(fù)載層為等離子體納米金層時(shí)，根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施例，參考圖2，所述負(fù)載層200包括多個(gè)金島210。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述金島210由等離子體納米金顆粒形成，金島210可以在外界光的作用下發(fā)生共振，可作為一個(gè)有效的光學(xué)納米天線捕獲更多的光信號(hào)，從而對(duì)熒光信號(hào)起到增強(qiáng)作用。
根據(jù)本實(shí)用新型的再一具體實(shí)施例，所述多個(gè)金島210在所述基底100的外表面平均分布，所述金島的島面積為100～100000nm2。
根據(jù)本實(shí)用新型的再一具體實(shí)施例，所述金島的島面積為15000～60000nm2。
根據(jù)本實(shí)用新型的再一具體實(shí)施例，金島210所形成負(fù)載層200的厚度為10～500nm。
根據(jù)本實(shí)用新型的再一具體實(shí)施例，金島210所形成負(fù)載層200的厚度10～200nm。
根據(jù)本實(shí)用新型的再一具體實(shí)施例，金島210所形成負(fù)載層200的厚度為10～70nm。
根據(jù)本實(shí)用新型的再一具體實(shí)施例，多個(gè)金島210中相鄰兩個(gè)金島的距離在1～100納米之間。
根據(jù)本實(shí)用新型的再一具體實(shí)施例，多個(gè)金島210中相鄰兩個(gè)金島的距離在5～50nm。進(jìn)而可有效提高金顆粒間的局部電場(chǎng)，進(jìn)而有效增強(qiáng)熒光分子的激發(fā)。
所述基底的材料不受特別限制，根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施例，所述基底的材料可采用玻璃、硅片或塑料形制成的。根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施例，優(yōu)選采用玻璃。玻璃基底光學(xué)透明，有利于熒光檢測(cè)、其表面容易進(jìn)行化學(xué)修飾、成本低廉且加工工藝成熟，是工業(yè)上常用的廣學(xué)檢測(cè)基材。
根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施例，所述基底100和負(fù)載層200形成的結(jié)構(gòu)被稱為等離子體芯片結(jié)構(gòu)。其中等離子體芯片結(jié)構(gòu)可通過液相種子生長法在玻璃基片上原位制備。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述液相種子生長法的操作步驟如下所述：1)將玻璃基底與氨水和氯金酸接觸，以便獲得第一等離子體芯片結(jié)構(gòu)半成品；2)將所述第一等離子體芯片結(jié)構(gòu)半成品與硼氫化鈉接觸，以便獲得第二等離子體芯片結(jié)構(gòu)半成品；以及3)將所述第二等離子體芯片結(jié)構(gòu)半成品與氯金酸和羥胺接觸，以便獲得所述等離子體芯片結(jié)構(gòu)，在步驟1) 中，所述接觸的時(shí)間為0.5min～3min,所述氨水的濃度為100mmol/L～1000mmol/L，所述氯金酸的濃度為0.1mmol/L～25mmol/L，在步驟2)中，所述接觸的時(shí)間為0.5min～3min,所述硼氫化鈉溶液的濃度為0.1mmol/L～10mmol/L，在步驟3)中，所述接觸的時(shí)間為 11min～23min,所述氯金酸的濃度為0.1mmol/L～1mmol/L，所述氯金酸和所述羥胺的摩爾比為1：1。利用根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的上述操作獲得的等離子體芯片結(jié)構(gòu)，等離子體芯片結(jié)構(gòu)表面的負(fù)載層(200)貴金屬膜的形貌和厚度得到了精準(zhǔn)的控制，獲得的等離子體金屬層具有非連續(xù)的金島結(jié)構(gòu)210，每個(gè)金島的大小合適，金島210之間的距離均勻分布于～10nm 左右，非常適用于近紅外(650nm～1700nm)的熒光增強(qiáng)的生物分子檢測(cè)。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，參考圖3，所述捕獲300包括多個(gè)捕獲印斑310。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，捕獲層以捕獲印斑310的形式設(shè)置，可有效實(shí)現(xiàn)CRP的高通量捕獲和檢測(cè)。根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施例，所述捕獲印斑310呈圓形，并且所述圓形的直徑為300微米～500微米。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述捕獲層進(jìn)一步攜帶雞IgY抗體，并且所述雞IgY抗體、所述第一CRP捕獲抗體分別設(shè)置在不同的捕獲印斑310上。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，在捕獲血液樣品中的CRP實(shí)驗(yàn)中，可通過羊抗雞IgY抗體與雞IgY抗體的特異性結(jié)合，進(jìn)而獲得可作為參考點(diǎn)的熒光值，從而通過CRP標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值與參考點(diǎn)的熒光值的比值，獲得“CRP濃度-比值”的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施例，所述捕獲印斑是利用微量點(diǎn)樣儀采用0.5～2微摩爾/升的濃度的抗體溶液進(jìn)行打印形成的。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，采用微量點(diǎn)樣器，如 GeSimNano-Plotter TM微量點(diǎn)樣器，能夠?qū)⒌谝籆RP捕獲抗體精確地與負(fù)載層200進(jìn)行結(jié)合固定，進(jìn)而能夠精確控制第一CRP捕獲抗體的點(diǎn)樣量、點(diǎn)樣斑點(diǎn)的大小，進(jìn)而對(duì)CRP 的檢測(cè)更加準(zhǔn)確。所述第一CRP捕獲抗體與負(fù)載層200的連接方式不受特別限制，根據(jù)實(shí)用新型的實(shí)施例，可采用物理吸附的方式進(jìn)行連接。
根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述樣品可以采用全血樣品或血清樣品。利用根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片，對(duì)樣品中CRP的檢測(cè)靈敏度可低至0.2-160mg/L，樣品的用量可低至1 uL，而檢測(cè)時(shí)間相比于現(xiàn)有技術(shù)大幅縮短，檢測(cè)用時(shí)可控制在15min以內(nèi)，并且可實(shí)現(xiàn)對(duì) CRP的高通量檢測(cè)。本實(shí)用新型的芯片，相對(duì)于傳統(tǒng)的以玻璃或硝酸纖維素膜為基底芯片熒光檢測(cè)，傳統(tǒng)的芯片熒光檢測(cè)在檢測(cè)過程中需要耗費(fèi)更多的孵育時(shí)間，用于保證樣品中更多的CRP被芯片基底捕獲，后續(xù)才可檢測(cè)到。而本實(shí)用新型的芯片中的裸金等離子體結(jié)構(gòu)具有熒光放大的作用，可極大地提高靈敏度，只需極其微量的CRP被捕獲便可檢測(cè)到。因此可很大程度地減少孵育時(shí)間(約5min)，最終使檢測(cè)時(shí)間可縮短至15min，
在本實(shí)用新型的第二方面，本實(shí)用新型提出了一種檢測(cè)樣品中CRP的芯片。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，參考圖4，所述芯片包括：玻璃基底100；負(fù)載層200，所述負(fù)載層200 形成在所述玻璃基底的外表面的至少一部分，并且所述負(fù)載層200由多個(gè)金島210構(gòu)成，所述多個(gè)金島210在所述玻璃基底100的外表面間隔設(shè)置，并且所述金島210是由等離子體納米金顆粒形成的，所述多個(gè)金島在所述玻璃基底的外表面平均分布，所述多個(gè)金島210 中相鄰兩個(gè)的間距為5～50nm，所述金島210的厚度為10～70nm；捕獲層300，所述捕獲層 300形成在所述多個(gè)金島210的至少一個(gè)上，并且所述捕獲層攜帶第一CRP捕獲抗體，所述捕獲層300是由多個(gè)間隔設(shè)置的捕獲印斑310構(gòu)成的，并且一個(gè)捕獲印斑310至少在一個(gè)所述金島210的上表面，所述捕獲印斑310呈圓形，所述圓形的直徑為300微米～500微米，任選地，所述第一CRP捕獲抗體特異性針對(duì)所述CRP，任選地，所述捕獲層300進(jìn)一步攜帶雞IgY抗體，并且所述雞IgY抗體、所述第一CRP捕獲抗體分別設(shè)置在不同的捕獲印斑310上，任選地，所述捕獲印斑310是利用GeSim Nano-Plotter TM 2.1點(diǎn)樣儀采用0.5～2 微摩爾/升的濃度的抗體溶液進(jìn)行打印形成的。利用根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片，能夠高靈敏度地檢測(cè)樣品中的CRP。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述樣品可以全血樣品或血清樣品。利用根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片，對(duì)樣品中CRP的檢測(cè)靈敏度可低至0.2-160mg/L，對(duì)樣品的用量要求可低至1uL，而檢測(cè)時(shí)間相比于現(xiàn)有技術(shù)大幅縮短，檢測(cè)用時(shí)可控制在 15min以內(nèi)，并且可實(shí)現(xiàn)對(duì)CRP的高通量檢測(cè)。
根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施例，在利用本實(shí)用新型的芯片檢測(cè)血樣中CRP時(shí)，需要加入具有熒光標(biāo)記的第二CRP檢測(cè)抗體，并且所述第二CRP檢測(cè)抗體特異性針對(duì)CRP。進(jìn)而第一捕獲抗體和第二檢測(cè)抗體均可特異性識(shí)別CRP，第二CRP檢測(cè)抗體的熒光標(biāo)記在第二CRP檢測(cè)抗體與CRP特異性結(jié)合后，在相應(yīng)激發(fā)光的作用下可發(fā)出熒光，熒光在本實(shí)用新型芯片的熒光增強(qiáng)作用下，熒光可被百倍放大，進(jìn)而利用本實(shí)用新型的實(shí)施例的芯片檢測(cè)CRP，可實(shí)現(xiàn)對(duì)CRP的高靈敏度、快速、高通量的檢測(cè)。
根據(jù)本實(shí)用新型的再一具體施例，上述的熒光標(biāo)記是IRDye800標(biāo)記。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于cy5等其它染料，IRDye800標(biāo)記的第二CRP檢測(cè)抗體在本實(shí)用新型的芯片上可獲得高達(dá)2個(gè)數(shù)量級(jí)放大作用的熒光增強(qiáng)效果。
根據(jù)本實(shí)用新型的再一具體實(shí)施例，在利用本實(shí)用新型的芯片檢測(cè)血樣的實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)一步加入具有熒光標(biāo)記的羊抗雞IgY抗體。羊抗雞IgY抗體可特異性結(jié)合雞IgY抗體。根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施例，通過羊抗雞IgY抗體與抗體雞IgY抗體的特異性結(jié)合，獲得的熒光值可作為參考點(diǎn)的熒光值，進(jìn)而通過CRP標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值與參考點(diǎn)的熒光值的比值，獲得“CRP濃度-比值”的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片檢測(cè)樣品中的 CRP抗原，能夠進(jìn)一步精確確定樣品中抗原CRP的濃度，最大可能地減少不同裝置、不同操作人員、不同操作環(huán)境下造成的檢測(cè)誤差。利用根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的芯片檢測(cè)樣品中的CRP的濃度，獲得的檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度、可信度、穩(wěn)定性進(jìn)一步提高。
為了方便理解，根據(jù)本實(shí)用新型的一個(gè)實(shí)施例，下面對(duì)利用本實(shí)用新型的高靈敏、快速檢測(cè)樣品中CRP的芯片檢測(cè)樣品中CRP的濃度的方法進(jìn)行描述：
血清或全血樣品通過兩次稀釋(第一次：1uL稀釋至39uLPBS(10％BSA)中，第二次： 10uL第一次稀釋液加入190uL PBS(10％BSA)中)稀釋至800倍。分別取100微升稀釋液加入至每個(gè)孔中，搖動(dòng)5min。本實(shí)用新型的芯片用PBST洗滌三次，隨后用IRDye800標(biāo)記的抗體(10nM第二CRP抗體和1nM羊抗IgY)在黑暗中5min搖動(dòng)染色。后用PBST洗滌三次。等離子體芯片最后用純水清洗、在掃描之前的空氣壓縮機(jī)干燥。獲取熒光比值(CRP 檢測(cè)點(diǎn)的熒光值與參考點(diǎn)熒光值之比)之后，根據(jù)“CRP濃度-比值”的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中CRP的濃度。
檢測(cè)樣品中CRP的試劑盒
另一方面，本實(shí)用新型提出了一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中CRP的試劑盒。根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，該試劑盒包括前面所述的檢測(cè)樣品中CRP的芯片以及任選的第二抗體容器，所述第二抗體容器中設(shè)置有第二CRP檢測(cè)抗體，所述第二CRP檢測(cè)抗體特異性針對(duì)所述CRP，并且所述第二CRP檢測(cè)抗體具有近紅外熒光染料標(biāo)記。其中，近紅外熒光染料標(biāo)記的類型不受特別限制，根據(jù)本實(shí)用新型的具體實(shí)施例，所采用的近紅外熒光染料標(biāo)記可為IR800，相比于采用cy5等其它染料，IRDye800標(biāo)記的第二CRP檢測(cè)抗體在前面所述的檢測(cè)樣品中CRP的芯片上可獲得高達(dá)2個(gè)數(shù)量級(jí)的熒光增強(qiáng)效果。進(jìn)而利用本實(shí)用新型實(shí)施例的試劑盒檢測(cè)樣品中預(yù)定抗原CRP，檢測(cè)靈敏度會(huì)進(jìn)一步顯著提高。利用根據(jù)本實(shí)用新型實(shí)施例的試劑盒，對(duì)樣品中預(yù)定抗原CRP的檢測(cè)靈敏度可低至0.2mg/L，檢測(cè)范圍為0.2～160mg/L，對(duì)樣品的用量要求可低至1μL，而檢測(cè)時(shí)間相比于現(xiàn)有技術(shù)大幅縮短，檢測(cè)用時(shí)可控制在15min以內(nèi)，并且可實(shí)現(xiàn)對(duì)CRP的高通量檢測(cè)。
下面詳細(xì)描述本實(shí)用新型的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本實(shí)用新型，而不能理解為對(duì)本實(shí)用新型的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1
在本實(shí)施例中，發(fā)明人詳細(xì)介紹了本實(shí)用新型芯片相關(guān)實(shí)驗(yàn)材料的獲得、IRDye800 標(biāo)記的檢測(cè)抗體的獲得以及血清樣本的制備過程。
實(shí)驗(yàn)材料：氯金酸、硼氫化鈉、鹽酸羥胺和二甲亞砜(DMSO)購自Sigma-Aldrich 公司購買。氫氧化銨購買自Fisher化學(xué)。脫鹽柱購自GE Healthcare。FAST框架滑動(dòng)架和滑動(dòng)快速孵化室從Sigma-Aldrich公司購買。檢測(cè)抗體CRP抗體1、捕獲抗體CRP 抗體2、CRP校準(zhǔn)品均購自菲鵬生物科技有限公司。800CW NHS酯是由LI- COR公司購買。胎牛血清購自浙江天杭生物技術(shù)公司。
IRDye800標(biāo)記的檢測(cè)抗體的獲得：捕獲抗體通過1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亞胺/N-羥基共價(jià)偶聯(lián)IRDye800，然后用柱分離未標(biāo)記的IRDye800。 800CW NHS酯用DMSO稀釋并保存在-20℃，使用前避光。捕獲抗體和IRDye800以 1:1的摩爾比混合4度下?lián)u動(dòng)，在黑暗中1.5小時(shí)。NAP-5柱用于除去未結(jié)合的染料。起初，10毫升的PBS加入到柱中，當(dāng)柱子中溶液自由低落完全后，將PBS加入至先前的標(biāo)記混合物中，使其總體積達(dá)到500微升并加入至柱子中，滴落后，再加入另外500 微升PBS。最后，收集IRDye800標(biāo)記的檢測(cè)抗體，將其儲(chǔ)存在-20℃，使用前避光。
人血清：這項(xiàng)研究調(diào)查方案得到了深圳羅湖醫(yī)院的機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。自項(xiàng)目啟動(dòng)時(shí)已取得患者知情同意。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)所用到的所有樣品均在深圳羅湖醫(yī)院收集。 3毫升的血液被吸引到一個(gè)EDTA管，并分成等份用于血液檢查。對(duì)于血清試驗(yàn)，3 毫升的血液加入至血清管中，并在3000轉(zhuǎn)每分鐘離心15分鐘。上清液在離心管收集。血清樣本在使用前儲(chǔ)存在-20℃條件下。全血樣本在采集后24h內(nèi)檢測(cè)。
本申請(qǐng)所述的“等離子體芯片結(jié)構(gòu)”(包括基底100和負(fù)載層200)在10.0千伏加速電壓、FEG源下通過日立S-4800掃描電子顯微鏡(SEM)觀察，得到如圖5所示的掃描隧道電子顯微鏡照片。
本申請(qǐng)的所述的檢測(cè)樣品中CRP的芯片的檢測(cè)示意圖如圖6所示。
實(shí)施例2 獲得CRP檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線
CRP檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：采用夾層結(jié)構(gòu)來檢測(cè)CRP。通過點(diǎn)樣儀GeSim Nano-Plotter TM 2.1固定捕獲抗體至等離子體芯片結(jié)構(gòu)上。捕獲抗體用PBS稀釋到1 μM，并加入到384孔板中。通過運(yùn)行設(shè)計(jì)的打印方案，捕獲抗體按照4nL每個(gè)點(diǎn)、每個(gè)點(diǎn)重復(fù)4次打印，最終獲得～400微米的圓形斑點(diǎn)。該芯片在4℃下放置過夜。取朗道的標(biāo)準(zhǔn)品(CRP標(biāo)準(zhǔn)品)(濃度分別為0、2.5、10、20、80和160mg/L)通過兩次稀釋(第一次：1uL稀釋至39uLPBS(10％BSA)中，第二次：10uL第一次稀釋液加入 190uL PBS(10％BSA)中)稀釋至800倍。分別取100微升稀釋液加入至每個(gè)孔中，搖動(dòng)5min。芯片用PBST洗滌三次，隨后IRDye800標(biāo)記的抗體(10nM第二CRP抗體和1nM羊抗IgY)在黑暗中5min搖動(dòng)染色。后用PBST洗滌三次。等離子體芯片最后用純水清洗、在掃描之前的低速離心甩干表面的液體。檢測(cè)區(qū)分布示意圖如圖7所示 (其中，各檢測(cè)區(qū)域分布有兩行特異檢測(cè)區(qū)，每行分布有4個(gè)平行的點(diǎn)，第一行固定有雞IgY，用于定量參考；第二行固定有第一捕獲CRP抗體，用于檢測(cè)CRP。第二行四個(gè)點(diǎn)熒光強(qiáng)度的平均值除以第一行四個(gè)點(diǎn)熒光強(qiáng)度的平均值被稱為熒光比值，此值用于CRP的定量檢測(cè)。)根據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度與其熒光比值(同一檢測(cè)孔中CRP 檢測(cè)點(diǎn)的熒光值與參考點(diǎn)熒光值之比)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示(其中，每個(gè)濃度檢測(cè)5次，橫坐標(biāo)表示樣品在稀釋800倍前的CRP濃度，縱坐標(biāo)是根據(jù)圖7中計(jì)算所得的熒光比值)。
熒光測(cè)量和分析：用MidaScan(NIRMIDAS Biotech)掃描器掃描芯片，選擇800納米通道、激光強(qiáng)度設(shè)置為7.0、分辨率設(shè)置為20微米。掃描后獲得16位灰度圖像。 MidaScan配套的圖像軟件用于分析該圖像。選擇柵陣列分析模式測(cè)量每個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度。點(diǎn)陣的形貌由程序自動(dòng)識(shí)別。每個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度通過所選區(qū)域總信號(hào)強(qiáng)度除以面積獲得。圖像上平行的4個(gè)點(diǎn)的平均強(qiáng)度被定義為測(cè)試的強(qiáng)度。血清中特異性標(biāo)記物的濃度與所獲圖像上的熒光強(qiáng)度比值之間存在正相關(guān)關(guān)系。讀取熒光強(qiáng)度后便可間接地獲得濃度值。
LOD和LOQ計(jì)算：LOD和LOQ均是根據(jù)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算獲得。等離子體芯片的校正曲線的線性擬合方程均通過OriginPro擬合計(jì)算獲得。LOD定義為平均空白值加上S.D.的3倍，LOQ定義為平均空白值加上S.D的10倍。
實(shí)施例3 CRP檢測(cè)芯片的應(yīng)用
CRP檢測(cè)芯片的檢測(cè)：采用夾層結(jié)構(gòu)來檢測(cè)CRP。通過點(diǎn)樣儀GeSim Nano-Plotter TM 2.1固定捕獲抗體至等離子體芯片結(jié)構(gòu)上。第一捕獲抗體用PBS稀釋到1μM，并加入到384孔板中。通過運(yùn)行設(shè)計(jì)的打印方案，第一捕獲抗體按照4nL每個(gè)點(diǎn)、每個(gè)點(diǎn)重復(fù)4次打印，最終獲得～400微米的圓形斑點(diǎn)。該芯片在4℃下放置過夜。血清或全血樣品通過兩次稀釋(第一次：1uL稀釋至39uLPBS(10％BSA)中，第二次：10uL第一次稀釋液加入190uL PBS(10％BSA)中)稀釋至800倍。分別取100微升稀釋液加入至每個(gè)孔中，搖動(dòng)5min。芯片用PBST洗滌三次，隨后IRDye800標(biāo)記的抗體(10nM CRP 抗體2和1nM羊抗IgY)在黑暗中5min搖動(dòng)染色。后用PBST洗滌三次。等離子體芯片最后用純水清洗、在掃描之前的空氣壓縮機(jī)干燥。獲取熒光比值(同一檢測(cè)孔中CRP 檢測(cè)點(diǎn)的熒光值與參考點(diǎn)熒光值之比)之后，根據(jù)實(shí)施例2中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線反求出濃度。
進(jìn)而，發(fā)明人比較了利用本實(shí)用新型的芯片檢測(cè)獲得的血清或全血中的CRP濃度與臨床檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖9和圖10所示。其中圖9顯示了利用本實(shí)用新型的芯片檢測(cè)稀釋800倍后的45例血清樣本中的CRP濃度的結(jié)果與臨床結(jié)果的相關(guān)性分析，圖10顯示了利用本實(shí)用新型的芯片檢測(cè)稀釋800倍后的45例全血樣本的結(jié)果與臨床結(jié)果的相關(guān)性分析，其中，全血CRP濃度是根據(jù)全血樣本中實(shí)際檢測(cè)到的CRP濃度經(jīng)血紅細(xì)胞壓積較正獲得。圖9和圖10顯示，利用本實(shí)用新型的芯片檢測(cè)獲得的血清或全血中的CRP濃度與臨床檢測(cè)結(jié)果具有很好的相關(guān)性。
在本實(shí)用新型的描述中，需要理解的是，術(shù)語“中心”、“縱向”、“橫向”、“長度”、“寬度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底”、“內(nèi)”、“外”、“順時(shí)針”、“逆時(shí)針”、“軸向”、“徑向”、“周向”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本實(shí)用新型和簡化描述，而不是指示或暗示所指的芯片或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對(duì)本實(shí)用新型的限制。
在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本實(shí)用新型的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。
盡管上面已經(jīng)示出和描述了本實(shí)用新型的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本實(shí)用新型的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本實(shí)用新型的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。