本實用新型涉及膽固醇合成吸收標志物的測試系統(tǒng)及應(yīng)用于該測試系統(tǒng)的樣本前處理裝置，特別是涉及基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的膽固醇合成吸收標志物測試系統(tǒng)及樣本前處理裝置。

背景技術(shù)：

人體中的膽固醇主要來源兩個方面，一方面是從食物中攝取，另外一方面是體內(nèi)自身合成。目前對膽固醇水平的判定多采用傳統(tǒng)血脂指標，而這些指標體現(xiàn)的只是膽固醇代謝的最終結(jié)果。然而，受到遺傳和環(huán)境因素的影響，機體膽固醇吸收和合成呈現(xiàn)高度個體差異，因此，傳統(tǒng)血脂指標并不能明確反映體內(nèi)膽固醇的升高出現(xiàn)在合成和吸收哪個環(huán)節(jié)上。

并且，檢測血清總膽固醇多采用傳統(tǒng)的生化方法，因為檢測響應(yīng)值低或者沸點過高，還需要進衍生化，且前處理過程中涉及危險化學品，會對環(huán)境及檢測人員造成較大的危害。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC‐MS)是一種新型的檢測手段，它具有自動化程度高，分離能力強，定量分析結(jié)果穩(wěn)定可靠，分析時間快等優(yōu)點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種能夠?qū)δ懝檀己铣晌掌胶庾龀鐾暾娴脑u估的膽固醇合成吸收標志物的測試系統(tǒng)及樣本前處理裝置。

一種膽固醇合成吸收標志物的測試系統(tǒng)，包括：合成吸收標志物加標樣本處理器，用于將第一待測樣本處理成膽固醇合成吸收標志物加標樣本；總膽固醇樣本處理器，用于將第二待測樣本處理成總膽固醇加標樣本；以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，用于對所述膽固醇合成吸收標志物加標樣本和總膽固醇加標樣本進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

一種樣本前處理裝置，包括：合成吸收標志物加標樣本處理器，用于將第一待測樣本處理成膽固醇合成吸收標志物加標樣本；以及總膽固醇樣本處理器，用于將第二待測樣本處理成總膽固醇加標樣本。

相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的樣本前處理裝置及膽固醇合成吸收標志物的測試系統(tǒng)能夠?qū)δ懝檀己铣晌諛酥疚镞M行同時檢測，且能夠檢測總膽固醇及膽固醇，避免檢測中引入跨平臺偏差，能夠?qū)δ懝檀己铣晌掌胶庾龀鐾暾娴脑u估。

附圖說明

圖1為本實用新型實施例膽固醇合成吸收標志物的測試系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本實用新型實施例血清樣本膽固醇合成吸收標志物總離子流(TIC)圖；

圖3為本實用新型實施例血清樣本總膽固醇TIC圖；

圖4為本實用新型實施例總膽固醇LC‐MS檢測與生化檢測相關(guān)性曲線。

具體實施方式

為了使本實用新型的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例對本實用新型膽固醇合成吸收標志物的測試系統(tǒng)進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本實用新型，并不用于限定本實用新型。

請參閱圖1，本實用新型實施例提供一種膽固醇合成吸收標志物的測試系統(tǒng)10，包括樣本前處理裝置12以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀14。該樣本前處理裝置12包括合成吸收標志物加標樣本處理器100及總膽固醇樣本處理器200。

該合成吸收標志物加標樣本處理器100用于將采集的第一待測樣本處理成膽固醇合成吸收標志物加標樣本。采集的第一待測樣本例如可以是人血清樣本。在一實施例中，該采集的第一待測樣本在該合成吸收標志物加標樣本處理器100中經(jīng)過加標、皂化、提取、干燥及重溶，重溶后即得到膽固醇合成吸收標志物加標樣本。

該合成吸收標志物加標樣本處理器100可包括第一樣本容器110、第一加標皂化液添加裝置120、第一皂化器130、第一分離提取器140及第一干燥重溶裝置150。采集的具有一定體積的第一待測樣本容置在第一樣本容器110中。該第一加標皂化液添加裝置120用于將加標皂化液添加至該第一樣本容器110中。在一實施例中，該第一加標皂化液添加裝置120包括添加控制器及加標皂化液容器。優(yōu)選的，該加標皂化液容器中的加標皂化液為含濃度為0.3mol/L至8.9mol/L的強堿，及濃度為0.5mg/L至2.0mg/L的內(nèi)標物質(zhì)的溶液。該加標皂化液中溶劑可以是乙醇及水中的至少一種，強堿可以是氫氧化鈉及氫氧化鉀中的至少一種。該內(nèi)標物質(zhì)可以是膽甾烷醇‐d7、鏈甾醇‐d6、烯膽烷醇‐d4、菜油固醇‐d3及β‐谷固醇‐d7中的至少一種。該添加控制器用于根據(jù)該第一樣本容器110中的第一待測樣本的體積控制該加標皂化液的添加量，該加標皂化液與該第一待測樣本的體積比優(yōu)選為5:1至10:1。該第一皂化器130用于皂化樣本中的油脂，得到第一加標皂化樣本。在一實施例中，該第一皂化器130可包括渦旋混合器及水浴裝置。該第一分離提取器140用于分離該第一加標皂化樣本中的皂化油脂與膽固醇，從該第一加標皂化樣本中獲得含有膽固醇的液相，例如可以是溶劑萃取該膽固醇。在更為具體的實施例中，該第一分離提取器140包括萃取劑注入裝置、混合裝置、冷凍裝置及分離裝置，該萃取劑注入裝置向該加標皂化樣本中加入水和正己烷，該混合裝置將該加標皂化樣本、水及正己烷混合，該冷凍裝置將得到的混合液在超低溫(0℃至‐95℃)冷凍，該分離裝置將冷凍后形成的固相與液相分離，該液相中包括正己烷及膽固醇。該第一干燥重溶裝置150用于將含有膽固醇的液相干燥后加入預(yù)定量溶劑重新形成溶液，即得到該膽固醇合成吸收標志物加標樣本。該溶劑可以是甲醇、乙醇及乙腈中的至少一種。加入的溶劑與該第一待測樣本的體積比優(yōu)選為1:1至1:3。該第一干燥重溶裝置150可包括干燥裝置和溶劑注入裝置，該溶劑注入裝置能夠根據(jù)該第一待測樣本的體積控制該溶劑的加入體積。

該總膽固醇樣本處理器200用于將采集的第二待測樣本處理成總膽固醇加標樣本。采集的第二待測樣本例如可以是人血清樣本。在一實施例中，該采集的第二待測樣本在該總膽固醇樣本處理器200中經(jīng)過加標、皂化、提取、干燥及重溶，重溶后即得到總膽固醇內(nèi)標樣本。

該總膽固醇樣本處理器200可包括第二樣本容器210、第二加標皂化液添加裝置220、第二皂化器230、第二分離提取器240及第二干燥重溶裝置250。采集的第二待測樣本容置在第二樣本容器210中。該第二加標皂化液添加裝置220用于將第二加標皂化液添加至該第二樣本容器210中。在一實施例中，該第二加標皂化液添加裝置220包括添加控制器及加標皂化液容器。優(yōu)選的，該加標皂化液容器中的第二加標皂化液為含濃度為0.3mol/L至8.9mol/L的強堿，及濃度為0.5mg/L至2.0mg/L的內(nèi)標物質(zhì)的溶液。該第二加標皂化液中溶劑可以是乙醇及水中的至少一種，強堿可以是氫氧化鈉及氫氧化鉀中的至少一種。該內(nèi)標物質(zhì)可以是膽固醇‐d6(cholesterol‐d6)。該添加控制器用于根據(jù)該第二樣本容器210中的第二待測樣本的體積控制該加標皂化液的添加量，該加標皂化液與該第二待測樣本的體積比優(yōu)選為5:1至10:1。該第二皂化器230用于皂化樣本中的油脂，得到第二加標皂化樣本。在一實施例中，該第二皂化器230可包括渦旋混合器及水浴裝置。該第二分離提取器240用于分離該第二加標皂化樣本中的皂化油脂與膽固醇，從該第二加標皂化樣本中獲得含有膽固醇的液相，例如可以是溶劑萃取該膽固醇。在更為具體的實施例中，該第二分離提取器240包括萃取劑注入裝置、混合裝置及離心分離裝置，該萃取劑注入裝置向該第二加標皂化樣本中加入水和正己烷，該混合裝置將該加標皂化樣本、水及正己烷混合，該離心分離裝置將混合液離心分離，上層清液中包括正己烷及膽固醇。該第二干燥重溶裝置250用于將含有膽固醇的上層清液干燥后加入預(yù)定量溶劑重新形成溶液，即得到該總膽固醇樣本。該溶劑可以是甲醇、乙醇及乙腈中的至少一種。加入的溶劑與該第二待測樣本的體積比優(yōu)選為1:1至3:1。該第二干燥重溶裝置250可包括干燥裝置和溶劑注入裝置，該溶劑注入裝置能夠根據(jù)該第二待測樣本的體積控制該溶劑的加入體積。

該第二樣本容器210容置的該第二待測樣本的體積小于該第一樣本容器110容置的第一待測樣本的體積。優(yōu)選的，該第二加標皂化液添加裝置220加入的加標皂化液中強堿及內(nèi)標物質(zhì)的濃度分別大于該第一加標皂化液添加裝置110 加入的加標皂化液中強堿及內(nèi)標物質(zhì)的濃度。該合成吸收標志物加標樣本處理器100與該總膽固醇樣本處理器200滿足下述關(guān)系式：

待測樣本中包括菜油固醇(campesterol)、β‐谷固醇(β‐sitosterol)、膽甾烷醇(cholestanol)、7－烯膽烷醇(lathosterol)及鏈甾醇(desmosterol)中的至少一種，該菜油固醇、β‐谷固醇及膽甾烷醇為非膽固醇類固醇，即膳食來源的植物固醇，能夠反映機體對外源性膽固醇的吸收，該7－烯膽烷醇及鏈甾醇為膽固醇合成過程的中間產(chǎn)物，即膽固醇前體固醇，能夠反映內(nèi)源性膽固醇的合成，因而上述幾種物質(zhì)可作為膽固醇合成吸收標志物。該液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀300用于所述對膽固醇合成吸收標志物加標樣本和總膽固醇加標樣本進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，可以是現(xiàn)有設(shè)備，如安捷倫1290‐6495液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀。

實施例

待測樣本處理條件：

第一待測樣本體積：200μL；第一加標皂化液體積：1mL；第一加標皂化液組分：0.3mol/L氫氧化鈉，內(nèi)標物質(zhì)：膽甾烷醇‐d7、鏈甾醇‐d6、烯膽烷醇‐d4、菜油固醇‐d3及β‐谷固醇‐d7，90％乙醇；第一皂化器水浴溫度：37℃；第一干燥重溶裝置150中重溶溶劑：300μL甲醇；第二待測樣本體積：50μL；第二加標皂化液體積：1mL皂化液；第二加標皂化液組分：8.9mol/L氫氧化鉀，內(nèi)標物質(zhì)：1.4mg/L膽固醇‐d6，90％乙醇；第二皂化器水浴溫度：50℃；第二干燥重溶裝置250中重溶溶劑：500μL甲醇。

液相色譜條件：色譜柱：SUPELCO Express F5液相色譜柱(15cm×2.1mm，5μm)；柱溫：25.0±0.8℃；進樣量：1μL；流動相A：含有0.1％甲酸及10mM甲酸銨的水溶液，流動相B：含有0.1％甲酸及10mM甲酸銨的甲醇溶液；流動相A％+流動相B％＝100％；梯度洗脫程序：0～0.5分鐘，80％B～85％B；0.5～7.0分鐘，85％B～90％B；7.0～7.1分鐘，90％B～100％B；7.1～9.0分鐘100％B，9.0～9.1分鐘100％B～80％B；流速：0.3mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正模式采集，多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測，干燥氣溫度：200℃；流速：12L/min；鞘氣溫度為350℃，鞘氣流速：10L/min；毛細管電壓：3500V；噴嘴電壓：1500V；離子漏斗(iFunnel)高、低射頻電壓分別為150V和60V。質(zhì)譜采集參數(shù)如表1。檢測血清樣本時膽固醇吸收合成標志物及膽固醇的出峰位置及時間如圖2和圖3所示。

表1

測試結(jié)果：

1.膽固醇及膽固醇合成吸收標志物線性關(guān)系分析

以扣除本底質(zhì)譜中分析物和對應(yīng)內(nèi)標的峰面積的比值為y、以添加分析物的濃度為x(mg/L)繪制標準曲線，權(quán)重取1/x，擬合線性方程，各指標線性方程及相關(guān)系數(shù)R²結(jié)果如表2所示：

表2

結(jié)果顯示，膽固醇在濃度15.625～2000mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，菜油固醇、膽甾烷醇、鏈甾醇、烯膽烷醇、谷固醇在濃度0.078125～10mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.膽固醇合成吸收標志物回收率及精密度(RSD)

該第一加標皂化液添加裝置120添加的第一加標皂化液中內(nèi)標物質(zhì)濃度分別為0.5mg/L、1mg/L、2mg/L及7mg/L，內(nèi)標物質(zhì)回收率及精密度如表3所示：

表3

可以看到，膽固醇合成吸收標志物各添加濃度水平的回收率可控制在20±100％之內(nèi)，說明檢測準確性有所保障，精密度基本可以覆蓋在10％之內(nèi)，說明重復(fù)性較好。

3.LC‐MS平臺與生化平臺檢測總膽固醇的相關(guān)性結(jié)果

請參閱圖4，30個血清樣本分別用本發(fā)明實施例膽固醇合成吸收標志物的測試系統(tǒng)10和傳統(tǒng)生化平臺檢測，以傳統(tǒng)生化檢測值(mM)為x坐標，所述膽固醇合成吸收標志物的測試系統(tǒng)10的檢測值(mM)為縱坐標進行擬合，得擬合曲線y＝1.0535x+0.1533，R＝0.9564，斜率趨近于1，說明相關(guān)性非常好。

以上所述實施例僅表達了本實用新型的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本實用新型專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本實用新型構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本實用新型的保護范圍。因此，本實用新型專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。