本發(fā)明涉及化學(xué)分析檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種利用HPLC同時檢測五類極性差異較大黃酮類物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：黃酮類物質(zhì)是諸多保健品和藥材的藥效成分，葛根素、二氫楊梅素、蘆丁、槲皮素和山奈酚等黃酮類物質(zhì)為常見的黃酮類成分，廣泛分布于中草藥中。葛根素有增加腦血流、提高免疫、改善學(xué)習(xí)記憶、抗腫瘤、降血糖、解酒等作用；二氫楊梅素具有抗氧化、抗菌消炎、護肝、調(diào)節(jié)血糖血脂及對平滑肌等作用；蘆丁具有降低毛細血管通透性和脆性，促進細胞增生和防止血細胞凝聚，抗炎、利尿、解痙、鎮(zhèn)咳、降血脂等方面的作用；槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗過敏、抗菌、抗病毒，清除體內(nèi)自由基、抑制惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等作用；山奈酚具抗氧化、抗炎、抑制腫瘤生長及保護肝細胞等作用。隨著黃酮生理功效研究的深入，諸多保健品加入了含有保健功能的黃酮的中草藥，而這些黃酮的含量也成為評價保健品有效成分的檢測指標。然而不同黃酮化合物極性差異較大，這樣就導(dǎo)致同時檢測極性差異較大的多種黃酮用時過長影響檢測效率。另外，天然藥材中常存在類似結(jié)構(gòu)的黃酮，在用一種洗脫體系分離某一類黃酮時會導(dǎo)致另外一類黃酮不易分離。因此，建立一種快速、準確的分析測定多種極性差異較大的黃酮類成分的方法，對含多種黃酮的保健品和中藥材的品質(zhì)控制及科學(xué)評價具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用高效液相色譜同時檢測多種極性黃酮的方法，該方法簡單，精確度高，重現(xiàn)性好，可為科學(xué)評價和有效控制含上述五類黃酮的保健品和中草藥的內(nèi)在質(zhì)量提供可靠依據(jù)。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的，一種同時測定中草藥或者保健品中五種黃酮的方法，所述五類黃酮類物質(zhì)是葛根素、二氫楊梅素、蘆丁、槲皮素和山奈酚，所述方法包括以下步驟：(1)樣品制備：保健品或中草藥冷凍干燥后，經(jīng)粉碎磨成粉末狀，過80目篩；將粉末按質(zhì)量體積比(g/mL)1:200加入甲醇中，搖動20min后，超聲處理60min，3000g離心10min，上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，得到樣品，存于樣品瓶中準備進樣；(2)將步驟1制備好的樣品用反相高效液相色譜分析，即可測定樣品中葛根素、二氫楊梅素、蘆丁、槲皮素、山奈酚的峰面積y1、y2、y3、y4、y5；采用的色譜柱為C18柱；進樣體積10μL，流速1.0mL/min，柱溫30℃；檢測波長：254nm和290nm；流動相：有機A相為乙腈；無機B相為含有體積分數(shù)為0.5％(v/v)的磷酸的水溶液；采用梯度洗脫，以有機A相在流動相中的體積含量計，洗脫程序為：0-10min，16％A-13％A；10-15min，13％A-15％A；15-20min，15％A-35％A；20-35min，35％A-45％A；35-43min，45％A-15％A；(3)獲得樣品中葛根素、二氫楊梅素、蘆丁、槲皮素、山奈酚的質(zhì)量體積濃度(mg/L)：由式y(tǒng)1＝39.977x1-1.251可得到樣品中葛根素的質(zhì)量體積濃度x1；由式y(tǒng)2＝21.918x2+19.74可得到樣品中二氫楊梅素的質(zhì)量體積濃度x2；由式y(tǒng)3＝19.398x3+12.15可得到樣品中蘆丁的質(zhì)量體積濃度x3；由式y(tǒng)4＝30.844x4-7.8948可得到樣品中槲皮素的質(zhì)量體積濃度x4；由式y(tǒng)5＝35.457x5-12.72可得到樣品中山奈酚的質(zhì)量體積濃度x5；(4)獲得中草藥或者保健品中葛根素、二氫楊梅素、蘆丁、槲皮素、山奈酚的質(zhì)量含量(mg/g)：葛根素的質(zhì)量含量為0.2x1；二氫楊梅素的質(zhì)量含量為0.2x2；蘆丁的質(zhì)量含量為0.2x3；槲皮素的質(zhì)量含量為0.2x4；山奈酚的質(zhì)量含量為0.2x5。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明用甲醇提取干燥的固體藥材或者保健品樣品，利用高效液相色譜，以乙腈和0.5％(v/v)的磷酸為流動相，上樣后梯度洗脫得到分離度良好的葛根素、二氫楊梅素、蘆丁、槲皮素和山奈酚的色譜圖，根據(jù)各黃酮的特征峰積分面積計算出原材料中五種黃酮的含量。本發(fā)明的方法尤其適用于快速檢測保健品或中草藥中極性差異較大黃酮的鑒定和定量，評價其藥效物質(zhì)含量。本發(fā)明提供的檢測方法可將保健品和中藥材中的葛根素、二氫楊梅素、蘆丁、槲皮素和山奈酚等黃酮類物質(zhì)一次性分離開，操作簡單、準確可靠，節(jié)省時間。附圖說明圖1是黃酮標準樣品色譜圖；其中，檢測波長為245nm，峰1，葛根素；峰2，二氫楊梅素；峰3，蘆??；峰4，槲皮素；峰5，山奈酚；圖2是黃酮標準樣品色譜圖；其中，檢測波長為290nm，峰1，葛根素；峰2，二氫楊梅素；峰3，蘆??；峰4，槲皮素；峰5，山奈酚；圖3是保健品提取物樣品色譜圖；其中，檢測波長為245nm，峰1，葛根素；峰2，二氫楊梅素；峰3，蘆??；峰4，槲皮素。圖4是保健品提取物樣品色譜圖；其中，檢測波長為290nm；峰1，葛根素；峰2，二氫楊梅素；峰3，蘆??；峰4，槲皮素。具體實施方式下面根據(jù)實施例詳細描述本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。實施例1、5種黃酮類物質(zhì)的標樣定性分離檢測1、樣品制備：配制二氫楊梅素75.8μg/mL、山奈酚66μg/mL、葛根素34μg/mL、槲皮素88.4μg/mL、蘆丁38.6μg/mL的混合液；2、將步驟1制備好的樣品用反相高效液相色譜分析，分析條件如下：色譜柱：ZorbaxEclipseXDB-C18；進樣體積10μL，流速1.0mL/min，柱溫30℃；檢測波長：254nm和290nm；流動相：有機A相為乙腈；無機B相為含有體積分數(shù)為0.5％(v/v)的磷酸的水溶液；采用梯度洗脫，洗脫程序為：0-10min，16％A-13％A；10-15min，13％A-15％A；15-20min，15％A-35％A；20-35min，35％A-45％A；35-43min，45％A-15％A。所得標樣色譜圖如圖1和圖2所示：峰1，葛根素；峰2，二氫楊梅素；峰3，蘆?。环?，槲皮素；峰5，山奈酚。不同黃酮依出峰時間的不同而區(qū)分，其中二氫楊梅素在254nm波長無吸收峰，在290nm波長有吸收峰，葛根素極性最大出峰時間最早，其它三種黃酮對應(yīng)特定的出峰時間。該體系流動相洗脫體系中極性組分先升再降使得非目標檢測物質(zhì)快速洗脫，相比已有洗脫體系，檢測時間減少。通過控制流動相梯度洗脫分離極性差異較大的黃酮，可以很好的分離多種極性差異較大的黃酮。實施例2、檢測方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和加樣回收率評估精密度試驗分別取6.8μg/mL、13.6μg/mL、20.4μg/mL、27.2μg/mL、34μg/mL葛根素對照品按對照品按10μL進樣量各重復(fù)進樣2次，記錄葛根素標準液的峰面積，計算相對標準偏差(RSD)，不同進樣量的相對標準偏差分別為0.05％、0.13％、0.26％、0.00％、0.42％。分別取6.96μg/mL、13.92μg/mL、20.88μg/mL、27.84μg/mL、34.8μg/mL二氫楊梅素對照品按10μL進樣量各重復(fù)進樣3次，記錄二氫楊梅素標準液的峰面積，計算相對標準偏差(RSD)，不同進樣量的相對標準偏差分別為0.35％、0.38％、0.06％、0.04％、0.38％。分別取10.56μg/mL、21.12μg/mL、31.68μg/mL、42.24μg/mL蘆丁對照品按對照品按10μL進樣量各重復(fù)進樣3次，記錄蘆丁標準液的峰面積，計算相對標準偏差(RSD)，不同進樣量的相對標準偏差分別為1.73％、0.17％、0.18％、0.18％。分別取8.96μg/mL、17.92μg/mL、26.88μg/mL、35.84μg/mL、44.8μg/mL、89.6μg/mL槲皮素對照品按對照品按10μL進樣量各重復(fù)進樣3次，記錄槲皮素標準液的峰面積，計算相對標準偏差(RSD)，不同進樣量的相對標準偏差分別為1.67％、0.07％、0.12％、0.08％、0.11％、0.13％。分別取7.92μg/mL、15.84μg/mL、23.76μg/mL、31.68μg/mL、39.6μg/mL、79.2μg/mL山奈酚對照品按對照品按10μL進樣量各重復(fù)進樣3次，記錄山奈酚標準液的峰面積，計算相對標準偏差(RSD)，不同進樣量的相對標準偏差分別為1.75％、0.23％、0.15％、0.01％、0.09％、0.09％。各標準物質(zhì)的檢測的峰面積標準偏差均小于0.5％，說明該方法精密度好，可采用最少的重復(fù)測定次數(shù)得到準確的結(jié)果。重復(fù)性試驗在同一供試品溶液中精密量取1mL溶液6份，分別以10μL進樣，并記錄樣品中二氫楊梅素的峰面積，計算RSD為0.39％。在同一供試品溶液中精密量取1mL溶液6份，分別以10μL進樣，并記錄樣品中葛根素的峰面積，計算RSD為0.13％。在同一供試品溶液中精密量取1mL溶液6份，分別以10μL進樣，并記錄樣品中蘆丁的峰面積，計算RSD為0.32％。在同一供試品溶液中精密量取1mL溶液6份，分別以10μL進樣，并記錄樣品中槲皮素的峰面積，計算RSD為0.22％。在同一供試品溶液中精密量取1mL溶液6份，分別以10μL進樣，并記錄樣品中山奈酚的峰面積，計算RSD為0.28％。各標準物質(zhì)的等體積、等濃度樣品六次進樣檢測的峰面積標準偏差均小于0.5％，說明該方法重復(fù)性好，可采用最少的重復(fù)測定次數(shù)得到準確的結(jié)果。穩(wěn)定性在供試品中精密量取1mL溶液，分別在0、2.5、5、7.5、10、12.5、15h下測定，并記錄樣品中二氫楊梅素的峰面積，計算RSD為0.49％。在供試品中精密量取1mL溶液，分別在0、2.5、5、7.5、10、12.5、15h下測定，并記錄樣品中葛根素的峰面積，計算RSD為0.22％。在供試品中精密量取1mL溶液，分別在0、2.5、5、7.5、10、12.5、15h下測定，并記錄樣品中蘆丁的峰面積，計算RSD為0.46％。在供試品中精密量取1mL溶液，分別在0、2.5、5、7.5、10、12.5、15h下測定，并記錄樣品中槲皮素的峰面積，計算RSD為0.38％。在供試品中精密量取1mL溶液，分別在0、2.5、5、7.5、10、12.5、15h下測定，并記錄樣品中山奈酚的峰面積，計算RSD為0.25％。各標準物質(zhì)的等體積、濃度樣品七次進樣檢測的不同進樣時間峰面積標準偏差均小于0.5％，說明該方法穩(wěn)定性好，不同時間測得數(shù)據(jù)穩(wěn)定準確。加樣回收率取測得含85.112μg/mL供試品溶液1.25mL，精密量取各5份，置于10mL容量瓶中，再精密量取1.74mg/mL二氫楊梅素標準品0.07mL，各五份，分別置于上述容量瓶中，以甲醇定容至10mL，超聲混勻，以0.45μm針筒濾膜過濾，再進行色譜測定，并記錄樣品中二氫楊梅素的峰面積，計算平均回收率95.78±0.01％。取測得含130.4μg/mL供試品溶液0.5mL，精密量取各5份，置于10mL容量瓶中，再精密量取34μg/mL葛根素標準品2mL，各五份，分別置于上述容量瓶中，以甲醇定容至10mL，超聲混勻，以0.45μm針筒濾膜過濾，再進行色譜測定，并記錄樣品中二氫楊梅素的峰面積，計算平均回收率100.05±0.35％。取測得含116.33μg/mL供試品溶液0.5mL，精密量取各5份，置于10mL容量瓶中，再精密量取52.8μg/mL蘆丁標準品1mL，各五份，分別置于上述容量瓶中，以甲醇定容至10mL，超聲混勻，以0.45μm針筒濾膜過濾，再進行色譜測定，并記錄樣品中蘆丁的峰面積，計算平均回收率99.99±0.62％。取測得含82.64μg/mL供試品溶液0.5mL，精密量取各5份，置于10mL容量瓶中，再精密量取39.6μg/mL山奈酚標準品1mL，各五份，分別置于上述容量瓶中，以甲醇定容至10mL，超聲混勻，以0.45μm針筒濾膜過濾，再進行色譜測定，并記錄樣品中蘆丁的峰面積，計算平均回收率99.98±0.43％。取測得含99.27μg/mL供試品溶液0.50mL，精密量取各5份，置于10mL容量瓶中，再精密量取44.80μg/mL槲皮素標準品1.10mL，各五份，分別置于上述容量瓶中，以甲醇定容至10mL，超聲混勻，以0.45μm針筒濾膜過濾，再進行色譜測定，并記錄樣品中槲皮素的峰面積，計算平均回收率100.41±0.40％?；厥章蕦嶒灡砻鞲鱾€目標檢物質(zhì)回收率標準誤在0.5％以內(nèi)，檢測物在線性范圍內(nèi)不存在超載，該實驗方法系統(tǒng)誤差小。實施例3、標準曲線的建立按實施例1的色譜條件將所得各濃度標準品溶液經(jīng)0.45μm有機微孔濾膜過濾后，進樣精密吸取混合標準品溶液0、2、4、6、8、10μL進行測定，每個樣品重復(fù)3次，得到梯度含量標準物質(zhì)對應(yīng)的峰面積，具體數(shù)據(jù)見表2。以峰面積為縱坐標(y)，質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，繪制標準曲線，計算標準曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。表1：葛根素、二氫楊梅素、蘆丁、山奈酚和槲皮素的線性回歸方程化合物名稱回歸方程相關(guān)系數(shù)(R2)線性范圍(μg/mL)葛根素y＝39.977x－1.2510.99956.80-37.00二氫楊梅素y＝21.918x+19.740.99476.96-27.84蘆丁y＝19.398x+12.150.998610.56-42.24山奈酚y＝35.457x－12.7217.92-79.20槲皮素y＝30.844x－7.8918.96-89.60表2：葛根素、二氫楊梅素、蘆丁、山奈酚和槲皮素不同進樣量的峰面積基于本方法建立的檢測體系，構(gòu)建了5種黃酮的定量標準曲線，標準曲線在線性范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于99.9％，可以精確定量樣品中的相應(yīng)黃酮含量。本發(fā)明采用高極性洗脫液比例洗脫，加快洗脫時間；極性洗脫液濃度先升后降的梯度洗脫法，可同時分離保健品中極性差異較大但結(jié)構(gòu)相似的葛根素、二氫楊梅素、蘆丁、槲皮素和山奈酚及其近似物五類黃酮類物質(zhì)。實施例4、某保健品中黃酮類物質(zhì)的檢測1、樣品制備：樣品制備：保健品顆?；蛑胁菟幚鋬龈稍锖螅?jīng)粉碎磨成粉末狀，過80目篩。稱量0.5g粉末加入100mL甲醇溶液搖動20min后，超聲處理60min，3000×g離心10min，上清液，取1mL稀釋10倍，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，存于樣品瓶中準備進樣；2、將步驟1制備好的樣品用反相高效液相色譜分析，分析條件如下：色譜柱：ZorbaxEclipseXDB-C18；進樣體積10μL，流速1.0mL/min，柱溫30℃；檢測波長：254nm和290nm；流動相：有機A相為乙腈；無機B相為含有體積分數(shù)為0.5％(v/v)的磷酸的水溶液；采用梯度洗脫，洗脫程序為：0-10min，16％A-13％A；10-15min，13％A-15％A；15-20min，15％A-35％A；20-35min，35％A-45％A；35-43min，45％A-15％A。所得標樣色譜圖如圖3和圖4所示：峰1，葛根素；峰2，二氫楊梅素；峰3，蘆丁；峰4，槲皮素。葛根素峰面積為1461.94397，計算可得葛根素濃度為36.60μg/mL，按樣品制備比例換算后得出，每克保健品中含73.20mg葛根素。二氫楊梅素峰面積為668.07550，計算進樣濃度為29.58μg/mL，按樣品制備比例換算后得出，每克保健品中含59.16mg二氫楊梅素。蘆丁峰面積為268.20365，帶入實施例3中的標準曲線，計算蘆丁濃度為13.20μg/mL，按樣品制備比例換算后得出每克保健品中含26.40mg蘆丁。槲皮素峰面積為337.14377，帶入實施例3中的標準曲線，計算為11.19μg/mL，按樣品制備比例換算后得出每克保健品中含22.37mg槲皮素。山奈酚峰面積為282.10318，帶入實施例3中的標準曲線，計算為8.56μg/mL，按樣品制備比例換算后得出每克保健品中含17.11mg山奈酚。通過該方法一次性快速的分離了5種極性差異較大的黃酮并進行了精確定量，快速準確的定量了保健品有成分的含量。當前第1頁1 2 3