本發(fā)明涉及染色體制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種曼氏無針烏賊鰓染色體的制備方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物遺傳育種研究的迅速發(fā)展，對染色體制備的技術(shù)要求也越來越高。魚類染色體研究開展較早，現(xiàn)在技術(shù)也很成熟。但在國際社會，頭足類染色體研究非常少，僅涉及2~3個種類的染色體制備的研究。其主要原因一方面是由于對海洋頭足類研究較晚，有關(guān)工作還未順利開展起來；另一方面可能與還與未有成熟的頭足類染色體制備技術(shù)；且其細(xì)胞在有絲分裂中期染色體形狀小，數(shù)目龐大，染色體標(biāo)本的制備和分析困難等因素有關(guān)。

曼氏無針烏賊（Sepiella maindroni）屬軟體動物門，頭足綱二鰓亞綱烏賊目烏賊科無針烏賊屬，俗名:花粒子、麻烏賊、血墨?？墒巢糠旨s占總體的92％。其肉潔白如玉，具有鮮、嫩、脆的特點(diǎn)，已營養(yǎng)豐富，每百克肉含蛋白質(zhì)13克、脂肪0.7克以及豐富的鈣、磷、鐵。除鮮食外，還可加工制成罐頭食品或干制品，經(jīng)濟(jì)價值高。但近年來，由于人類大量捕撈，致使傳統(tǒng)的近海漁業(yè)資源不斷衰減，釀成曼氏無針烏賊資源枯竭，面臨滅絕的邊緣。為了迅速恢復(fù)曼氏無針烏賊傳統(tǒng)資源，推動傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，國內(nèi)已開始進(jìn)行曼氏無針烏賊繁養(yǎng)工作；相應(yīng)地有關(guān)其基礎(chǔ)生物學(xué)的研究也迅速開展起來。但到目前為止，有關(guān)曼氏無針烏賊的研究主要集中在分類區(qū)系、形態(tài)解剖、胚胎發(fā)育、生理生態(tài)和漁業(yè)資源等基礎(chǔ)研究和應(yīng)用，而對其染色體制備的研究還未見報道?，F(xiàn)在染色體制備較多的是關(guān)于植物、動物和人體的，如中國發(fā)明CN103993095B，公開了一種新麥草屬植物細(xì)胞染色體中期分裂相標(biāo)本制備方法；中國發(fā)明CN103983497B，公開了一種渦蟲染色體標(biāo)本的制備方法；中國發(fā)明CN103805564B，公開了一種快速制備人外周血淋巴細(xì)胞早熟凝集染色體的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能得到有分裂中期，形態(tài)清晰，分散程度大，應(yīng)激反應(yīng)小的曼氏無針烏賊鰓染色體的制備方法。

本發(fā)明針對背景技術(shù)提到的問題，采取的技術(shù)方案為：

曼氏無針烏賊鰓染色體的制備方法，具體步驟為：

1）麻醉：采用氯化鎂麻醉烏賊，防止注射秋水仙素噴墨，麻醉方法是將烏賊浸泡于含有16.5~17.8‰氯化鎂和0.13~0.15‰醋酸銨的2~4% 乙醇溶液中80~90 s，麻醉效果好，對染色體復(fù)制分裂無影響；

2）秋水仙素處理：烏賊麻醉后注射秋水仙素，秋水仙素中溶有0.0002~0.0004‰聚乙二醇，濃度為0.04~0.08%，注射量為0.2~0.4ml /100 g烏賊體重，注射部位為烏賊眼睛下面的眼窩竇。秋水仙素通過改變細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的粘度，抑制細(xì)胞分裂時紡錘體的形成，使細(xì)胞分裂處于中期，從而得到更多中期分裂相，秋水仙素中添加聚乙二醇可使其抑制紡錘體形成能力提高；

3）低滲：棄去秋水仙素處理液，將烏賊放入新鮮海水中用水流緩慢沖洗鰓部使烏賊復(fù)蘇，培養(yǎng)22~28h，殺死烏賊，取出烏賊的鰓絲放在含0.02~0.03%維生素C的18~24%海水中低滲30~40min。低滲時間不足，細(xì)胞膜不破裂，難以獲得染色體分裂相;低滲時間過長，細(xì)胞膜破裂，染色體分散過度，選成丟失，甚至斷裂。在低滲液中添加維生素C可起到保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)的作用；

4）固定：小心棄去低滲液，加入新鮮配制的 Carnoy固定液（冰乙酸：甲醇=1：3~1:4），固定0.8~1.2h，期間換新鮮固定液2~4次，每15~25min換一次固定液，最后放置備用?？梢允谷旧w核蛋白保持原有結(jié)構(gòu)，使染色體更接近活體狀態(tài)；

5）解離：制片時棄去固定液，加入新鮮配制好的40~60%冰乙酸解離液0.8~1.5mL，用滴管輕輕吸打?qū)⒔M織搗碎，以免破壞染色體形態(tài)，解離，然后用紗絹布過濾，用滴管吸取濾液；

6）滴片：取若干片干凈的載玻片，貼上標(biāo)簽，放在溫度為40~60℃的烤片機(jī)上，在高度為20cm處滴下吸取的細(xì)胞濾液，使細(xì)胞充分散開，且形成圓圈狀，一般滴的數(shù)目在20滴左右；

7）染色：取出滴好晾干的片子，平放好，用滴管吸取配制好的8~12%吉姆薩染液，將染液全部覆蓋在載玻片上，放置染色40~50min后用自來水清洗掉染液，放置晾干。最后得到的染色體背景淺，有分裂中期，形態(tài)清晰，分散程度大。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：麻醉劑為含有16.5~17.8‰氯化鎂和0.13~0.15‰醋酸銨的2~4% 乙醇溶液，麻醉效果好，對染色體復(fù)制分裂無影響；秋水仙素中添加聚乙二醇可使其抑制紡錘體形成能力提高；低滲液為含0.02~0.03%維生素C的18~24%海水，可使細(xì)胞膜破裂，染色體分散，又不會造成染色體丟失甚至斷裂；最終得到的染色體背景淺，有分裂中期，形態(tài)清晰，分散程度大。

附圖說明

圖1為鰓染色體的形態(tài)X1000。

具體實施方式

下面通過附圖和實施例對本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步說明：

實施例1：

曼氏無針烏賊鰓染色體的制備方法，具體步驟為：

1）麻醉：采用氯化鎂麻醉烏賊，防止注射秋水仙素噴墨，麻醉方法是將烏賊浸泡于含有16.5~17.8‰氯化鎂和0.13~0.15‰醋酸銨的2~4% 乙醇溶液中80~90 s，麻醉效果好，應(yīng)激反應(yīng)小，對染色體復(fù)制分裂無影響；

2）秋水仙素處理：烏賊麻醉后注射秋水仙素，秋水仙素中溶有0.0002~0.0004‰聚乙二醇，濃度為0.04~0.08%，注射量為0.2~0.4ml /100 g烏賊體重，注射部位為烏賊眼睛下面的眼窩竇。秋水仙素通過改變細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的粘度，抑制細(xì)胞分裂時紡錘體的形成，使細(xì)胞分裂處于中期，從而得到更多中期分裂相，秋水仙素中添加聚乙二醇可使其抑制紡錘體形成能力提高；

3）低滲：棄去秋水仙素處理液，將烏賊放入新鮮海水中用水流緩慢沖洗鰓部使烏賊復(fù)蘇，培養(yǎng)22~28h，殺死烏賊，取出烏賊的鰓絲放在含0.02~0.03%維生素C的18~24%海水中低滲30~40min。低滲時間不足，細(xì)胞膜不破裂，難以獲得染色體分裂相;低滲時間過長，細(xì)胞膜破裂，染色體分散過度，選成丟失，甚至斷裂。在低滲液中添加維生素C可起到保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)的作用；

4）固定：小心棄去低滲液，加入新鮮配制的 Carnoy固定液（冰乙酸：甲醇=1：3~1:4），固定0.8~1.2h，期間換新鮮固定液2~4次，每15~25min換一次固定液，最后放置備用?？梢允谷旧w核蛋白保持原有結(jié)構(gòu)，使染色體更接近活體狀態(tài)；

5）解離：制片時棄去固定液，加入新鮮配制好的40~60%冰乙酸解離液0.8~1.5mL，用滴管輕輕吸打?qū)⒔M織搗碎，以免破壞染色體形態(tài)，解離，然后用紗絹布過濾，用滴管吸取濾液；

6）滴片：取若干片干凈的載玻片，貼上標(biāo)簽，放在溫度為40~60℃的烤片機(jī)上，在高度為20cm處滴下吸取的細(xì)胞濾液，使細(xì)胞充分散開，且形成圓圈狀，一般滴的數(shù)目在20滴左右；

7）染色：取出滴好晾干的片子，平放好，用滴管吸取配制好的8~12%吉姆薩染液，將染液全部覆蓋在載玻片上，放置染色40~50min后用自來水清洗掉染液，放置晾干。最后得到的染色體背景淺，有分裂中期，形態(tài)清晰，分散程度大。

實施例2：

曼氏無針烏賊鰓染色體的制備方法，最優(yōu)選步驟為：

1）麻醉：采用氯化鎂麻醉烏賊，防止注射秋水仙素噴墨，麻醉方法是將烏賊浸泡于含有17.5‰氯化鎂和0.13‰醋酸銨的2% 乙醇溶液中80 s，麻醉效果好，對染色體復(fù)制分裂無影響；

2）秋水仙素處理：烏賊麻醉后注射秋水仙素，秋水仙素中溶有0.0002‰聚乙二醇，濃度為0.04%，注射量為0.3ml /100 g烏賊體重，注射部位為烏賊眼睛下面的眼窩竇。秋水仙素通過改變細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的粘度，抑制細(xì)胞分裂時紡錘體的形成，使細(xì)胞分裂處于中期，從而得到更多中期分裂相，秋水仙素中添加聚乙二醇可使其抑制紡錘體形成能力提高；溶有的聚乙二醇的秋水仙素在原有效果的基礎(chǔ)上具有應(yīng)激反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)。

3）低滲：棄去秋水仙素處理液，將烏賊放入新鮮海水中用水流緩慢沖洗鰓部使烏賊復(fù)蘇，培養(yǎng)24h，殺死烏賊，取出烏賊的鰓絲放在含0.03%維生素C的20%海水中低滲35min。低滲時間不足，細(xì)胞膜不破裂，難以獲得染色體分裂相;低滲時間過長，細(xì)胞膜破裂，染色體分散過度，選成丟失，甚至斷裂。在低滲液中添加維生素C可起到保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)的作用；

4）固定：小心棄去低滲液，加入新鮮配制的 Carnoy固定液（冰乙酸：甲醇=1：3），固定1h，期間換新鮮固定液2次，每20min換一次固定液，最后放置備用?？梢允谷旧w核蛋白保持原有結(jié)構(gòu)，使染色體更接近活體狀態(tài)；

5） 解離：制片時棄去固定液，加入新鮮配制好的50%冰乙酸解離液1mL，用滴管輕輕吸打?qū)⒔M織搗碎，以免破壞染色體形態(tài)，解離，然后用紗絹布過濾，用滴管吸取濾液；

6）滴片：取若干片干凈的載玻片，貼上標(biāo)簽，放在溫度為50℃的烤片機(jī)上，在高度為20cm處滴下吸取的細(xì)胞濾液，使細(xì)胞充分散開，且形成圓圈狀，一般滴的數(shù)目在20滴左右；

7） 染色：取出滴好晾干的片子，平放好，用滴管吸取配制好的10%吉姆薩染液，將染液全部覆蓋在載玻片上，放置染色45min后用自來水清洗掉染液，放置晾干。最后得到的染色體背景淺，有分裂中期，形態(tài)清晰，分散程度大。

以上所述的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。