本發(fā)明屬于藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域，具體涉及高效液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-Q-MS)對(duì)參芪降糖制劑多成分含量測(cè)定的方法，以及對(duì)由此法得到的參芪降糖制劑液相圖構(gòu)建指紋圖譜，還涉及此法在在參芪降糖制劑整體質(zhì)量控制中的應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)屬于中醫(yī)“消渴病”范疇：“渴而飲水多，小便數(shù)，無脂似麩片甜者，皆是消渴病也”。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)指出，目前全球有4.15億糖尿病成年患者，3.18億人存在患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)，其中，II型糖尿病占全球所有糖尿病病例的90％，因糖尿病伴發(fā)的高血糖，易導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙等并發(fā)癥，大大降低了糖尿病患者的生活質(zhì)量。

目前，臨床上糖尿病的治療除注射胰島素外主要口服磺脲類和雙胍類降糖藥物，但西藥在有效降低血糖的同時(shí)也存在眾多的安全性問題和不良反應(yīng)，如嚴(yán)重的低血糖、乳酸性酸中毒、胃腸道反應(yīng)及肝損傷、永久性神經(jīng)功能損傷、頭痛、頭暈甚至死亡等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，中藥的降血糖作用溫和持久，療效穩(wěn)定，副作用小，恰好彌補(bǔ)了化藥的不足，日益受到國(guó)內(nèi)外內(nèi)分泌界的高度重視。

參芪降糖顆粒(Shenqi Jiangtang Granule，SJG)，由11味傳統(tǒng)中藥材組成，純中藥復(fù)方制劑，屬于國(guó)家四類新藥，也是國(guó)家二級(jí)中藥保護(hù)品種，在臨床上主要適用于II型糖尿病氣陰兩虛證患者，臨床數(shù)據(jù)顯示效果良好。方中人參為扶陽益陰之良品，黃芪為補(bǔ)氣升陽之要藥，兩者共為君藥；臣以生地、麥冬、天花粉生津潤(rùn)燥而止渴；佐以枸杞子、五味子、覆盆子封固腎關(guān)；使以山藥、茯苓、澤瀉三焦并理。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：人參中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1均有降糖活性，2015版中國(guó)藥典規(guī)定人參莖葉總皂苷的質(zhì)量控制指標(biāo)成分是人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1；黃芪中黃芪甲苷、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮均有降糖活性，2015版中國(guó)藥典規(guī)定黃芪藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)成分是黃芪甲苷；現(xiàn)代藥理學(xué)研究亦證明生地中的低聚糖、梓醇、地黃苷D均有降糖效果；五味子醇甲是中國(guó)藥典中規(guī)定的檢測(cè)五味子藥材的指標(biāo)性成分；麥冬、天花粉、枸杞子、山藥、茯苓發(fā)揮降糖效果的主要是多糖類物質(zhì)或凝集素類化合物。

美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)提倡，糖尿病治療的目標(biāo)是把血糖降至正常水平或接近正常水平，同時(shí)減少并發(fā)癥的發(fā)生，參芪降糖顆粒多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)更適于糖尿病的治療。查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前，已報(bào)道的對(duì)參芪降糖顆粒的質(zhì)量控制主要是：通過薄層鑒別了人參皂苷和黃芪皂苷，并用5％香草醛-冰乙酸法測(cè)定人參總皂苷和黃芪總皂苷的含量；利用HPLC法測(cè)定了參芪降糖顆粒中人參皂苷Re和Rg1的含量。以上方法大多只是對(duì)參芪降糖制劑中的一種或兩種成分進(jìn)行定性定量分析，不能反映整個(gè)復(fù)方制劑的質(zhì)量水平，且各有不足，比如：選擇性差、靈敏度低、試劑污染環(huán)境等。HPLC-Q-MS聯(lián)用已成為復(fù)雜體系分離分析以及化合物結(jié)構(gòu)鑒定的良好平臺(tái)，但迄今未見使用此技術(shù)對(duì)參芪降糖制劑中的多類活性成分同時(shí)進(jìn)行分析的文獻(xiàn)報(bào)道，更重要的是，HPLC-Q-MS的高靈敏度、高選擇性和高分辨率能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)HPLC的不足，并可以對(duì)復(fù)雜的中藥復(fù)方制劑的多類成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是對(duì)參芪降糖制劑建立同時(shí)測(cè)定10個(gè)活性成分的含量的方法，所述的10個(gè)活性成分分別為：人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、黃芪甲苷、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙。并且，本發(fā)明利用Chempattern軟件對(duì)上述含量測(cè)定方法得到的參芪降糖制劑液相圖建立指紋圖譜，進(jìn)行相似度分析，以期更科學(xué)全面的評(píng)價(jià)參芪降糖制劑產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，為建立更高水平的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。本發(fā)明方法可應(yīng)用于參芪降糖制劑的整體質(zhì)量控制。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種參芪降糖制劑(通常為片劑、膠囊劑或顆粒劑)含量測(cè)定方法，所述方法測(cè)定的是參芪降糖制劑中10個(gè)活性成分的含量，所述的10個(gè)活性成分分別為：人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、黃芪甲苷、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙，所述方法包括如下步驟：

(1)制備混合對(duì)照品溶液

分別稱取對(duì)照品：人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、黃芪甲苷、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙，以甲醇為溶劑，配制成混合對(duì)照品溶液母液；

步驟(1)中，推薦所配制的混合對(duì)照品溶液母液中，人參皂苷Rb1的終濃度為99.3325μg/mL、人參皂苷Rc的終濃度為109.2657μg/mL、人參皂苷Rd的終濃度為141.0522μg/mL、人參皂苷Rg1的終濃度為152.5747μg/mL、人參皂苷Re的終濃度為224.4914μg/mL、黃芪甲苷的終濃度為52.4476μg/mL、五味子甲素的終濃度為42.9116μg/mL、五味子乙素的終濃度為55.6262μg/mL、五味子醇甲的終濃度為55.6262μg/mL、五味子醇乙的終濃度為127.1456μg/mL。

(2)制備內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液

稱取內(nèi)標(biāo)物丹參酮IIA，以甲醇為溶劑，配制成內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液；

步驟(2)中，推薦所配制的內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液中，丹參酮IIA的濃度為80μg/mL。

(3)制備供試品溶液

將參芪降糖制劑粉碎(至40目)，稱取粉碎后的參芪降糖制劑粉末與甲醇混合(料液質(zhì)量比3：50，g/mL)，超聲提取(40KHz，1h)，提取液減壓蒸除溶劑，得到浸膏；將所得浸膏加水溶解(料液質(zhì)量比1：10，g/mL)，再用水飽和正丁醇溶液萃取，收集萃取液(正丁醇液層)減壓蒸除溶劑，冷凍干燥，得到參芪降糖制劑提取物；以甲醇為溶劑，配制所得參芪降糖制劑提取物溶液，離心(13000rpm，10min)，取上清液，過微孔濾膜(孔徑通常為0.45μm或0.22μm)，得到供試品溶液；

步驟(3)中，推薦所配制的參芪降糖制劑提取物溶液中，參芪降糖制劑提取物的濃度為2mg/mL。

(4)供試品檢測(cè)

采用HPLC-Q-MS儀器，在步驟(3)制備的供試品溶液中加入步驟(2)制備的內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液(推薦所述內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積用量為所述供試品溶液體積的0.04倍)，進(jìn)樣檢測(cè)，得到供試品的質(zhì)譜圖；

所述HPLC-Q-MS儀器的工作參數(shù)條件如下：

液相色譜分離條件為：色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，粒徑≤5μm(優(yōu)選5μm、3.5μm或1.8μm)，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1％的甲酸水溶液，采用梯度洗脫，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進(jìn)樣體積20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm；

單四級(jí)桿質(zhì)譜條件為：采用ESI電噴霧離子源，電壓：3000V，霧化室溫度350℃，干燥氣流速12.0L/min，正離子模式，SIM離子監(jiān)測(cè)模式，開啟離子監(jiān)測(cè)通道1、離子監(jiān)測(cè)通道2。

(5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取步驟(1)配制的混合對(duì)照品溶液母液，按照不同濃度梯度稀釋成若干份(推薦7份)混合對(duì)照品溶液試樣，在每份混合對(duì)照品溶液試樣中加入步驟(2)制備的內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液(推薦所述內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積用量為每份混合對(duì)照品溶液試樣體積的0.04倍)，然后采用HPLC-Q-MS儀器，按照步驟(4)中的工作參數(shù)條件進(jìn)行檢測(cè)，得到混合對(duì)照品的質(zhì)譜圖；以混合對(duì)照品中各個(gè)單一對(duì)照品各自的進(jìn)樣濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，質(zhì)譜圖中各個(gè)單一對(duì)照品各自對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而得到線性回歸方程，即分別得到對(duì)照品人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、黃芪甲苷、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙的標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性回歸方程；

步驟(5)中，推薦所述的混合對(duì)照品溶液母液按1、2.5、5、10、25、50、100倍的梯度稀釋成7份混合對(duì)照品溶液試樣。

(6)供試品含量檢測(cè)結(jié)果

將步驟(4)測(cè)得的供試品質(zhì)譜圖中各個(gè)活性成分化合物各自相應(yīng)峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值代入步驟(5)中得到的各對(duì)照品的線性回歸方程，計(jì)算得到供試品溶液中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、黃芪甲苷、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙的含量，進(jìn)而計(jì)算得到參芪降糖制劑中10種活性成分的含量。

進(jìn)一步，所述步驟(4)中，所述液相色譜分離梯度洗脫的洗脫溶劑按如下時(shí)間順序進(jìn)行(表中的百分號(hào)的含義為體積百分?jǐn)?shù))：

進(jìn)一步，所述步驟(4)中，所述單四級(jí)桿質(zhì)譜SIM離子監(jiān)測(cè)模式下，雙通道監(jiān)測(cè)目標(biāo)化合物的名稱、分子式、監(jiān)測(cè)開啟時(shí)間和監(jiān)測(cè)離子分子量如下所示：

離子監(jiān)測(cè)通道1監(jiān)測(cè)的化合物信息

離子監(jiān)測(cè)通道2監(jiān)測(cè)的化合物信息

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有參芪降糖制劑質(zhì)量控制方法的不足，首次提出利用HPLC-Q-MS測(cè)定參芪降糖制劑中多指標(biāo)成分含量的方法，以降糖活性為導(dǎo)向選取參芪降糖制劑中有降糖活性且含量較高的人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、黃芪甲苷、五味子甲素、五味子醇甲、五味子醇乙、人參皂苷Rc、五味子乙素10種化合物作為指標(biāo)性成分。本發(fā)明使參芪降糖制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法更具科學(xué)性、系統(tǒng)性和專屬性，同時(shí)也可為原料藥中人參、黃芪、五味子的鑒別提供一定參考，為進(jìn)一步提高參芪降糖制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明以化合物降糖活性為導(dǎo)向檢測(cè)復(fù)方中的多種活性物質(zhì)，避免了只測(cè)定一、兩個(gè)化學(xué)成分而判定參芪降糖制劑整體質(zhì)量的片面性，從而更好的反應(yīng)整個(gè)復(fù)方制劑的質(zhì)量水平；

(2)本發(fā)明選取Q-MS離子監(jiān)測(cè)模式(SIM)進(jìn)行含量測(cè)定，質(zhì)譜定量準(zhǔn)確性高、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，優(yōu)于傳統(tǒng)HPLC分析方法；

(3)本發(fā)明方法得到的不同批次參芪降糖制劑液相圖，利用Chempattern軟件建立參芪降糖制劑指紋圖譜，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，更科學(xué)全面的評(píng)價(jià)參芪降糖制劑產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，為建立更高水平的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

(四)附圖說明

圖1：實(shí)施例1中參芪降糖顆粒供試品溶液在洗脫程序1下的液相色譜圖；

圖2：實(shí)施例1中參芪降糖顆粒供試品溶液在洗脫程序2下的液相色譜圖；

圖3：實(shí)施例2中混合對(duì)照品溶液在洗脫程序2下的離子監(jiān)測(cè)通道1質(zhì)譜圖；

圖4：實(shí)施例2中混合對(duì)照品溶液在洗脫程序2下的離子監(jiān)測(cè)通道2質(zhì)譜圖；

圖5：實(shí)施例2中參芪降糖顆粒供試品溶液在洗脫程序2下的離子監(jiān)測(cè)通道1質(zhì)譜圖；

圖6：實(shí)施例2中參芪降糖顆粒供試品溶液在洗脫程序2下的離子監(jiān)測(cè)通道2質(zhì)譜圖；

圖7：實(shí)施例2中參芪降糖顆粒批次001135在洗脫程序2下的液相色譜圖；

圖8：實(shí)施例2中不同批次參芪降糖顆粒供試品溶液的液相色譜指紋圖譜；

圖9：實(shí)施例2中參芪降糖顆粒批間指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)示意圖。

(五)具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

實(shí)施例1

參芪降糖制劑色譜分離條件的優(yōu)化，包括以下步驟：

考察了不同洗脫梯度對(duì)參芪降糖制劑供試品溶液化學(xué)成分分離情況的影響。

(1)色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(4.6×250mm i.d.，5μm)；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以體積百分?jǐn)?shù)為0.1％的甲酸水溶液為流動(dòng)相B；洗脫方式為：線性梯度洗脫，洗脫程序1見表1；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)203nm。所得液相色譜圖見附圖1，圖中可以看出，此洗脫程序不能完全將參芪降糖顆粒中的成分洗脫出色譜柱。

表1.洗脫程序1

(2)色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(4.6×250mm i.d.，5μm)；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以體積百分?jǐn)?shù)為0.1％的甲酸水溶液為流動(dòng)相B；洗脫方式為：線性梯度洗脫，洗脫程序2見表2；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)203nm。所得液相色譜圖見附圖2，圖中可以看出，各色譜峰分離良好，洗脫完全。

表2.洗脫程序2

實(shí)施例2

參芪降糖制劑HPLC-Q-MS含量測(cè)定方法的構(gòu)建及應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)儀器與試藥：

Agilent 1290高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，Agilent 6120單四級(jí)桿質(zhì)譜儀(安捷倫科技有限公司)，KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，R210+V700型旋蒸蒸發(fā)儀(瑞士，BUCHI)，AR224CN電子天平(奧豪斯儀器有限公司)，移液槍一套(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(4.6×250mm i.d.，5μm)；

試藥：對(duì)照品

表3. 10個(gè)對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物丹參酮IIA的化合物信息

參芪降糖顆粒：山東魯南厚樸制藥廠生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10950075，為顆粒劑，每包重3g。

(2)混合對(duì)照品溶液制備：

精密稱取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、黃芪甲苷、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙，以甲醇溶解，配制成母液終濃度分別為：99.3325μg/mL、109.2657μg/mL、141.0522μg/mL、152.5747μg/mL、224.4914μg/mL、52.4476μg/mL、42.9116μg/mL、55.6262μg/mL、55.6262μg/mL、127.1456μg/mL的混合對(duì)照品溶液，按需稀釋成不同濃度。

(3)內(nèi)標(biāo)物溶液制備：

精密稱取丹參酮IIA，甲醇溶解，配制成濃度為80μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

(4)供試品溶液制備：

稱取參芪降糖顆粒3.0g至量瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量。(400KW)超聲提取60min，后靜置放冷，以甲醇彌補(bǔ)減失重量。常壓過濾，得參芪降糖顆粒粗提液。減壓蒸餾，得參芪降糖顆粒提取浸膏，20mL去離子水溶解，20mL水飽和正丁醇溶液振搖萃取3次。收集正丁醇萃取液減壓蒸餾至浸膏狀，轉(zhuǎn)移至凍干機(jī)冷凍干燥，得參芪降糖顆提取物粉末。甲醇溶解，配制成2mg/mL的參芪降糖顆粒提取物的溶液，高速離心10min(13000rpm)，取上清液，過0.22μm微孔濾膜，得供試樣品溶液；

(5)高效液相色譜分離條件：

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(4.6x250mm i.d.，5μm)；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以體積百分?jǐn)?shù)為0.1％的甲酸水溶液為流動(dòng)相B；洗脫方式為：線性梯度洗脫，洗脫程序見表4；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；

表4.梯度洗脫程序

(6)質(zhì)譜檢測(cè)條件：

單四級(jí)桿質(zhì)譜儀，離子源：ESI電噴霧離子源；電壓：3000V，霧化室溫度350℃，干燥器流速12.0L/min，正離子模式，SIM離子監(jiān)測(cè)模式，開啟離子監(jiān)測(cè)通道1、離子監(jiān)測(cè)通道2；

離子監(jiān)測(cè)通道1對(duì)8個(gè)化合物與1個(gè)內(nèi)標(biāo)正離子模式下各監(jiān)測(cè)SIM離子與監(jiān)測(cè)開啟時(shí)間如下表5所示：

表5.離子監(jiān)測(cè)通道1監(jiān)測(cè)的化合物信息

離子監(jiān)測(cè)通道2對(duì)2個(gè)化合物與1個(gè)內(nèi)標(biāo)正離子模式下各監(jiān)測(cè)SIM離子與監(jiān)測(cè)開啟時(shí)間如下表6所示：

表6.離子監(jiān)測(cè)通道2監(jiān)測(cè)的化合物信息

(7)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

混合對(duì)照品溶液在母液的基礎(chǔ)上稀釋1、2.5、5、10、25、50、100倍，配制成不同濃度梯度的混合對(duì)照品溶液，分別加入混合對(duì)照品溶液0.04倍體積的丹參酮IIA內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，分別取20μl注入液相色譜儀，離子監(jiān)測(cè)通道1質(zhì)譜圖見附圖3、離子監(jiān)測(cè)通道2質(zhì)譜圖見附圖4。以各自標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，以質(zhì)譜圖中各標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程見下表7。

表7.參芪降糖顆粒10種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線

(8)精密度實(shí)驗(yàn)

a、日內(nèi)精密度：按照上述色譜與質(zhì)譜條件，精密吸取混合對(duì)照品溶液一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各色譜峰的保留時(shí)間(t_R)以及峰面積比(P_a，分析物峰面積/內(nèi)標(biāo)物峰面積)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來考察日內(nèi)精密度；

b、日間精密度：按照上述色譜與質(zhì)譜條件，吸取混合對(duì)照品溶液分3天進(jìn)樣，計(jì)算方法同日內(nèi)精密度；

日間精密度與日內(nèi)精密度數(shù)據(jù)顯示儀器精密度良好；

表8.儀器精密度與方法重復(fù)性考察結(jié)果

(9)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一(山東魯南厚樸制藥廠，批次00113295)參芪降糖顆粒樣品5份，按照上述供試品溶液制備方法制備5份同一批次的供試品溶液，按照上述色譜與質(zhì)譜條件，精密進(jìn)樣。計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示方法的重復(fù)性良好。見表8。

(10)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一(山東魯南厚樸制藥廠，批次00113295)參芪降糖顆粒樣品，按照上述供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照上述色譜與質(zhì)譜條件，分別于0、4、8、12和24時(shí)測(cè)定。結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)過程中分析物很穩(wěn)定，見表9。

(11)加樣回收率實(shí)驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定回收率來考察方法的準(zhǔn)確性，加入近似于樣品中分析物濃度的0.5倍的各標(biāo)準(zhǔn)品，按照上述色譜與質(zhì)譜條件，精密進(jìn)樣3次，測(cè)含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見下表9。

表9.樣品穩(wěn)定性與加樣回收率結(jié)果

(12)參芪降糖制劑含量測(cè)定應(yīng)用

按照擬定的含量測(cè)定方法對(duì)來源于山東魯南厚樸制藥廠的批號(hào)00113295的參芪降糖顆粒進(jìn)行含量測(cè)定，含量測(cè)定結(jié)果如下表10所示，離子監(jiān)測(cè)通道1質(zhì)譜圖見附圖5、離子監(jiān)測(cè)通道2質(zhì)譜圖見附圖6。

表10.山東魯南厚樸制藥廠批號(hào)00113295的參芪降糖顆粒含量測(cè)定結(jié)果(μg/g)

按照同樣方法，對(duì)山東魯南厚樸制藥廠生產(chǎn)的另外9個(gè)不同批次的樣品進(jìn)行含量測(cè)定，含量測(cè)定結(jié)果見下表11(批次00113295同樣列于下表)。

表11. 10個(gè)批次的參芪降糖顆粒含量測(cè)定結(jié)果(μg/g)

注：“/”表示峰面積已低于定量限。

以上對(duì)參芪降糖制劑(顆粒)的含量測(cè)定的方法學(xué)考察結(jié)果顯示：該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率結(jié)果良好，能夠準(zhǔn)確、快捷地測(cè)定樣品中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、黃芪甲苷、五味子甲素、五味子醇甲、五味子醇乙、人參皂苷Rc、五味子乙素10種成分的含量，可用于參芪降糖制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究中。

(13)參芪降糖制劑指紋圖譜建立

按上述含量測(cè)定的高效液相色譜方法，取上述參芪降糖顆粒供試品溶液20μl注入液相色譜儀，得到參芪降糖顆粒液相譜圖，見附圖7。

對(duì)上述含量測(cè)定的10個(gè)成分在液相圖上進(jìn)行標(biāo)定，其中人參皂苷Rb1與黃芪甲苷液相峰中混有雜質(zhì)，因此以剩余8個(gè)成分作為特征峰，利用Chempattern軟件建立參芪降糖顆粒液相色譜指紋圖譜，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。參芪降糖顆粒液相色譜指紋圖譜見附圖8，其中1-8號(hào)峰分別為：人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素。相似度評(píng)價(jià)示意圖見附圖9，其中縱坐標(biāo)代表相似度。

結(jié)果顯示，10批次參芪降糖顆粒液相譜圖相似度均大于0.985，相似度良好。