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技術領域：
】本發(fā)明涉及用于檢測作為B型肝炎病毒的表面抗原的HBs抗原的樣品的預處理方法及利用該方法的HBs抗原的檢測方法。另外，本發(fā)明涉及用于檢測HBs抗原的預處理用試劑盒。
背景技術：
：B型肝炎是由B型肝炎病毒(HBV)引起的肝臟的疾病。HBV是主要由包膜部分及核心部分構成的球狀的病毒。在包膜部分存在HBs抗原，在核心部分存在基因組DNA、HBc抗原及HBe抗原等。被HBV感染，則HBs抗原被釋放到宿主的血液中，其量伴隨肝炎的進行而增加。所以，在B型肝炎的檢查中，首先測定血液中的HBs抗原。檢查的結果，當是HBs抗原陽性時，顯示受試者被HBV感染。相反，當是HBs抗原陰性時，顯示受試者未被HBV感染。另一方面，B型肝炎發(fā)癥后，在宿主的體內產(chǎn)生作為HBs抗原的中和抗體的HBs抗體。通過本B型肝炎的檢查中也測定HBs抗體，可研究受試者的過去的感染的有無。在臨床上，當是HBs抗原陰性并且HBs抗體陽性時，被認為B型肝炎被治愈。但是，根據(jù)最近的研究得知，B型肝炎即使被治愈，HBV的基因之一部分殘留在肝臟或末梢單核細胞。于是，近年知，對于過去曾被HBV感染的惡性腫瘤患者或類風濕患者使用治療用免疫抑制劑時，HBV再活化而引起重癥肝炎。那樣的肝炎被稱為“新生B型肝炎”，與通常的B型肝炎比，顯示劇癥化的頻度及死亡率高。在這樣的新生B型肝炎的劇癥化的預防中，認為發(fā)癥的初期開始治療是有效的。為此，在其初期階段發(fā)現(xiàn)病毒的再活化變得重要。但是，在再活化的初期階段，認為不僅HBV的病毒量尚是微量，也存在患者來源的HBs抗體?；颊邅碓吹腍Bs抗體與HBs抗原結合而是妨礙該抗原的檢測的要因，所以為了HBV的再活化的早期發(fā)現(xiàn)，需要非常高的靈敏度的檢查。作為HBV的檢測靈敏度高的檢查，已知利用PCR法的檢查。在此檢查中，通過將HBV的DNA用PCR法擴增來檢測HBV。但是，一般而言，此檢查多是將待測樣品送到可實施該檢查的機關而進行，所以至得到檢查結果需要時間。另外，檢查所耗的成本也高。另一方面，由免疫學方法的HBs抗原的檢查與由PCR法的檢查比，至得到檢查結果的時間短，另外成本也低。作為由那樣的免疫學方法的HBs抗原的檢測方法，例如，在專利文獻1中記載了通過使用堿劑或表面活性劑等的變性劑預處理樣品，使患者來源的HBs抗體變性之后，使用檢測用的指定的抗HBs抗體檢測HBs抗原的方法。【現(xiàn)有技術文獻】【專利文獻】專利文獻1：國際公開第2006/033368號技術實現(xiàn)要素：【發(fā)明要解決的技術課題】在由免疫學方法檢測樣品中的HBs抗原的方法中，受試者來源的HBs抗體成為HBs抗原的檢測的妨礙，所以有將其預先滅活的必要。例如，在專利文獻1中記載的方法中記載，為了使患者來源的HBs抗體變性，作為處理時的濃度，以0.25～1N的氫氧化鈉有效果。另一方面，氫氧化鈉也作用于HBs抗原而使變性，所以有該抗原的抗原性喪失，HBs抗原的檢測靈敏度降低的情況。如HBV的再活化的初期階段一樣，當不僅HBs抗原是微量，不得不從被認為也存在受試者來源的HBs抗體的樣品檢測該抗原時，需求可不實質上損害HBs抗原的抗原性，使受試者來源的HBs抗體變性而滅活，并且以高的靈敏度的HBs抗原的檢測的方法。本發(fā)明，鑒于這樣的情況，以提供可不實質上損害HBs抗原的抗原性，使受試者來源的HBs抗體變性滅活，并且以高的靈敏度的HBs抗原的檢測的樣品的預處理方法及HBs抗原的檢測方法作為目的。另外，本發(fā)明以提供可在那樣的方法中適宜地使用的樣品的預處理用試劑盒作為目的?！窘鉀Q課題的技術方案】本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過將含HBs抗原和受試者來源的HBs抗體的樣品用終濃度0.012～0.15N的極其低的濃度的堿性物質處理，可不實質上受受試者來源的HBs抗體的影響，以高靈敏度檢測HBs抗原，從而完成本發(fā)明。即，本發(fā)明提供用于檢測HBs抗原的樣品的預處理方法，其包括：通過將疑似含HBs抗原的樣品和含有堿性物質的預處理液混合至該堿性物質的終濃度成0.012～0.15N而處理該樣品的工序，將處理工序中得到的樣品用含有酸性物質的試劑中和的工序。另外，本發(fā)明提供HBs抗原的檢測方法，其包括：通過將疑似含HBs抗原的樣品和含有堿性物質的預處理液混合至該堿性物質的終濃度成0.012～0.15N而處理該樣品的工序，將處理工序中得到的樣品用含有酸性物質的試劑中和的工序，向中和工序中得到的樣品添加與HBs抗原結合的標記抗體、載體粒子、以及與HBs抗原及該載體粒子結合的第1抗體，使在上述的載體粒子上形成含HBs抗原、該標記抗體及該第1抗體的復合物的工序，選擇性地回收形成工序中得到的樣品中的載體粒子的工序，使回收工序中得到的載體粒子上的復合物游離，轉移到與該載體粒子不同的固相的工序，測定轉移工序中得到的固相上的復合物中含的標記抗體的標記的工序，基于測定工序的結果，檢測疑似含上述的HBs抗原的樣品中的HBs抗原的工序。再者，本發(fā)明提供用于檢測HBs抗原的預處理用試劑盒，其含：含有堿性物質的第1試劑，和含有對于中和堿性物質而言充分的量的酸性物質的第2試劑?！景l(fā)明效果】上述的本發(fā)明的樣品的預處理方法及利用該方法的本發(fā)明的HBs抗原的檢測方法可不使樣品中含的檢測對象的HBs抗原實質上變性而滅活妨礙HBs抗原的檢測的HBs抗體。從而，由這些本發(fā)明的方法，即使HBs抗原是微量，且是也存在受試者來源的HBs抗體的樣品，也可以良好的靈敏度檢測HBs抗原。另外，本發(fā)明的樣品的預處理用試劑盒可在那樣的方法中適宜地使用。【附圖說明】【圖1】是顯示將HBV陽性患者的血清(HBV6290-6)在堿性物質的存在下預處理，將該血清中的HBs抗原使用標記抗體檢測時的結果(發(fā)光強度)的坐標圖?！緢D2】是顯示將HBV陽性患者的血清(HBV11048-6)在堿性物質的存在下預處理，將該血清中的HBs抗原使用標記抗體檢測時的結果(發(fā)光強度)的坐標圖?！緢D3】是顯示將HBV陽性患者的血清(HBV6272-6)在堿性物質的存在下預處理，將該血清中的HBs抗原使用標記抗體檢測時的結果(發(fā)光強度)的坐標圖?！緦嵤┓绞健吭诒菊f明書中，“預處理”是指，在將疑似含HBs抗原的樣品供于該抗原的檢測方法前，將該樣品處理成對于檢測適宜的狀態(tài)。另外，本發(fā)明的樣品的預處理方法，例如，可將以下說明的“處理工序”和“中和工序”用手動方法進行，或者也可將“處理工序”用手動方法進行，將“中和工序”用裝置進行。在本發(fā)明的樣品的預處理方法(以下也稱為“預處理方法”)中，首先，通過將疑似含HBs抗原的樣品和含有堿性物質的預處理液混合至該堿性物質的終濃度成0.012～0.15N而進行處理該樣品的工序(以下也稱為“處理工序”)。在此處理工序中，由預處理液中含的堿性物質的作用，樣品中的HBs抗體被變性而滅活。再有，處理工序中的堿性物質的終濃度只要在上述的范圍內，就不特別限定，例如，可舉出0.012、0.013、0.014、0.015、0.016、0.017、0.018、0.019、0.020、0.030、0.040、0.050、0.060、0.070、0.080、0.090、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14及0.15N。疑似含HBs抗原的樣品只要是活體樣品或自該活體樣品制備的樣品，就不特別限定。作為那樣的活體樣品，可舉出組織、細胞、體液、分泌物及排泄物等。具體而言，可舉出全血、血漿、血清、淋巴液、骨髓液、膽汁、胃腸分泌物、精液、唾液、母乳、尿、糞便等。另外，作為自活體樣品制備的樣品，可舉出該活體樣品的稀釋液、懸浮液、提取液、勻漿物。例如，可舉出組織或細胞的提取液、或者組織或細胞的勻漿物。在本發(fā)明的實施方式中，預處理液中的堿性物質優(yōu)選為現(xiàn)有技術中公知的強堿。那樣的強堿可從堿金屬及堿土金屬的氫氧化物、氫化物及酰胺化物選擇至少1種。在它們之中，特別優(yōu)選為氫氧化鈉、氫氧化鉀及氫氧化鎂。預處理液中的堿性物質的濃度只要是在混合該預處理液和疑似含上述的HBs抗原的樣品時，可使該堿性物質的終濃度成0.012～0.15N的濃度，就不特別限定。從而，當樣品是液體時，預處理液中的堿性物質的濃度可根據(jù)該樣品和預處理液的混合比(體積比)適宜設定。例如，當將樣品和預處理液以體積比表示1:1混合時，該預處理液中的堿性物質的濃度設為0.024～0.3N即可。在本發(fā)明的實施方式中，處于液體的形態(tài)的樣品和預處理液的混合比不特別限定，但優(yōu)選為，以體積比表示1:1～1:0.5。在本發(fā)明的實施方式中，為了由堿性物質的作用除去滅活的HBs抗體及/或其他夾雜物，上述的預處理液優(yōu)選為再含非離子性表面活性劑。那樣的非離子性表面活性劑不特別限定，但優(yōu)選為選自公知的聚氧乙烯系非離子性表面活性劑。作為聚氧乙烯系非離子性表面活性劑，例如，可舉出聚氧乙烯烷基醚(Brij(注冊商標)35、Brij(注冊商標)45等)、聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton(注冊商標)X-100、Triton(注冊商標)X-114、NP-40(注冊商標)等)、聚氧乙烯山梨坦脂肪酸酯(Tween(注冊商標)-20、Tween(注冊商標)-80等)等，可使用它們之中的至少1種。在它們之中，也特別優(yōu)選為聚氧乙烯烷基醚。預處理液中的非離子性表面活性劑的濃度不特別限定，但優(yōu)選為是混合該預處理液和樣品時HBs抗原不實質上變性的濃度。例如，當預處理液含Brij(注冊商標)35時，其濃度只要是，混合該預處理液和樣品時，Brij(注冊商標)35的終濃度可成0.05～0.5％的濃度即可。在本發(fā)明的實施方式中，為了由堿性物質的作用除去滅活的HBs抗體及/或其他夾雜物，上述的預處理液優(yōu)選為再含離液劑。其中，離液劑是指有不穩(wěn)定化蛋白質的分子結構的作用的物質。那樣的離液劑不特別限定，例如，可舉出尿素、胍鹽酸鹽、水楊酸鈉、硫代氰酸鈉、過氯酸鈉、乙酰胺、甲酰胺等，可使用它們之中的至少1種。在它們之中，也特別優(yōu)選為尿素。預處理液中的離液劑的濃度不特別限定，但優(yōu)選為是混合該預處理液和樣品時HBs抗原不實質上變性的濃度。例如，當預處理液含尿素時，其濃度只要是，混合該預處理液和樣品時，尿素的終濃度可成0.05～1M的濃度即可。在本發(fā)明的實施方式中，上述工序中的處理溫度及處理時間可根據(jù)預處理液的組成、樣品的種類、預處理液和樣品的混合量等的條件適宜設定。通常而言，混合預處理液和樣品的后，只要混合物在15～25℃的溫度下靜置5～10分鐘即可。在本發(fā)明的預處理方法中，進行將上述的處理工序中得到的樣品用含有酸性物質的試劑中和的工序(以下也稱為“中和工序”)。在此中和工序中，優(yōu)選將上述的處理工序中得到的樣品和含有酸性物質的試劑混合至中和后的樣品的pH成6.5～8。在本發(fā)明的實施方式中，中和工序中使用的試劑中的酸性物質的種類不特別限定。作為那樣的酸性物質，例如，可舉出檸檬酸、醋酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸、磷酸、蟻酸、富馬酸、酒石酸、鹽酸及硫酸等，可使用它們之中的至少1種。在它們之中，也特別優(yōu)選為檸檬酸。在本發(fā)明的實施方式中，試劑中的酸性物質的濃度只要是在混合上述的處理工序中得到的樣品和含有酸性物質的試劑時，使得到的樣品的pH成6.5～8的濃度，就不特別限定。那樣的濃度可根據(jù)該酸性物質的種類、處理工序中得到的樣品的量等適宜決定。例如，作為酸性物質使用檸檬酸時，試劑中的檸檬酸濃度優(yōu)選為0.03～0.16M。在本發(fā)明的實施方式中，中和工序中的處理溫度及處理時間不特別限定，但通常是，將上述的處理工序中得到的樣品和含有酸性物質的試劑混合后，將混合物在15～25℃的溫度下靜置1～10分鐘即可。在本發(fā)明的實施方式中，將預處理方法在后述的HBs抗原的檢測方法中利用時，上述的預處理液、或者含有酸性物質的試劑，優(yōu)選再含還原劑。由此，還原劑的存在可在后述的回收工序中抑制載體粒子的凝集。那樣的還原劑優(yōu)選為有使蛋白質的二硫鍵解離的作用的還原劑。例如，可舉出巰基乙基胺、巰基乙醇、二硫代蘇糖醇、半胱氨酸、二硫代赤蘚糖醇、硼氫化鈉、膦等。在它們之中，特別優(yōu)選為巰基乙基胺、二硫代蘇糖醇及半胱氨酸鹽酸鹽。在本發(fā)明的實施方式中，預處理液、或者含有酸性物質的試劑中的還原劑的濃度只要是不給后述的形成工序帶來影響的濃度，就不特別限定。例如，使用巰基乙基胺時，其濃度優(yōu)選為10～60mM。在本發(fā)明的實施方式中，將預處理方法在后述的HBs抗原的檢測方法中利用時，上述的預處理液、或者含有酸性物質的試劑優(yōu)選再含無機鹽類。由此，無機鹽類的存在，可在后述的回收工序中抑制載體粒子的凝集。作為那樣的無機鹽類，例如，可舉出氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鈉等。在它們之中，也特別優(yōu)選為氯化鈉、氯化鉀及硫酸鈉。在本發(fā)明的實施方式中，預處理液、或者含有酸性物質的試劑中的無機鹽類的濃度只要是不給后述的形成工序帶來影響的濃度，就不特別限定。例如，使用氯化鈉時，其濃度優(yōu)選為0.1～1M。在本發(fā)明的范圍內，也包括利用上述的本發(fā)明的預處理方法的HBs抗原的檢測方法。作為HBs抗原的檢測方法，只要是公知的免疫測定法，就不特別限定。在本發(fā)明的檢測方法中，以下說明的含“轉移工序”的免疫復合物轉移測定法在使用本發(fā)明的預處理方法以高靈敏度檢測HBs抗原的方面特別優(yōu)選的。接下來，對于本發(fā)明的HBs抗原的檢測方法(以下也稱為“檢測方法”)進行說明。在本發(fā)明的檢測方法中，使用將疑似含HBs抗原的樣品由本發(fā)明的預處理方法處理而得到的樣品，經(jīng)后述的各工序檢測HBs抗原。從而，本發(fā)明的檢測方法中的疑似含HBs抗原的樣品的預處理工序、及其隨后的中和工序的具體性的順序等與對本發(fā)明的預處理方法的說明中所述的同樣。繼上述的2個工序之后，在本發(fā)明的檢測方法中，向中和工序中得到的樣品添加與HBs抗原結合的標記抗體、載體粒子、以及與HBs抗原及該載體粒子結合的第1抗體，進行使含HBs抗原、該標記抗體及該第1抗體的復合物在上述的載體粒子上形成的工序(以下也稱為“形成工序”)。在本發(fā)明的實施方式中，與HBs抗原結合的標記抗體(以下也簡稱為“標記抗體”)只要是可與HBs抗原特異性地結合、并且用在免疫學方法中慣用的公知的標記物質標記的抗體，就不特別限定。那樣的標記抗體可由使用適當?shù)慕宦?lián)劑或市售的標記試劑盒等的公知的方法，通過使抗HBs抗體和標記物質結合或連結來制作。再有，標記的抗體也可為Fab、F(ab')2等的抗原結合性抗體片段或其衍生物。在本發(fā)明的實施方式中，標記物質只要是可發(fā)可檢測或測定的信號的物質，就不特別限定，例如，可舉出酶、熒光物質、放射性同位元素等。作為酶，可舉出堿性磷酸酶、過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶、螢光素酶等。作為熒光物質，可舉出異硫氰酸熒光素(FITC)等的熒光染料、綠色熒光蛋白質(GFP)等的熒光蛋白質等。作為放射性同位元素，可舉出125I、14C、32P等。在它們之中，作為標記物質特別優(yōu)選為酶。在本發(fā)明的實施方式中，載體粒子可選自在免疫學方法中慣用的公知的粒子。作為那樣的載體粒子，例如，可舉出磁性粒子、乳膠粒子、紅細胞、明膠粒子等。在它們之中，特別優(yōu)選為磁性粒子。其中，磁性粒子是指將有磁性的材料作為基材含有的粒子。這樣的磁性粒子是現(xiàn)有技術中公知的，作為基材，可舉出含F(xiàn)e2O3及/或Fe3O4、鈷、鎳、千枚巖、磁鐵礦等的粒子。在本發(fā)明的實施方式中，與HBs抗原及載體粒子結合的第1抗體(以下簡稱為“第1抗體”)只要是和與上述的標記抗體所結合的HBs抗原的表位不同的表位由抗原抗體反應特異性地結合，并且可上述的與載體粒子結合的抗體，就不特別限定。其中，該第1抗體和載體粒子的結合樣式只要是可解離的結合，就不特別限定，例如，可舉出物理吸附、離子鍵等。另外，也可使用介于第1抗體和載體粒子之間的物質，使兩者結合。作為那樣的物質，優(yōu)選為互相特異性地結合，并且可解離的2個物質的組合(為方便起見、將2個物質各自稱為“物質A”及“物質B”)。例如，通過使物質A作為“與載體粒子的結合部位”與第1抗體結合，使物質B與載體粒子結合，利用物質A和物質B的親和性，可使第1抗體和載體粒子結合。那樣的物質A及物質B的組合是現(xiàn)有技術中公知的，例如，可舉出抗原(除HBs抗原之外)及其抗體、配體及其受體、寡核苷酸及其互補鏈、生物素(或者脫硫生物素)和親和素(或者鏈霉親和素)、鎳和組氨酸標簽、谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-轉移酶等的組合。再有，作為抗原和其抗體的組合，優(yōu)選為半抗原和抗半抗原抗體、及生物素(或者脫硫生物素)和抗生物素抗體(另外抗脫硫生物素抗體)。另外，作為半抗原和抗半抗原抗體的組合，特別優(yōu)選為2,4-二硝基苯酚(DNP)和抗DNP抗體。在本發(fā)明的實施方式中，上述的物質A及物質B之中，使任一方與第1抗體或載體粒子結合不特別限定，但使用抗原和其抗體的組合時，優(yōu)選使該抗原與第1抗體結合，使針對該抗原的抗體與載體粒子結合。再有，使上述的物質與抗體及載體粒子結合的方法是現(xiàn)有技術中公知的。例如，使抗體和生物素結合時，已知使用與該抗體中的氨基或巰基反應的交聯(lián)劑(例如，馬來酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺等)的方法。另外，作為使上述的物質和載體粒子結合的方法，已知物理吸附法、共價鍵法、離子鍵法等。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，作為載體粒子，通過使用固定與第1抗體結合的第2抗體的載體粒子，經(jīng)第2抗體使第1抗體和載體粒子結合。其中，第1抗體和第2抗體的結合樣式優(yōu)選為是可解離的結合。例如，優(yōu)選為使用固定使半抗原(例如DNP等)或生物素(或者脫硫生物素)結合的第1抗體和與該半抗原或生物素(或者脫硫生物素)特異性地結合的第2抗體的載體粒子。此時，將與半抗原或生物素(或者脫硫生物素)特異性地結合的抗體作為與第1抗體結合的第2抗體使用。在特別優(yōu)選的實施方式中，使用固定使DNP結合的第1抗體和抗DNP抗體的載體粒子。在此形成工序中，HBs抗原和上述的標記抗體由抗原抗體反應結合，上述的第1抗體由抗原抗體反應再與之結合，從而形成含“標記抗體-HBs抗原-第1抗體”的復合物。于是，通過該復合物中含的第1抗體和載體粒子結合，在該載體粒子上形成含“標記抗體-HBs抗原-第1抗體”的復合物。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，作為載體粒子，通過使用固定與第1抗體結合的第2抗體的載體粒子，在該載體粒子上形成含“標記抗體-HBs抗原-第1抗體-第2抗體”的復合物。在本發(fā)明的實施方式中，標記抗體、載體粒子及第1抗體的添加量不特別限定，可根據(jù)樣品的量等適宜確定。另外，可將標記抗體、第1抗體及載體粒子以各自順序添加到樣品，也可同時添加全部。其中，將標記抗體、第1抗體及載體粒子以各自順序添加到樣品時，可將標記抗體及第1抗體之任何先添加，但優(yōu)選將載體粒子在這些抗體之后添加?；蛘撸?抗體和載體粒子也可在進行形成工序之前預先結合。在本發(fā)明的實施方式中，形成工序中的反應溫度及反應時間不特別限定，但通常在20～45℃的溫度下靜置15～30分鐘，或者溫和攪拌即可。再有，將標記抗體、第1抗體及載體粒子以各自順序添加到樣品時，也可在每次添加各劑時設定反應時間。在本發(fā)明的檢測方法中，進行選擇性地回收上述的形成工序中得到的樣品中的載體粒子的工序(以下也稱為“回收工序”)。在該樣品中，使上述的復合物形成的載體粒子之外，還存在預處理液的構成成分、剩余的標記抗體及第1抗體等的夾雜物，但在此回收工序中，該載體粒子從那樣的夾雜物分離而被回收。從而，由此回收工序，可除去給后述的測定工序帶來惡影響的夾雜物。選擇性地回收樣品中的載體粒子的方法本身是現(xiàn)有技術中公知的，可根據(jù)使用的載體粒子的種類適宜確定。例如，使用磁性粒子時，由磁分離，可選擇性地回收樣品中的載體粒子。具體而言，使磁石接近放入形成工序中得到的樣品的容器的壁面，使樣品中的磁性粒子固定到容器的壁面，通過吸除液相，可選擇性地回收該粒子。另外，使用明膠粒子或乳膠粒子時，可通過由離心分離使該粒子沉淀之后，吸除液相而選擇性地回收。在本發(fā)明的實施方式中，回收工序可再含清洗回收的載體粒子的工序。載體粒子的清洗，例如，可向回收的載體粒子添加清洗液而懸浮的后，將該載體粒子如上述一樣通過從清洗液選擇性地回收來進行。作為清洗液，優(yōu)選為不損害在載體粒子上形成的復合物的緩沖液。作為那樣的清洗液，特別優(yōu)選為含表面活性劑的緩沖液，例如，可舉出TBS-T(含有0.05％Tween20的Tris緩沖生理鹽水)及PBST(含有0.05％Tween20的磷酸緩沖生理鹽水)等。另外，也可使用HISCL清洗液(Sysmex株式會社制)等的市售的清洗液。在本發(fā)明的檢測方法中，進行使上述的回收工序中得到的載體粒子上的復合物游離，轉移到與該載體粒子不同的固相的工序(以下也稱為“轉移工序”)。其中，使載體粒子上的復合物游離的方法本身是現(xiàn)有技術中公知的。例如，可舉出將可使形成工序中得到的復合物中的第1抗體和載體粒子的結合解離的物質作為游離劑使用的方法。那樣的游離劑是現(xiàn)有技術中公知的，可根據(jù)第1抗體和載體粒子的結合樣式適宜選擇。例如，復合物中的第1抗體和載體粒子由物理性吸附結合時，作為游離劑，可使用含表面活性劑的溶液使該復合物游離。另外，離子鍵的情況中，可使用含離子的溶液使該復合物游離。第1抗體和載體粒子利用上述的物質A和物質B的親和性結合時，也可通過將可使該物質A和物質B的結合解離的物質作為游離劑使用，使復合物游離。那樣的游離劑也是現(xiàn)有技術中公知的，可根據(jù)物質A和物質B的組合適宜選擇。例如，在半抗原和抗半抗原抗體的結合的情況中，作為游離劑，可使用該半抗原或其衍生物。另外，在生物素(或者脫硫生物素)和親和素(或者鏈霉親和素)的結合的情況中，作為游離劑，可使用生物素。上述的形成工序中得到的復合物經(jīng)第1抗體和第2抗體的結合與載體粒子結合時，作為游離劑，可通過使用第2抗體特異性地識別的抗原，使該復合物游離。使用游離劑使復合物游離時，處理溫度及處理時間不特別限定，但通常是在20～45℃的溫度下靜置3～8分鐘，或者溫和攪拌即可。在轉移工序中，如上述一樣，通過使從載體粒子游離的復合物和與載體粒子不同的固相接觸而結合，將該復合物轉移到該固相。其中，在本說明書中，“與載體粒子不同的固相”是指與自在上述的形成工序中添加時起存在的載體粒子不同的固相(以下也簡稱為“固相”)。即，在此轉移工序中，不旨在使游離的復合物再結合于自在形成工序中添加時起存在的載體粒子。從而，在本發(fā)明的實施方式中，優(yōu)選回收從載體粒子游離的復合物，使與新準備的固相接觸。例如，從載體粒子使復合物游離之后，與上述的回收工序同樣地將該載體粒子固定到容器的壁面或底部。然后，可回收含該復合物的液相，使其與上述的固相接觸。在本發(fā)明的實施方式中，與載體粒子不同的固相只要是可與上述的復合物結合的固相，就不特別限定，可選自在免疫學方法中慣用的公知的固相。作為那樣的固相的材料，例如，可舉出乳膠、橡膠、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚縮水甘油基甲基丙烯酸酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、聚亞乙烯二氟化物(PVDF)、硅酮、瓊脂糖、明膠、紅細胞、硅膠、玻璃、無活性氧化鋁、磁性體等。另外，也可使這些中的1種或2種以上組合。作為固相的形狀，例如，可舉出微滴定板、試管、粒子等，在它們之中，也特別優(yōu)選為粒子。在本發(fā)明的實施方式中，固相和復合物的結合樣式不特別限定，但優(yōu)選為使用介于復合物中的第1抗體和固相之間的物質使兩者結合。作為那樣的物質，可舉出上述的物質A及物質B的組合。例如，可通過將物質A作為“與固相的結合部位”預先與第1抗體結合，使物質B與固相結合，利用物質A和物質B的親和性，使復合物中的第1抗體和固相結合。作為那樣的物質A及物質B的組合，優(yōu)選為生物素(或者脫硫生物素)和親和素(或者鏈霉親和素)。再有，用于第1抗體和固相的結合的物質A及物質B的組合優(yōu)選為與用于該第1抗體和載體粒子的結合的組合不同。例如，可舉出使用使DNP及生物素結合的第1抗體、固定抗DNP抗體的載體粒子、及固定抗生物素抗體的固相。用于將復合物轉移到固相的處理溫度及處理時間不特別限定，但通常是在20～45℃的溫度下靜置1～30分鐘，或者溫和攪拌即可。特別是，固相的形狀是粒子時，靜置1～5分鐘，或者溫和攪拌即可。在本發(fā)明的檢測方法中，進行測定上述的轉移工序中得到的固相上的復合物中含的標記抗體的標記的工序(以下也稱為“測定工序”)。其中，測定標記抗體的標記的方法本身是現(xiàn)有技術中公知的。在本發(fā)明的實施方式中，可選擇根據(jù)上述的標記抗體中使用的標記物質來源的信號的種類的適宜的測定方法。例如，該標記物質是酶時，可通過使用公知的裝置測定通過使針對該酶的底物反應發(fā)生的光、色等的信號來進行。作為那樣的測定裝置，可舉出分光光度計、發(fā)光計等。再有，酶的底物可根據(jù)該酶的種類自公知的底物適宜選擇。例如，作為酶使用堿性磷酸酶時，作為底物，可舉出CDP-Star(注冊商標)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧雜環(huán)丁烷-3,2'-(5'-氯)三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2鈉)、CSPD(注冊商標)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧雜環(huán)丁烷-3,2-(5'-氯)三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2鈉)等的化學發(fā)光底物；p-硝基苯基磷酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、4-硝基藍四唑鎓氯化物(NBT)、碘硝基四唑鎓(INT)等的發(fā)光底物；4-甲基傘形花酰磷酸酯(4MUP)等的熒光基質；5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸2鈉、p-硝基苯基磷等的顯色基質。標記物質是放射性同位素時，可使用閃爍計數(shù)器等的公知的裝置測定作為信號的放射線。另外，標記物質是熒光物質時，可使用熒光酶標儀等的公知的裝置測定作為信號的熒光。在本發(fā)明的檢測方法中，基于上述的測定工序中得到的結果，進行檢測上述的樣品中的HBs抗原的工序(以下也稱為“檢測工序”)。具體而言，在測定工序中，在測定到復合物中的標記抗體來源的標記時，在自受試者得到的樣品中檢測到HBs抗原。相反，測定不到該標記時，在自受試者得到的樣品中檢測不到HBs抗原。在本發(fā)明的實施方式中，作為陰性對照及陽性對照，優(yōu)選各自使用不含HBs抗原的樣品(例如，自健康者得到的活體樣品)、及含HBs抗原的樣品(例如，自B型肝炎患者得到的活體樣品)。在本發(fā)明的實施方式中，也可比較測定工序中得到的測定值和預先設定的閾值，檢測自受試者得到的樣品中的HBs抗原。即，測定值與閾值相同或相比閾值更大時，在自受試者得到的樣品中檢測到HBs抗原。相反，測定值相比閾值更小時，在自受試者得到的樣品中檢測不到HBs抗原。再有，閾值可如下設定。首先，使用不含HBs抗原的樣品及含HBs抗原的樣品，根據(jù)本發(fā)明的檢測方法的至測定工序的順序，取得各自的測定值。再有，各樣品優(yōu)選為有各自多個待測樣品。然后，可將可區(qū)別含HBs抗原的樣品的組和不含HBs抗原的樣品的組的值作為閾值設定。作為那樣的閾值，例如，可舉出可將含HBs抗原的樣品的組和不含HBs抗原的樣品的組二等分的中位值。在本發(fā)明的范圍內，也包括可在本發(fā)明的預處理方法及檢測方法中適宜地使用的預處理用試劑盒。接下來，對于用于檢測本發(fā)明的HBs抗原的預處理用試劑盒(以下也稱為“試劑盒”)進行說明。本發(fā)明的試劑盒含：含有堿性物質的第1試劑，和含有酸性物質的第2試劑。其中，本發(fā)明的試劑盒的第1試劑及第2試劑，各自是與本發(fā)明的預處理方法中使用的“含有堿性物質的預處理液”及“含有酸性物質的試劑”相當?shù)脑噭?。從而，本發(fā)明的試劑盒的第1試劑及第2試劑的組成及使用方法等與對本發(fā)明的預處理方法中使用的預處理液、及含有酸性物質的試劑的說明中所述的同樣。在本發(fā)明的別的實施方式中，可將上述的預處理用試劑盒和在HBs抗原的檢測中使用的試劑等組合而作為HBs抗原檢測用試劑盒。即，本發(fā)明的HBs抗原檢測用試劑盒含：含有堿性物質的第1試劑，含有酸性物質的第2試劑，含有與HBs抗原結合的標記抗體的第3試劑，含有載體粒子的第4試劑，含與HBs抗原及該載體粒子結合的第1抗體的第5試劑，及該與載體粒子不同的固相。上述的第3試劑中含的“與HBs抗原結合的標記抗體”、第4試劑中含的“載體粒子”、第5試劑中含的“與HBs抗原及載體粒子結合的第1抗體”及“與載體粒子不同的固相”各自與本發(fā)明的檢測方法中使用的標記抗體、第1抗體、載體粒子及固相相當。從而，對于本發(fā)明的HBs檢測用試劑盒的標記抗體、第1抗體、載體粒子及固相的種類、結構、使用方法等與對本發(fā)明的檢測方法的說明中所述的同樣。在本發(fā)明的實施方式中，第3試劑、第4試劑及第5試劑也可再含適當?shù)木彌_液。那樣的緩沖液只要是在pH6.5～8有緩沖作用的緩沖液，就不特別限定，例如可舉出磷酸緩沖液(PBS)、咪唑緩沖液、三乙醇胺鹽酸鹽緩沖液(TEA)、Good緩沖液等。作為Good緩沖液，可舉出MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、Bis-Tris-Propane、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、HEPES、HEPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPS等的緩沖液。另外，在本發(fā)明的實施方式中，根據(jù)需要，緩沖液也可含蛋白質穩(wěn)定化劑(BSA等)、防腐劑(疊氮化鈉、苯基甲磺酰氟等)、無機鹽類(氯化鎂、氯化鋅等)等的公知的添加物。接下來，由實施例詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實施例?！緦嵤├俊緦嵤├?：使用血清轉換面板的預處理效果的探討】【1.材料】【(1)樣品】將自HBV陽性患者得到的血清轉換面板(PHM935B：BostonBiomedica，Inc.)作為樣品使用。此血清轉換面板是從1名HBV陽性患者定期采集的血清，各血清中含的HBs抗體的濃度是已知的。在本實施例中，將各樣品由血清編號27～32識別。血清編號30～32的樣品是HBs抗體濃度增加，被認為血清轉化的血清。再有，作為陽性對照使用HISCLHBsAg校準物(HBs抗原濃度0.025IU/mL：Sysmex株式會社)、及作為陰性對照使用健康人血清(國際生物株式會社)?！?2)預處理液(第1試劑)】將以0.3N的濃度含氫氧化鈉(Nacalaitesque株式會社)、以0.4％的濃度含Brij(注冊商標)35(和光純藥工業(yè)株式會社)、及以1.2M的濃度含尿素(岸田化學株式會社)的水溶液作為預處理液使用?！?3)含酸性物質的試劑(第2試劑)】將以0.11M的濃度含檸檬酸(岸田化學株式會社)、以20mM的濃度含NaCl(MANAC株式會社)及巰基乙基胺(Nacalaitesque株式會社)的水溶液作為含酸性物質的試劑使用。【(4)標記抗體試劑(第3試劑)】作為標記抗體，使用2種用堿性磷酸酶(ALP)標記的抗HBs抗體片段(以下，各自稱為“ALP標記HBs85Fab'”及“ALP標記HBs149Fab'”)。其中，ALP標記HBs149Fab'由自以保藏號FERMBP-10583，于2006年3月27日，在獨立行政法人制品評價技術基盤機構專利生物保藏中心(郵政編碼292-0818、日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8120號室)保藏的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體制作。ALP標記HBs85Fab'由自以保藏號NITEBP-1483，于2012年12月13日，在獨立行政法人制品評價技術基盤機構專利微生物保藏中心(郵政編碼292-0818、日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8122號室)保藏的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體制作。具體的標記抗體試劑的制作順序如下。將各單克隆抗體胃蛋白酶消化及還原，得到Fab'片段。另外，將ALP(ORIENTAL酵母株式會社)使用EMCS(N-(6-馬來酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺)(株式會社同仁化學研究所)馬來酰亞胺化。然后，使該片段與馬來酰亞胺化的ALP混合而反應，得到標記抗體。將得到的標記抗體用稀釋液(0.1MMES(pH6.5)、0.15MNaCl、1.0％BSA、0.1％NaN3、10mMMgCl2、1mMZnCl2)稀釋。將各標記抗體的稀釋液以1:1混合，制備標記抗體試劑(ALP濃度0.4U/mL)?！?5)載體粒子試劑(第4試劑)】使作為第2抗體的抗DNP抗體(DNP-1753)固定化到磁性粒子(MicromerM：Micromod公司制)，得到載體粒子。將得到的載體粒子用稀釋液(0.1MMES(pH6.5)、0.15MNaCl、0.25％BSA、0.1％NaN3)稀釋，制備載體粒子試劑(粒子濃度0.5％)(以下也稱為“磁性粒子試劑”)。其中，向磁性粒子的抗體的固定化使用Sulfo-SMCC(Pierce公司)進行。再有，上述的DNP-1753抗體是自以保藏號NITEP-845，于2009年11月25日，在獨立行政法人制品評價技術基盤機構專利微生物保藏中心保藏的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體?！?6)第1抗體試劑(第5試劑)】作為第1抗體，使用2種用生物素及DNP修飾的抗HBs抗體(以下，各自稱為“生物素/DNP標記HBs1053”及“生物素/DNP標記HBs628”)。其中，生物素/DNP標記HBs1053由自以保藏號FERMBP-10582，于2006年3月27日，在獨立行政法人制品評價技術基盤機構專利生物保藏中心保藏的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體制作。生物素/DNP標記HBs628由自以保藏號NITEBP-1484，于2012年12月13日，在獨立行政法人制品評價技術基盤機構專利微生物保藏中心保藏的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體制作。具體的標記抗體試劑的制作順序如下。將生物素化試劑(EZ-Link(注冊商標)Sulfo-NHS-LC-生物素試劑：Pierce公司)添加到BSA(Proliant公司)，接下來，通過添加DNP標記試劑(DNP-XacidSE：ABDBioquest公司)，制備用生物素及DNP修飾的BSA(生物素/DNP標記BSA)。將生物素/DNP標記BSA使用EMCS(同仁化學)馬來酰亞胺化。然后，使上述的各單克隆抗體和馬來酰亞胺化的生物素/DNP標記BSA混合而反應，得到第1抗體。將得到的第1抗體用稀釋液(0.1MMES(pH6.5)、0.15MNaCl、1.0％BSA、0.1％NaN3)稀釋。將各抗體的稀釋液以1:1混合，制備第1抗體試劑(各抗體濃度0.5μg/mL)?！?7)游離劑】作為用于解離與第1抗體結合的DNP和第2抗體的結合的游離劑，使用DNP-Lys溶液。此DNP-Lys溶液是將N-(2,4-二硝基苯基)-L-賴氨酸(東京化成工業(yè)株式會社)用稀釋液(0.1MMES(pH6.5)、0.25％BSA、0.1％NaN3)稀釋至終濃度成5mM而制備?！?8)固相】作為上述的與載體粒子不同的固相，使用鏈霉親和素固定化微平板(Nunc公司)?！?.樣品的預處理】【(1)處理工序】混合樣品(60μL)和預處理液(50μL)，通過以室溫溫育7分鐘，將該樣品在終濃度約0.136N的氫氧化鈉的存在下處理。【(2)中和工序】混合上述的處理工序中得到的樣品和含酸性物質的試劑(50μL)，通過以室溫溫育8分鐘，中和該樣品。再有，將中和后的樣品的pH由pH試驗紙(Whatman公司)進行研究，確認pH是7～7.5。【(3)比較用樣品的制備】為了探討預處理的效果，制備不經(jīng)歷上述的處理工序及中和工序的比較用樣品。即，混合上述的各樣品(60μL)和HISCL待測樣品稀釋液(Sysmex株式會社)(100μL)而得到比較用樣品。【3.HBs抗原的檢測】【(1)形成工序】在反應比色杯(HISCL用反應比色杯：Sysmex株式會社制)內混合中和工序中得到的樣品(160μL)和標記抗體試劑(100μL)，于42℃溫育8分鐘。向此反應比色杯添加第1抗體試劑(100μL)，于42℃溫育8分鐘。再者，向此反應比色杯添加磁性粒子試劑(50μL)，于42℃溫育10分鐘，進行形成工序。另外，對于不進行上述的預處理工序的比較用樣品，也進行同樣的操作?！?2)回收工序】在含形成工序中得到的樣品的反應比色杯中，使用集磁裝置(MINITUBEMAGSEPARATOR：SPHEROTECH公司制)進行磁分離，通過除去該比色杯內的上清，回收載體粒子。向此反應比色杯添加清洗液(350μL)(HISCL清洗液：Sysmex株式會社)，再進行磁分離而清洗載體粒子。將同樣的清洗操作重復2次，回收載體粒子?！?3)轉移工序】向含回收工序中得到的樣品的反應比色杯添加游離劑(40μL)，于42℃溫育5分鐘。接下來，使用上述的集磁裝置進行磁分離，回收上清而移到固相。通過將該固相于室溫溫育20分鐘，實施轉移工序。于是，從固相除去上清，添加HISCL清洗液(300μL)，再通過除去上清進行清洗。將同樣的清洗操作重復5次。【(4)測定工序】向轉移工序中得到的固相添加HISCLR4試劑(17.5μL)和HISCLR5試劑(17.5μL)(Sysmex株式會社)，于42℃溫育5分鐘。于是，使用OPTIMA(BMGLABTECH公司)進行發(fā)光強度(counts)的測定(3secatgain3960)。測定結果示于以下的表1?！颈?】【(5)檢測工序】由對于陽性對照及陰性對照的測定結果知，用本發(fā)明的HBs抗原的檢測方法可檢測樣品中的HBs抗原。對于受試者來源的HBs抗體的濃度低的血清編號27～29的樣品而言，不進行本發(fā)明的預處理方法也可檢測HBs抗原。但是，對于HBs抗體的濃度增加的血清編號27～29的樣品而言，進行本發(fā)明的預處理方法之時的發(fā)光強度成不進行之時的發(fā)光強度的約2倍。從而，由本發(fā)明的預處理方法，排除受試者來源的HBs抗體的影響而檢測HBs抗原變得可能?！緟⒖祭?：HBs抗原的檢測方法的靈敏度的探討】【1.樣品】階段性地稀釋自HBV陽性患者得到的血清(HBV6292-11：ZeptoMetrix公司)而制作血清稀釋液，將這些作為樣品使用。各樣品中含的HBs抗原的濃度是已知的。在本實施例中，將這些由樣品編號7～12識別。再有，作為陽性對照使用HISCLHBsAg校準物(HBs抗原濃度0.025IU/mL：Sysmex株式會社)、及作為陰性對照使用健康人血清(國際生物株式會社)。【2.檢測靈敏度的探討】除了作為樣品使用上述的血清稀釋液以外，與實施例1同樣地進行預處理及檢測的順序，對于該樣品檢測HBs抗原。結果示于下表2。再有，表中的“S/N比”是由以下的式算出的值。(S/N比)＝{(樣品的發(fā)光強度)-(陰性對照的發(fā)光強度)}/(陰性對照的發(fā)光強度)【表2】樣品HBs抗原濃度(IU/mL)發(fā)光強度(計數(shù))S/N比血清編號70.014787045152.3血清編號80.007393555425.9血清編號90.003701831612.8血清編號100.0018597076.3血清編號110.0009256013.2血清編號120.0004637281.8陰性對照01323-陽性對照0.02595864-從表2知，在本發(fā)明的HBs檢測方法中，即使是HBs抗原濃度是0.00046IU/mL的HBs抗原是微量的樣品，也可檢測HBs抗原。其中，在使用以往的HBs抗原檢測用試劑的方法中，HBs抗原濃度0.05IU/mL被設為是最小檢測靈敏度。從而提示，本發(fā)明的HBs抗原的檢測方法是相比使用以往試劑的方法，檢測靈敏度高約100倍的方法?！緟⒖祭?：由預處理液對HBs抗原的影響的探討】【1.材料】【(1)樣品】將HISCLHBsAg校準物(Sysmex株式會社)作為樣品使用。該樣品中含的HBs抗原的濃度是已知的。再有，作為陰性對照使用健康人血清(國際生物株式會社)?！?2)預處理液】為了與實施例1中使用的預處理液比較，制備使各成分的濃度增加的比較用預處理液。即，將以0.5N的濃度含氫氧化鈉(Nacalaitesque株式會社)、以4％的濃度含Brij(注冊商標)35(和光純藥工業(yè)株式會社)、及以6M的濃度含尿素(岸田化學株式會社)的水溶液作為比較用預處理液使用?！?.對HBs抗原的影響的探討】除了作為樣品使用上述的血清，及，作為預處理液使用實施例1的預處理液或上述的比較用預處理液以外，與實施例1同樣地進行預處理及檢測的順序，對于該樣品檢測HBs抗原。即，在樣品的預處理的處理工序中，將樣品在終濃度0.136N或0.227N的氫氧化鈉的存在下處理。結果示于下表3。【表3】從表3知，使用比較用預處理液的檢測方法也可檢測樣品中的HBs抗原，但S/N比與使用實施例1的預處理液的本發(fā)明的檢測方法比，顯著地減少。這提示，由比較用預處理液而HBs抗原變性，其抗原性喪失。對此，在利用本發(fā)明的預處理方法的HBs抗原的檢測方法中，S/N比成為高的值，認為預處理液對HBs抗原的影響小。【實施例2：使用血清轉換面板的預處理效果的探討(2)】【1.材料】【(1)樣品】階段性地稀釋自HBV陽性患者得到的血清(HBV11000-9：ZeptoMetrix公司)而制作血清稀釋液，將這些作為樣品使用。在本實施例中，將這些樣品由樣品編號1～4識別。各樣品中含的HBs抗原的濃度是已知的。再有，將自該HBV陽性患者得到的血清用健康人血清(以約23.4mIU/mL的濃度含有HBs抗體)稀釋。階段性地稀釋自HBV陽性患者得到的血清(HBV11048-6：ZeptoMetrix公司)而制作血清稀釋液，將這些作為樣品使用。在本實施例中，將這些樣品由樣品編號5～8識別。各樣品中含的HBs抗原的濃度是已知的。再有，將自該HBV陽性患者得到的血清用健康人血清(以約23.4mIU/mL的濃度含有HBs抗體)稀釋?！?2)預處理液】將以0.03N的濃度含氫氧化鈉(Nacalaitesque株式會社)、以0.4％的濃度含Brij(注冊商標)35(和光純藥工業(yè)株式會社)、及以1.2M的濃度含尿素(岸田化學株式會社)的水溶液作為預處理液使用?！?.樣品的預處理】【(1)處理工序】混合樣品(120μL)和預處理液(100μL)，通過以室溫溫育7分鐘，將該樣品在終濃度0.014N的氫氧化鈉的存在下處理?！?2)中和工序】混合上述的處理工序中得到的樣品和含與實施例1相同的酸性物質的試劑(80μL)，通過以室溫溫育5分鐘，中和該樣品。【3.HBs抗原的檢測】【(1)形成工序】在反應比色杯(HISCL用反應比色杯：Sysmex株式會社制)內混合中和工序中得到的樣品(300μL)和實施例1和相同的標記抗體試劑(100μL)，于42℃溫育9分鐘。向此反應比色杯添加與實施例1相同的第1抗體試劑(100μL)，于42℃溫育9分鐘。再者，向此反應比色杯添加與實施例1相同的載體粒子試劑(75μL)，于42℃溫育10分鐘而進行形成工序?！?2)回收工序】在含形成工序中得到的樣品的反應比色杯中，使用集磁裝置(MINITUBEMAGSEPARATOR：SPHEROTECH公司制)進行磁分離，通過除去該比色杯內的上清，回收載體粒子。向此反應比色杯添加清洗液，再進行磁分離而清洗載體粒子。其中，進行2次由600μL的清洗液的清洗、進行1次由150μL的清洗液的清洗。再有，通過向HISCL清洗液(Sysmex株式會社)添加NaCl而使NaCl濃度成0.4M而得到此工序中使用的清洗液?！?3)轉移工序】向含回收工序中得到的樣品的反應比色杯添加與實施例1相同的游離劑(33μL)，于38℃溫育5分鐘。接下來，使用上述的集磁裝置進行磁分離，回收上清33μL。此后，測定工序使用HISCL2000i(Sysmex株式會社制)進行。具體而言，在HISCL2000i中進行以下操作。首先，向回收的上清添加與實施例1相同的載體粒子試劑(60μL)，通過于42℃溫育約6分鐘，實施轉移工序。再有，在本實施例中，其中添加的載體粒子試劑中的磁性粒子對應于固相。于是，從固相除去上清，添加上述(2)的回收工序中使用的清洗液(300μL)，再通過除去上清而進行清洗。將同樣的清洗操作重復5次?！?4)測定工序】向轉移工序中得到的固相添加HISCLR4試劑(50μL)和HISCLR5試劑(100μL)(Sysmex株式會社)，于42℃溫育5分鐘。然后，進行發(fā)光強度(counts)的測定。測定結果示于以下的表4及表5?！颈?】【表5】如表4及表5所示，由2SD法知，用本發(fā)明的HBs的檢測方法，在從血清轉換面板制備的含有HBs抗體的樣品中，即使是HBs抗原濃度是0.0002IU/mL的HBs抗原微量，也可檢測HBs抗原?！緦嵤├?：預處理液的堿性物質的濃度的差異對于HBs抗原的靈敏度的影響的探討】【1.材料】【(1)樣品】將自HBV陽性患者得到的3種血清(HBV6290-6、HBV11048-6及HBV6272-6：均獲自ZeptoMetrix公司)作為樣品使用。【(2)預處理液】【(i)預處理液1】將以0.15N的濃度含氫氧化鈉(Nacalaitesque株式會社)、以0.4％的濃度含Brij(注冊商標)35(和光純藥工業(yè)株式會社)、及以1.2M的濃度含尿素(岸田化學株式會社)的水溶液作為預處理液1使用?！?ii)預處理液2】將以0.625N的濃度含氫氧化鈉(Nacalaitesque株式會社)、以0.4％的濃度含Brij(注冊商標)35(和光純藥工業(yè)株式會社)、及以1.2M的濃度含尿素(岸田化學株式會社)的水溶液作為預處理液2使用?！?.樣品的預處理】【(1)處理工序】混合樣品(120μL)和預處理液1(100μL)，通過以室溫溫育7分鐘，將該樣品在終濃度0.06N的氫氧化鈉的存在下處理。另外，對于相同的樣品，代替預處理液1而使用預處理液2進行同樣的操作。即，混合樣品(120μL)和預處理液2(80μL)，通過以室溫溫育7分鐘，將該樣品在終濃度0.25N的氫氧化鈉的存在下處理?！?2)中和工序】混合上述的處理工序中得到的樣品和含與實施例1相同的酸性物質的試劑(80μL)，通過以室溫溫育5分鐘，中和該樣品?！?.HBs抗原的檢測】【(1)形成工序】在反應比色杯(HISCL用反應比色杯：Sysmex株式會社制)內混合中和工序中得到的樣品(300μL)和實施例1和相同的標記抗體試劑(100μL)，于42℃溫育9分鐘。向此反應比色杯添加與實施例1相同的第1抗體試劑(100μL)，于42℃溫育9分鐘。再者，向此反應比色杯添加與實施例1相同的載體粒子試劑(75μL)，于42℃溫育10分鐘，進行形成工序?！?2)回收工序】在含形成工序中得到的樣品的反應比色杯中，使用集磁裝置(MINITUBEMAGSEPARATOR：SPHEROTECH公司制)進行磁分離，通過除去該比色杯內的上清，回收載體粒子。向此反應比色杯添加清洗液，再進行磁分離而清洗載體粒子。其中，將由600μL的清洗液的清洗進行2次、將由150μL的清洗液的清洗進行1次。再有，向HISCL清洗液(Sysmex株式會社)添加NaCl而使NaCl濃度成0.4M而得到此工序中使用的清洗液?！?3)轉移工序】向含回收工序中得到的樣品的反應比色杯添加與實施例1相同的游離劑(33μL)，于38℃溫育5分鐘。接下來，使用上述的集磁裝置進行磁分離，回收上清33μL。此后、測定工序使用HISCL2000i(Sysmex株式會社制)進行。具體而言，在HISCL2000i中進行以下操作。首先，向回收的上清添加與實施例1相同的載體粒子試劑(60μL)，通過于42℃溫育約6分鐘，實施轉移工序。再有，在本實施例中，其中添加的載體粒子試劑中的磁性粒子對應于固相。然后，從固相除去上清，添加上述(2)的回收工序中使用的清洗液(300μL)，再通過除去上清進行清洗。將同樣的清洗操作重復5次?！?4)測定工序】向轉移工序中得到的固相添加HISCLR4試劑(50μL)和HISCLR5試劑(100μL)(Sysmex株式會社)，于42℃溫育5分鐘。然后，進行發(fā)光強度(counts)的測定。另外，對于用上述的預處理液2處理的樣品，也進行與用預處理液1處理的樣品同樣的檢測操作。測定結果示于圖1～圖3。從圖1～圖3，通過使用預處理液1的本發(fā)明的HBs抗原的檢測方法，與使用如預處理液2一樣的堿物質的濃度高的預處理液的HBs抗原的檢測方法比，得到2.5倍以上的發(fā)光強度。從而知，由本發(fā)明的HBs抗原的檢測方法可以更高靈敏度檢測HBs抗原。本申請與2013年1月28日申請的日本國專利申請?zhí)卦?013-013167號相關，這些專利權利要求、說明書、附圖及摘要全部通過引用并入本說明書中。當前第1頁1 2 3