本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速靈敏檢測(cè)重金屬離子Hg²⁺的方法，具體涉及一種汞離子檢測(cè)試紙條及其使用方法。

背景技術(shù)：

汞，是常溫、常壓下唯一以液態(tài)形式存在的金屬，也是一種具有嚴(yán)重生理毒性的重金屬。由于其具有易遷移性、持久性和生物富集性等特點(diǎn)，近年來(lái)成為世界上最引人關(guān)注的環(huán)境污染物之一。世界范圍內(nèi)，亞洲的汞排放量最大，每年約860噸，其次是歐洲和北美洲。汞進(jìn)入環(huán)境后致使土壤肥力下降、資源退化、作物產(chǎn)量以及品質(zhì)都降低，并且其在土壤中不易被淋濾，不能被微生物分解。汞對(duì)人體的危害同樣非常嚴(yán)重，慢性汞中毒臨床表現(xiàn)主要是貧血、神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如頭痛、頭暈、肢體麻木和疼痛、肌肉震顫、運(yùn)動(dòng)失調(diào)等；急性汞中毒其癥狀為肝炎、腎炎、蛋白尿、血尿和尿毒癥以及生殖系統(tǒng)損傷。自然界中的汞主要是以汞離子(Hg²⁺)的形式存在。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署規(guī)定飲用水中汞離子的最大允許量不得超過(guò)10nM。因此，快速靈敏地檢測(cè)環(huán)境中汞離子的含量非常重要。

目前檢測(cè)汞離子的方法主要是光譜法，包括電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、原子吸收法、原子熒光光譜法、紫外—可見(jiàn)分光光度法、電化學(xué)法、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法等。這些方法有的靈敏度較差，有的選擇性差，有的操作繁瑣費(fèi)時(shí)，需要復(fù)雜的前處理，而且需要專門的分析技術(shù)人員以及昂貴的儀器，不利于汞離子現(xiàn)場(chǎng)快速分析檢測(cè)。因此發(fā)展更加便捷、直觀、高效、靈敏的Hg²⁺新型痕量分析檢測(cè)技術(shù)顯得尤為必要。層析快速檢測(cè)試紙條技術(shù)具有簡(jiǎn)便快速，靈敏性高，可定量和半定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。納米科學(xué)技術(shù)被認(rèn)為是21世紀(jì)最重要的科學(xué)技術(shù)之一，其中，納米材料學(xué)是目前納米科學(xué)與納米技術(shù)領(lǐng)域中內(nèi)容最廣泛、研究最活躍的領(lǐng)域。納米顆粒具有獨(dú)特的光學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)、力學(xué)以及化學(xué)方面的性質(zhì)，而且汞離子對(duì)很多熒光納米顆粒都有熒光淬滅效應(yīng)。因此，利用這些納米顆粒的優(yōu)良性能以及試紙條的便捷快速等特點(diǎn)，基于重金屬汞離子對(duì)納米顆粒的熒光淬滅效應(yīng)，構(gòu)建汞離子檢測(cè)的試紙條傳感分析體系，可實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境中痕量汞離子的快速、高效、靈敏地檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決了現(xiàn)有汞離子檢測(cè)技術(shù)中存在的靈敏度較差，選擇性差，操作繁瑣費(fèi)，需要復(fù)雜的前處理等問(wèn)題，提供了一種汞離子檢測(cè)試紙條及其使用方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種汞離子檢測(cè)試紙條，制備步驟如下：

(1)純化納米顆粒，制備納米顆粒分散液；

(2)向步驟(1)制備的納米顆粒分散液中加入0.4-0.8mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液和0.6-0.8mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺溶液，將該溶液使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)混合器室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)5-40min后，加入0.01-0.04mol/L巰基乙醇溶液，繼續(xù)反應(yīng)1-30min，然后加入1-10mg/mL蛋白質(zhì)小分子溶液，繼續(xù)反應(yīng)0.5-4h，然后加入0.2-0.7mg/mL甘氨酸溶液，10-80min后停止反應(yīng)，制得混合溶液；

(3)將步驟(2)所得的混合溶液加入超濾管，于2-8℃下，4000-10000r/min離心5-15min，然后用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％-0.3％吐溫-20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液復(fù)溶至原體積，以此方法再離心兩次，最終定容至原體積的一半，得到納米顆粒-蛋白質(zhì)復(fù)合物；

(4)將步驟(3)所得的納米顆粒-蛋白質(zhì)復(fù)合物劃在硝酸纖維素膜上，制備特定包被的硝酸纖維素膜，干燥后組裝到試紙條上。

所述步驟(1)具體步驟為：將納米顆粒與異丙醇混合均勻，4000-8000r/min離心5-10min后用超純水復(fù)溶至原體積復(fù)溶得復(fù)溶液，然后將復(fù)溶液加入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液中，制得納米顆粒分散液；所述納米顆粒：異丙醇：磷酸鹽緩沖液的體積比為1:3-7:3。

所述步驟(1)中納米顆粒為量子點(diǎn)及其它能被汞離子淬滅的熒光納米顆粒，如傳統(tǒng)的Ⅱ-Ⅵ族元素構(gòu)成的量子點(diǎn)、Ⅲ-Ⅴ族元素構(gòu)成的量子點(diǎn)、Ⅳ-Ⅵ族元素構(gòu)成的量子點(diǎn)、Zn-Cu-In-S/ZnS量子點(diǎn)、Cu:Zn-In-S/ZnS量子點(diǎn)、Cu-Mn:Zn-In-S量子點(diǎn)或熒光碳納米顆粒。

所述步驟(2)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液：N-羥基琥珀酰亞胺溶液：巰基乙醇溶液：蛋白質(zhì)小分子溶液：甘氨酸溶液的添加體積比為：7:5-6:2-3:4:9。

所述蛋白質(zhì)小分子為鏈酶親和素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、單克隆抗體或多克隆抗體。

所述步驟(4)中組裝到試紙條的操作為：樣品墊、特定包被的硝酸纖維素膜和吸水墊依次連接，粘貼于底板上面，彼此之間重疊2-3mm，其中硝酸纖維素膜處于最下層。

一種汞離子檢測(cè)試紙條的使用方法，步驟如下：

(1)將一定濃度梯度的汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，滴在汞離子檢測(cè)試紙條的樣品墊上，25min后測(cè)定汞離子濃度為0nM時(shí)，汞離子檢測(cè)試紙條的熒光信號(hào)峰面積F₀，及不同汞離子濃度下汞離子檢測(cè)試紙條的熒光信號(hào)峰面積F，計(jì)算出相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀，然后以汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)、相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀為縱坐標(biāo)，確定標(biāo)準(zhǔn)液中汞離子濃度和相對(duì)熒光淬滅強(qiáng)度的關(guān)系；

(2)將未知濃度的汞離子待測(cè)樣品滴在試紙條的樣品墊上，跑樣10-40min后記錄熒光淬滅值；

(3)根據(jù)熒光淬滅值計(jì)算待測(cè)樣品中汞離子的含量。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明方法克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足，應(yīng)用范圍廣泛，只要可以與汞離子發(fā)生熒光淬滅效應(yīng)的納米顆粒都可以用于該方法；

2、成本大大降低，不需要實(shí)驗(yàn)人員具有較高的操作水平及復(fù)雜昂貴的儀器，且靈敏度高、選擇性好；

3、本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單快速，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，適應(yīng)性較強(qiáng)；

為考察本發(fā)明方法對(duì)汞離子的選擇性，設(shè)計(jì)了一系列干擾性實(shí)驗(yàn)，如圖4所示，結(jié)果表明該檢測(cè)方法除了銅離子的干擾較大外，其他離子的干擾都比較小，為了排除銅離子的干擾，我們加入銅試劑對(duì)其進(jìn)行掩蔽，得到了較好的效果(如圖5所示)；

另外，為了驗(yàn)證本發(fā)明方法的適應(yīng)性和可靠性，設(shè)計(jì)并進(jìn)行了實(shí)際樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)是指在待測(cè)的樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，然后用本檢測(cè)方法檢測(cè)樣品的含量，達(dá)到對(duì)本實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證，是對(duì)本方法的適應(yīng)性和可靠性的評(píng)價(jià)，具體實(shí)施如下：

將自來(lái)水、眉湖水、西流湖水分別加入銅試劑進(jìn)行掩蔽，反應(yīng)20min后離心，取上清液分別加入終濃度1×10^-8M和5×10^-8M的汞離子，進(jìn)行試紙條檢測(cè)；同等濃度的檢測(cè)液均分為三份，按本發(fā)明提供的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示；

表1不同樣本的檢測(cè)結(jié)果

由檢測(cè)結(jié)果可知，本發(fā)明提供的方法具有較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，對(duì)實(shí)際樣品中的汞離子有很好的響應(yīng)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明檢測(cè)汞離子的原理示意圖。

圖2為實(shí)施例1中標(biāo)準(zhǔn)溶液中不同濃度汞離子檢測(cè)的熒光圖片。

圖3為實(shí)施例1中標(biāo)準(zhǔn)溶液中不同濃度汞離子檢測(cè)的線性關(guān)系圖。

圖4為實(shí)施例6中基于試紙條檢測(cè)汞離子干擾實(shí)驗(yàn)的柱形圖。

圖5為實(shí)施例7中銅試劑對(duì)量子點(diǎn)熒光影響的柱形圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

步驟一、取100μLCu:Zn-In-S/ZnS量子點(diǎn)與700μL異丙醇混合均勻，8000r/min離心10min，用超純水復(fù)溶至原體積，然后加入300μL磷酸鹽緩沖液，制得Cu:Zn-In-S/ZnS量子點(diǎn)分散液。

步驟二、向上述量子點(diǎn)溶液中加入17.5μL濃度為0.80mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液和12.5μL濃度為0.80mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫反應(yīng)40min。然后向混合液中加入5μL濃度為0.040mol/L的巰基乙醇溶液，繼續(xù)反應(yīng)30min，再加入10μL濃度為10mg/mL的鏈酶親和素溶液，繼續(xù)反應(yīng)4h，最后加入22.5μL濃度為0.70mg/mL的甘氨酸溶液，繼續(xù)反應(yīng)80min后停止反應(yīng)。

步驟三、將上述反應(yīng)制備的混合液用Millipore超濾管在4℃下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，然后用含有0.3％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶至原體積，以此方法再離心兩次，最終定容至原體積的一半，得到納米顆粒-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

步驟四、將通過(guò)上述步驟制備得到的量子點(diǎn)-鏈酶親和素復(fù)合物溶液劃在硝酸纖維素膜上，得到特定包被的硝酸纖維素膜，37℃恒溫干燥之后將條形板、樣品墊、特定包被的硝酸纖維素膜以及吸水墊組裝成試紙條，并將一定濃度梯度的汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(0mol/L、1×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L、5×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-6mol/L、1×10^-5mol/L、1×10^-4mol/L、1×10^-3mol/L)滴在試紙條的樣品墊上，25min后測(cè)定試紙條的熒光信號(hào)峰面積F，計(jì)算出相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀，然后以汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)、相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀為縱坐標(biāo)確定標(biāo)準(zhǔn)液中汞離子濃度和相對(duì)熒光淬滅強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)圖2和圖3，從圖3可以看出相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀與汞離子濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

實(shí)施例2

步驟一、取100μL CdSe量子點(diǎn)與300μL異丙醇混合均勻，4000r/min離心5min，用超純水復(fù)溶至原體積，然后加入300μL磷酸鹽緩沖液，制得CdSe量子點(diǎn)分散液。

步驟二、向上述量子點(diǎn)溶液中加入17.5μL濃度為0.40mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液和15μL濃度為0.60mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫反應(yīng)30min。然后向混合液中加入7.5μL濃度為0.010mol/L的巰基乙醇溶液，繼續(xù)反應(yīng)1min，再加入10μL濃度為1mg/mL的牛血清白蛋白溶液，繼續(xù)反應(yīng)0.5h，加入22.5μL濃度為0.20mg/mL的甘氨酸溶液，繼續(xù)反應(yīng)10min后停止反應(yīng)。

步驟三、將上述最后反應(yīng)結(jié)束的混合液用Millipore超濾管在4℃下以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，然后用含有0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶至原體積，以此方法再離心兩次，最終定容至原體積的一半，得到納米顆粒-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

步驟四、將通過(guò)上述步驟制備得到的量子點(diǎn)-牛血清白蛋白復(fù)合物溶液劃在硝酸纖維素膜上得到特定包被的硝酸纖維素膜，37℃恒溫干燥之后將條形板、樣品墊、特定包被的硝酸纖維素膜以及吸水墊組裝成試紙條，并將一定濃度梯度的汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(0mol/L、1×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L、5×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-6mol/L、1×10^-5mol/L、1×10^-4mol/L、1×10^-3mol/L)滴在試紙條的樣品墊上，25min后測(cè)定試紙條的熒光信號(hào)峰面積F，計(jì)算出相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀，然后以汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)、相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀為縱坐標(biāo)確定標(biāo)準(zhǔn)液中汞離子濃度和相對(duì)熒光淬滅強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

實(shí)施例3

步驟一、取100μL熒光碳納米顆粒與500μL異丙醇混合均勻，6000r/min離心7.5min，用超純水復(fù)溶至原體積，然后加入300μL磷酸鹽緩沖液，制得熒光碳納米顆粒分散液。

步驟二、向上述量子點(diǎn)溶液中加入17.5μL濃度為0.60mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液和13.8μL濃度為0.70mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫反應(yīng)23min。然后向混合液中加入6.3μL濃度為0.025mol/L的巰基乙醇溶液，繼續(xù)反應(yīng)15min，再加入10μL濃度為5mg/mL的卵清蛋白溶液，繼續(xù)反應(yīng)2.5h，加入22.5μL濃度為0.45mg/mL的甘氨酸溶液，繼續(xù)反應(yīng)45min后停止反應(yīng)。

步驟三、將上述最后反應(yīng)結(jié)束的混合液用Millipore超濾管在4℃下以7000r/min的轉(zhuǎn)速離心150min，然后用含有0.18％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶至原體積，以此方法再離心兩次，最終定容至原體積的一半，得到納米顆粒-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

步驟四、將通過(guò)上述步驟制備得到的熒光碳納米顆粒-卵清蛋白復(fù)合物溶液劃在硝酸纖維素膜上得到特定包被的硝酸纖維素膜，37℃恒溫干燥之后將條形板、樣品墊、特定包被的硝酸纖維素膜以及吸水墊組裝成試紙條，并將一定濃度梯度的汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(0mol/L、1×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L、5×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-6mol/L、1×10^-5mol/L、1×10^-4mol/L、1×10^-3mol/L)滴在試紙條的樣品墊上，25min后測(cè)定試紙條的熒光信號(hào)峰面積F，計(jì)算出相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀，然后以汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)、相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀為縱坐標(biāo)確定標(biāo)準(zhǔn)液中汞離子濃度和相對(duì)熒光淬滅強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

實(shí)施例4

步驟一、取100μL CdTe量子點(diǎn)與400μL異丙醇混合均勻，5000r/min離心6min，用超純水復(fù)溶至原體積，然后加入300μL磷酸鹽緩沖液，制得CdTe量子點(diǎn)分散液。

步驟二、向上述量子點(diǎn)溶液中加入17.5μL濃度為0.50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液和12.5μL濃度為0.65mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫反應(yīng)14min。然后向混合液中加入7.5μL濃度為0.017mol/L的巰基乙醇溶液，繼續(xù)反應(yīng)8min，再加入10μL濃度為3mg/mL的人IgG溶液，繼續(xù)反應(yīng)1.5h，加入22.5μL濃度為0.32mg/mL的甘氨酸溶液，繼續(xù)反應(yīng)28min后停止反應(yīng)。

步驟三、將上述最后反應(yīng)結(jié)束的混合液用Millipore超濾管在4℃下以5500r/min的轉(zhuǎn)速離心7.5min，然后用含有0.11％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶至原體積，以此方法再離心兩次，最終定容至原體積的一半，得到納米顆粒-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

步驟四、將通過(guò)上述步驟制備得到的熒光碳納米顆粒-卵清蛋白復(fù)合物溶液劃在硝酸纖維素膜上得到特定包被的硝酸纖維素膜，37℃恒溫干燥之后將條形板、樣品墊、特定包被的硝酸纖維素膜以及吸水墊組裝成試紙條，并將一定濃度梯度的汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(0mol/L、1×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L、5×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-6mol/L、1×10^-5mol/L、1×10^-4mol/L、1×10^-3mol/L)滴在試紙條的樣品墊上，25min后測(cè)定試紙條的熒光信號(hào)峰面積F，計(jì)算出相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀，然后以汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)、相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀為縱坐標(biāo)確定標(biāo)準(zhǔn)液中汞離子濃度和相對(duì)熒光淬滅強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

實(shí)施例5

步驟一、取100μL Zn-Cu-In-S/ZnS量子點(diǎn)與600μL異丙醇混合均勻，8500r/min離心13min，用超純水復(fù)溶至原體積，然后加入300μL磷酸鹽緩沖液，制得Zn-Cu-In-S/ZnS量子點(diǎn)分散液。

步驟二、向上述量子點(diǎn)溶液中加入17.5μL濃度為0.70mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液和15μL濃度為0.75mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫反應(yīng)32min。然后向混合液中加入5μL濃度為0.033mol/L的巰基乙醇溶液，繼續(xù)反應(yīng)23min，再加入10μL濃度為7.5mg/mL的羊抗人IgG(Fc)溶液，繼續(xù)反應(yīng)3.2h，加入22.5μL濃度為0.58mg/mL的甘氨酸溶液，繼續(xù)反應(yīng)62min后停止反應(yīng)。

步驟三、將上述最后反應(yīng)結(jié)束的混合液用Millipore超濾管在4℃下以8500r/min的轉(zhuǎn)速離心13min，然后用含有0.24％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶至原體積，以此方法再離心兩次，最終定容至原體積的一半，得到納米顆粒-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

步驟四、將通過(guò)上述步驟制備得到的量子點(diǎn)-羊抗人IgG(Fc)復(fù)合物溶液劃在硝酸纖維素膜上得到特定包被的硝酸纖維素膜，37℃恒溫干燥之后將條形板、樣品墊、特定包被的硝酸纖維素膜以及吸水墊組裝成試紙條，并將一定濃度梯度的汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(0mol/L、1×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L、5×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-6mol/L、1×10^-5mol/L、1×10^-4mol/L、1×10^-3mol/L)滴在試紙條的樣品墊上，25min后測(cè)定試紙條的熒光信號(hào)峰面積F，計(jì)算出相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀，然后以汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)、相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀為縱坐標(biāo)確定標(biāo)準(zhǔn)液中汞離子濃度和相對(duì)熒光淬滅強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

實(shí)施例6

步驟一、取100μL Cu:Zn-In-S/ZnS量子點(diǎn)與600μL異丙醇混合均勻，6000r/min離心7min，用超純水復(fù)溶至原體積，然后加入300μL磷酸鹽緩沖液，制備一定濃度的Cu:Zn-In-S/ZnS量子點(diǎn)溶液。

步驟二、向上述量子點(diǎn)溶液中加入17.5μL濃度為0.58mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液和13.5μL濃度為0.78mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫反應(yīng)20min?；旌弦褐屑尤?.9μL濃度為0.025mol/L的巰基乙醇溶液，繼續(xù)反應(yīng)5min，再加入10μL濃度為5mg/mL的鏈酶親和素溶液，繼續(xù)反應(yīng)2h，加入22.5μL濃度為0.45mg/mL的甘氨酸溶液，繼續(xù)反應(yīng)2h后停止反應(yīng)。

步驟三、將上述最后反應(yīng)結(jié)束的混合液用Millipore超濾管在4℃下以6000r/min的轉(zhuǎn)速離心8min，然后用含有0.1％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，離心三次得到納米顆粒-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

步驟四、將通過(guò)上述步驟制備得到的量子點(diǎn)-鏈酶親和素復(fù)合物溶液劃在硝酸纖維素膜上得到特定包被的硝酸纖維素膜，37℃恒溫干燥之后將條形板、樣品墊、特定包被的硝酸纖維素膜以及吸水墊組裝成試紙條，將濃度為1×10^-5mol/L的Hg²⁺、1×10^-5mol/L的Cu²⁺、1×10^-4mol/L的Na⁺、1×10^-4mol/L的Mg²⁺、1×10^-4mol/L的Mn²⁺、1×10^-4mol/L的Al³⁺、1×10^-4mol/L的Fe³⁺、1×10^-4mol/L的Zn²⁺、1×10^-4mol/L的Ca²⁺、1×10^-4mol/L的K⁺離子溶液，滴在試紙條的樣品墊上，跑樣25min后，用便攜式檢測(cè)器讀取熒光信號(hào)F，計(jì)算出相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F0如圖4所示，結(jié)果表明該檢測(cè)方法除了銅離子的干擾較大外，其他離子的干擾都比較小。

實(shí)施例7

步驟一、取100μL Cu:Zn-In-S/ZnS量子點(diǎn)與600μL異丙醇混合均勻，6000r/min離心7min，用超純水復(fù)溶至原體積，然后加入300μL磷酸鹽緩沖液，制備一定濃度的量子點(diǎn)溶液。

步驟二、向上述量子點(diǎn)溶液中加入17.5μL濃度為0.58mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液和14μL濃度為0.78mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)20min?；旌弦褐屑尤?μL濃度為0.025mol/L的巰基乙醇溶液，繼續(xù)反應(yīng)5min，再加入10μL濃度為5mg/mL的鏈酶親和素溶液，繼續(xù)反應(yīng)2h，加入22.5μL濃度為0.45mg/mL的甘氨酸溶液，繼續(xù)反應(yīng)2h后停止反應(yīng)。

步驟三、將上述最后反應(yīng)結(jié)束的混合液用Millipore超濾管在4℃下以6000r/min的轉(zhuǎn)速離心8min，然后用含有0.1％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，離心三次得到納米顆粒-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

步驟四、由于Cu²⁺對(duì)本實(shí)驗(yàn)干擾很大，設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)來(lái)消除Cu²⁺干擾。取5個(gè)離心管分別加入a：量子點(diǎn)-鏈酶親和素復(fù)合物溶液和Hg²⁺(1×10^-5mol/L)混合溶液；b：量子點(diǎn)-鏈酶親和素復(fù)合物溶液和Cu²⁺(1×10^-5mol/L)混合溶液；c：量子點(diǎn)-鏈酶親和素復(fù)合物溶液、Cu²⁺(1×10^-5mol/L)和銅試劑(1×10^-4mol/L)混合溶液；d：量子點(diǎn)-鏈酶親和素復(fù)合物溶液、Hg²⁺(1×10^-5mol/L)和Cu²⁺(1×10^-5mol/L)混合溶液；e：量子點(diǎn)-鏈酶親和素復(fù)合物溶液、Hg²⁺(1×10^-5mol/L)、Cu²⁺(1×10^-5mol/L)和銅試劑(1×10^-4mol/L)混合溶液，使用熒光光譜儀分別測(cè)出各個(gè)樣品的熒光信號(hào)值F，以量子點(diǎn)-鏈酶親和素復(fù)合物溶液為空白F₀。分別計(jì)算出相對(duì)熒光淬滅值F₀-F/F₀如圖5所示，說(shuō)明銅試劑可以很好的掩蔽樣品中的Cu²⁺,從而可以消除Cu²⁺對(duì)本實(shí)驗(yàn)的干擾。

步驟五、將通過(guò)上述步驟制備得到的量子點(diǎn)-鏈酶親和素復(fù)合物溶液劃在硝酸纖維素膜上得到特定包被的硝酸纖維素膜，37℃恒溫干燥之后將條形板、樣品墊、特定包被的硝酸纖維素膜以及吸水墊組裝成試紙條。取0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液80μL和20μL 1％吐溫20，混合均勻。取100μL混合液滴在試紙條的樣品墊上，跑樣25min后讀取熒光信號(hào)F₀；將自來(lái)水、眉湖水、西流湖水用1×10^-4mol/L的銅試劑掩蔽Cu²⁺的干擾。反應(yīng)20min后離心取上清液，配成0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液。取0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液75μL和20μL 1％吐溫-20，分別加入1×10^-6mol/L和5×10^-6mol/L的汞離子10μL混合均勻。同等濃度的檢測(cè)液均分為三份，進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示；由檢測(cè)結(jié)果可知，本發(fā)明提供的方法具有較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，對(duì)實(shí)際樣品中的汞離子有很好的響應(yīng)。