一種dna-蛋白質(zhì)綴合物及其在檢測(cè)汞離子濃度中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及檢測(cè)分析領(lǐng)域，具體設(shè)及一種DNA-蛋白質(zhì)綴合物及其在檢測(cè)隸離子 濃度中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，利用功能核酸作為新型生物識(shí)別元件的傳感分析方法發(fā)展迅速，備受科 研團(tuán)隊(duì)與企業(yè)研發(fā)部口的關(guān)注。功能核酸是具有親和識(shí)別、催化等特定功能的核酸片段，包 括核酸適配體、DNA酶W及能通過(guò)堿基錯(cuò)配等作用形成特定結(jié)構(gòu)的核酸片段。
[0003] 利用堿基錯(cuò)配作用對(duì)環(huán)境中污染物進(jìn)行檢測(cè)是功能核酸的一類典型作用。堿基錯(cuò) 配是指在特定條件下，兩個(gè)非互補(bǔ)的堿基錯(cuò)配形成堿基對(duì)，如"C-Ag-C"等。2004年，日本 東京都立大學(xué)的化0和Togashi課題組首次報(bào)道了"道了T-Hg-T"堿基錯(cuò)配作用，并將其應(yīng) 用于水體中隸離子的選擇性檢測(cè)中：該課題組將一段富含T堿基的寡聚核巧酸兩端分別修 飾巧光基團(tuán)與澤滅基團(tuán)，基于隸離子被堿基錯(cuò)配識(shí)別后產(chǎn)生的DNA構(gòu)象變化實(shí)現(xiàn)巧光信號(hào) 的增強(qiáng)或減弱，從而建立起隸離子濃度與巧光信號(hào)的定量關(guān)系。運(yùn)一設(shè)計(jì)材料簡(jiǎn)單，檢測(cè)方 便，屬于均相"turn-off"的檢測(cè)模式一一即在隸離子存在的條件下，DNA鏈段通過(guò)堿基錯(cuò) 配作用形成彎折的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在空間上使巧光基團(tuán)和澤滅基團(tuán)接近，體系巧光值亦由于二 者之間的FRET作用而降低。運(yùn)種祀標(biāo)物愈多、信號(hào)愈低的"turn-off"模式通常易受樣品 基質(zhì)中干擾物的影響，有可能產(chǎn)生虛假信號(hào)，不利于實(shí)際未知水樣的檢測(cè)。之后美國(guó)伊利諾 伊大學(xué)厄己納-香橫分校的LuYi課題組通過(guò)引入互補(bǔ)鏈，將此方法優(yōu)化為"turn-on"模 式，但上述報(bào)道均屬于均相反應(yīng)體系。均相反應(yīng)體系雖然簡(jiǎn)便快捷，但試劑消耗量大、難W 重復(fù)利用，W至單次檢測(cè)成本高。相對(duì)而言，固相傳感借助于一個(gè)固定的傳感界面，可對(duì)界 面進(jìn)行再生重復(fù)使用，是實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)的前提，具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明充分利用DNA鏈與其互補(bǔ)核酸鏈之間的FRET作用W及 "DNA-蛋白質(zhì)"綴合物與倏逝波傳感忍片上固定的蛋白質(zhì)配基之間的親和反應(yīng)，獲得了一種 能夠有效檢測(cè)隸離子濃度的方法。 陽(yáng)0化]因此，本發(fā)明一方面提供了一種DNA-蛋白質(zhì)綴合物，其中DNA鏈修飾W巧光標(biāo)記 基團(tuán)，其互補(bǔ)核酸鏈修飾W巧光澤滅基團(tuán)，并且DNA鏈富含T堿基，綴合物中蛋白質(zhì)部分與 倏逝波傳感忍片上固定的蛋白質(zhì)配基發(fā)生親和反應(yīng)。
[0006] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA鏈包含序列1所示的核巧酸序列，其互補(bǔ)核酸鏈 包含序列2所示的核巧酸序列，巧光標(biāo)記基團(tuán)為切5. 5,巧光澤滅基團(tuán)為B冊(cè)-3,蛋白質(zhì)部分 為鏈霉親和素。
[0007] 在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA鏈的核巧酸序列如序列1所示，其互補(bǔ)核 酸鏈的核巧酸序列如序列2所示。
[0008] 本發(fā)明另一方面提供了一種檢測(cè)隸離子濃度的方法，包括制備脫硫生物素修飾光 纖、合成DM-蛋白質(zhì)綴合物W及檢測(cè)隸離子濃度的步驟。
[0009] 其中制備脫硫生物素修飾光纖包括光纖預(yù)處理、制備APTS-光纖、制備氨基光纖、 制備脫硫生物素溶液W及制備脫硫生物素-光纖的步驟。
[0010] 合成DNA-蛋白質(zhì)綴合物包括制備活化的琉基DNA、制備活化的鏈霉親和素蛋白、 制備DNA-鏈霉親和素蛋白綴合物濃縮液W及制備DNA-鏈霉親和素蛋白綴合物儲(chǔ)備液的步 驟。
[0011] 檢測(cè)隸離子濃度包括配制隸離子儲(chǔ)備液W及檢測(cè)隸離子濃度的步驟。
[0012] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備脫硫生物素修飾光纖的具體步驟為： 陽(yáng)01引 1、光纖預(yù)處理：將光纖置于濃H2SO4與H202體積比為3:1的混合溶液中，120°C加 熱1小時(shí)，充分洗涂光纖后，室溫下吹干，70°C真空干燥過(guò)夜。
[0014] 2、制備APTS-光纖：用無(wú)水甲苯配制體積比為2%的（3-氨基丙基）Ξ乙氧基娃 燒（APT巧溶液，將步驟1經(jīng)預(yù)處理的光纖放入其中，反應(yīng)1小時(shí)，用甲苯反復(fù)沖洗，氮?dú)獯?干后，200°C烘烤1小時(shí)。
[0015] 3、制備氨基光纖：自然降溫后，用2. 5%的戊二醒的乙醇溶液浸沒(méi)光纖，室溫下反 應(yīng)1小時(shí)，用乙醇反復(fù)沖洗，加入乙醇配制的10%的乙二胺，室溫反應(yīng)1. 5小時(shí)，用乙醇配制 的Img/mL的NaBH4溶液還原未反應(yīng)的醒基15分鐘。
[0016] 4、制備脫硫生物素溶液：分別稱取25毫克脫硫生物素、50毫克EDC和50毫克 N服，置于離屯、管中，加入1毫升DMF，室溫下反應(yīng)3小時(shí)后，加入200微升抑值為8. 7的1M NaHC03-Na2C03 緩沖液。
[0017] 5、制備脫硫生物素修飾光纖：將步驟3制備的氨基光纖放入步驟4制備的脫硫生 物素溶液中室溫反應(yīng)12小時(shí)，反復(fù)洗涂光纖，氮?dú)獯蹈桑?°C保存?zhèn)溆谩?br>[0018] 在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，在向儀器內(nèi)安裝光纖，準(zhǔn)備首次使用脫硫生 物素修飾光纖前，用含Img/mlBSA的PBS緩沖液封閉處理1小時(shí)。
[0019] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，合成DNA-蛋白質(zhì)綴合物的步驟為：
[0020] 1、制備活化的琉基DNA:在10微升ImMSH-DNA-切5. 5溶液中加入5微升抑值 為5. 5的1M憐酸鋼緩沖液和1微升50mMTCEP溶液，混合液避光室溫反應(yīng)1小時(shí)，用 Amicon-lOK加入200微升抑值為7. 2的憐酸緩沖液，12000巧m離屯、10分鐘，重復(fù)10次， 得到活化的琉基DNA。
[0021] 2、制備活化的鏈霉親和素蛋白：在150微升20mg/mL的鏈霉親和素溶液中加入 0. 5mgSulfo-SMCC，縱滿震蕩5分鐘，室溫反應(yīng)1小時(shí)，用Amicon-50k離屯、除去未溶解的 Sulfo-SMCC，每次加入200微升抑值為7. 2的憐酸緩沖液，于1200化pm離屯、10分鐘，重復(fù) 10次，得到活化的鏈霉親和素蛋白。
[0022] 3、制備DNA-鏈霉親和素蛋白綴合物濃縮液：混合步驟1制備的活化的琉基DNA和 步驟2制備的活化的鏈霉親和素蛋白，避光室溫放置48小時(shí)，用Amicon-50k過(guò)濾，每次加 入200微升抑值為7. 2的憐酸緩沖液，于1200化pm離屯、10分鐘，重復(fù)10次，得到純化的 DNA-鏈霉親和素蛋白綴合物濃縮液。
[0023] 4、制備DNA-鏈霉親和素蛋白綴合物儲(chǔ)備液：20倍稀釋步驟3制備的DNA-鏈霉親 和素蛋白綴合物濃縮液，避光4°C保存待用。
[0024] 在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，抑值為7. 2的憐酸緩沖液含有0. 1M的憐酸 鋼和0. 15M的氯化鋼。
[0025] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測(cè)隸離子濃度的步驟為： 陽(yáng)026] 1、配置隸離子儲(chǔ)備液：分別配置濃度為0. 01μg/mL、0. 1μg/mL、lμg/mL和 10μg/mL的隸離子濃度梯度儲(chǔ)備液。
[0027] 2、隸離子濃度的檢測(cè)：W抑值為7. 5的M(PS緩沖液（lOmMMOPS, 0. 5MNaN03,） 為反應(yīng)液，向450微升反應(yīng)液中加入2微升DM-鏈霉親和素蛋白綴合物儲(chǔ)備液W及不同濃 度的隸離子梯度儲(chǔ)備液，室溫下反應(yīng)1小時(shí)，將反應(yīng)后的液體通入倏逝波光纖傳感平臺(tái)，用 MCPS緩沖液沖洗光纖直至基線平穩(wěn)，通入與隸離子反應(yīng)后的液體，開(kāi)啟蠕動(dòng)累，進(jìn)樣15秒， 停止蠕動(dòng)累，使待測(cè)液反應(yīng)90秒后，開(kāi)啟蠕動(dòng)累，通入洗脫液，通入MCPS緩沖液，至基線平 穩(wěn)，停止采樣，保存數(shù)據(jù)。
[0028] 本發(fā)明再一方面提供了本發(fā)明所述的DNA-蛋白質(zhì)綴合物在檢測(cè)隸離子濃度中的 應(yīng)用。
[0029]與現(xiàn)有檢測(cè)隸離子濃度的方法相比，本發(fā)明的方法具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便和快速的優(yōu)點(diǎn)， 具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為本發(fā)明基于FRET作用的"DNA-蛋白質(zhì)"綴合物對(duì)隸離子識(shí)別示意圖。
[0031] 圖2為本發(fā)明光纖表面修飾脫硫生物素的示意圖。
[0032] 圖3為本發(fā)明在倏逝場(chǎng)內(nèi)檢測(cè)綴合物巧光強(qiáng)度的示意圖。
[003引圖4為本發(fā)明DNA-鏈霉親和素-巧光標(biāo)記物綴合體合成方法示意圖。
[0034] 圖5為本發(fā)明對(duì)隸離子的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0035] 圖6為本發(fā)明對(duì)隸離子的檢測(cè)選擇性柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，旨在用于說(shuō)明本發(fā)明而非限定本 發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對(duì)本發(fā) 明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，運(yùn)些改進(jìn)和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0037] 本發(fā)明所使用的縮寫的含義列于下表中。
[0038]
[0039] 實(shí)施例1脫硫生物素修飾光纖的制備
[0040] 1、光纖預(yù)處理
[0041] 將光纖放入裝有pir址a溶液（濃H2S〇4:H2〇2(v/v) = 3:1)的比色管中，于120°C 加熱1小時(shí)，加熱后，用超純水充分洗涂光纖10次W上，并在室溫下用氮?dú)獯蹈晒饫w，放于 70°C真空干燥箱中過(guò)夜。
[0042] 2、APTS-光纖的制備
[0043] 次日用無(wú)水甲苯配制2% (體積比）的（3-氨基丙基）Ξ乙氧基硅烷（APT巧溶 液，并將潔凈的光纖放入該溶液中反應(yīng)一小時(shí)；之后用甲苯?jīng)_洗5次，并用氮?dú)獯蹈晒饫w， 放于200°C烘烤1小時(shí)。
[0044] 3、氨基-光纖的制備
[0045]自然降溫后，用2. 5%的戊二醒的乙醇溶液浸沒(méi)光纖，于室溫反應(yīng)1小時(shí)，并