一種便于蛋白質(zhì)譜高效分析表達(dá)量差異蛋白的蛋白提取和電泳方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種便于蛋白質(zhì)譜高效分析表達(dá)量差異蛋白的蛋白提取和電泳方法，屬于蛋白質(zhì)譜工程領(lǐng)域。本發(fā)明發(fā)明能高效的提取黑曲霉的蛋白并充分分離各個蛋白質(zhì)點。其中，以如下配方的低溫破壁液對黑曲霉進(jìn)行破碎提取蛋白：無水乙醇20g，三氯乙酸5g，醋酸5g，十六烷基吡啶0.02g，十二烷基硫酸鈉0.03g，蒸餾水定容至1L，該破壁液能增加蛋白的提取率。本發(fā)明的電泳方法為三向電泳，通過三向電泳更有利于黑曲霉的蛋白提取和區(qū)分蛋白表達(dá)的差異。
【專利說明】一種便于蛋白質(zhì)譜高效分析表達(dá)量差異蛋白的蛋白提取和 電泳方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)譜工程領(lǐng)域，具體涉及一種便于蛋白質(zhì)譜高效分析表達(dá)量差異 蛋白的蛋白提取和電泳方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是地球上最豐富的可再生資源，地球上每年因光合作用產(chǎn)生的纖維素達(dá)到 100億噸左右，利用纖維素生產(chǎn)生物能源，是緩解能源危機(jī)，實現(xiàn)人類可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。
[0003] 纖維素利用的關(guān)鍵是把纖維素降解為可發(fā)酵性的糖類-葡萄糖。纖維素的降解需 要外切酶、內(nèi)切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中內(nèi)切酶降解長片段的纖維素成為二聚體， 是纖維素降解的關(guān)鍵步驟。用纖維素酶降解纖維素具有綠色，條件溫和，轉(zhuǎn)化率高的特點， 但是纖維素較高的生產(chǎn)成本成為纖維素酶降解纖維素的瓶頸。
[0004] 獲得高產(chǎn)纖維素酶的菌株，降低纖維素酶的生產(chǎn)成本成為纖維素酶工業(yè)化利用的 必由之路。纖維素酶的生產(chǎn)菌株主要有黑曲霉。黑曲霉由于其較高的安全性，被認(rèn)為是生 產(chǎn)纖維素酶最有應(yīng)用前景的菌株之一。構(gòu)建黑曲霉高產(chǎn)菌種成為降低纖維素酶生產(chǎn)成本的 最有效途徑之一?，F(xiàn)在基因工程技術(shù)構(gòu)建纖維素酶生產(chǎn)菌種一般通過基因敲除某個基因或 增強(qiáng)某個基因的表達(dá)。這些手段構(gòu)建的基因工程菌種雖然產(chǎn)量有一定提高，但是產(chǎn)量提高 有限。原因基因工程敲除或強(qiáng)化表達(dá)的基因相對單一，纖維素酶產(chǎn)量的提高僅僅靠強(qiáng)化幾 個基因的表達(dá)，產(chǎn)量提高有限。要進(jìn)一步提高基因工程菌種，就需要在已有的操作目的基因 以外進(jìn)行改造。
[0005] 黑曲霉在誘導(dǎo)環(huán)境下下產(chǎn)生纖維素酶，基于二維電泳技術(shù)的技術(shù)能標(biāo)識在兩種誘 導(dǎo)劑誘導(dǎo)下胞外蛋白表達(dá)差異的種類，測定有差異蛋白的氨基酸序列，從而對表達(dá)有差異 的蛋白進(jìn)行鑒定。這些差異蛋白的鑒定，能為基因工程技術(shù)的改造提供新的操作對象，為基 因工程菌株的構(gòu)建提供一個新的改造目標(biāo)基因。
[0006] 黑曲霉由于胞壁堅韌，菌絲較長，必須有高效的破壁技術(shù)破除細(xì)胞壁，而且在細(xì)胞 壁破除時不破壞蛋白質(zhì)的肽鏈。已有的蛋白破壁方法如：研磨破碎要破碎霉菌的細(xì)胞壁，所 需的巨大剪切力對菌體的蛋白損傷較大，而且破壁性能較差，因此很能使用與精確定量和 定性分析的目的；超聲波破碎效果非常差，不適宜霉菌；用均漿機(jī)破碎時，具有破壁力大， 蛋白損傷或損失小的特點，但是由于霉菌的韌性較大，因此很難高效破碎，因此需要一定能 增加脆性的方法，使霉菌用均漿機(jī)破碎更高效。用低溫冷凍液增加霉菌脆性，是一個新的有 效的提高破壁效率和蛋白提取率的方法。
[0007] 同時由于黑曲霉的蛋白組成，不同于細(xì)菌、酵母菌，而且也顯著不同于其他霉菌。 黑曲霉的蛋白種類繁多，而且一些蛋白的理化性質(zhì)較為接近，已有的蛋白電泳技術(shù)不能非 常充分的分開黑曲霉的蛋白。因此必須有更高效的電泳方法來充分的分離各個蛋白質(zhì)點。
[0008] 同時在電泳時必須盡可能的把各個蛋白質(zhì)點展開，這樣才能高效的分析蛋白在表 達(dá)量和表達(dá)種類的差異。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于破碎細(xì)胞壁的低溫破壁液，該破壁液能夠能增加 蛋白的提取率。本發(fā)明的目的還在于提供一種蛋白三向電泳方法。本發(fā)明的破壁液與電泳 方法能高效的提取黑曲霉的蛋白并充分分離各個蛋白質(zhì)點。
[0010] 一種用于破碎細(xì)胞壁的低溫破壁液，其配制為：無水乙醇20g，三氯乙酸5g，醋酸 5g，十六烷基吡啶0. 02g，十二烷基硫酸鈉0. 03g，蒸餾水定容至IL;使用前在-20°C預(yù)冷 24h以上。
[0011] 一種蛋白三向電泳方法，包括如下步驟：
[0012] (1)制備蛋白電泳膠體：把塑料條用蒸餾水涂濕，放置在距制備膠體的盒子底部 靠近一端的位置，然后向盒子里面澆注SDS-PAGE膠體液至液體的高度達(dá)到l-2cm時候停止 澆注，放置一張醋酸纖維薄膜，繼續(xù)澆注，每升高l_2cm就放置一張醋酸纖維薄膜，直到液 面達(dá)到5-lOcm高，待膠體凝固后取下塑料條，得到一個放置IPG膠條的凹槽。
[0013] 所述的SDS-PAGE膠體液優(yōu)選為：50mL的配方：蒸餾水13. 3mL，30 % Acr-Bis(29:l)16.7mL，lMTrispH8.819.0mL，10%SDS0.5mL，10%過硫酸銨 0.5mL。
[0014] (2)IPG膠條預(yù)處理：使用IPG干膠條在電泳平衡液I中浸泡24h以上。
[0015] 所述的電泳平衡液I的配方優(yōu)選為：50mmol/LTris_HCl，6mol/L尿素，30%甘油， 40g/LSDS，痕量溴酚藍(lán)，使用前加入10g/LDTT。
[0016] (3)第一向電泳：將樣品加入IPG膠條進(jìn)行等電聚焦。
[0017] (4)第二、三向電泳：等電聚焦后的IPG膠條先后在平衡液I和平衡溶液中平衡后 轉(zhuǎn)移到步驟（1)制備的膠體的凹槽內(nèi)，再用SDS-PAGE膠體液密封IPG膠條進(jìn)行第二向電 泳；第二向電泳結(jié)束后再進(jìn)行第三向電泳。第二向電泳的方向與IPG膠條長邊垂直，第三向 電泳的方向與第二向電泳的電泳面垂直。
[0018] 所述的平衡溶液的配方優(yōu)選為：50mmol/LTris-HCl，6mol/L尿素，30%甘油，40g/ LSDS，痕量溴酚藍(lán)，25g/L碘乙酰胺。
[0019] (5)電泳后的膠體以醋酸纖維薄膜為支撐分成多片，再經(jīng)過固定、染色和脫色處理 后進(jìn)行掃描和質(zhì)譜分析。
[0020] 所述的低溫破壁液或蛋白三向電泳方法在分析蛋白表達(dá)量和表達(dá)種類的差異中 的應(yīng)用。
[0021] 一種便于蛋白質(zhì)譜高效分析黑曲霉表達(dá)量差異蛋白的蛋白提取和電泳方法，包括 如下步驟：
[0022] (1)離心收集胞外蛋白：黑曲霉液體發(fā)酵的發(fā)酵液5000g離心收集菌絲，取4g菌 絲用IOmL蒸餾水反復(fù)沖洗6次，洗滌菌絲的液體和離心收集的液體混合，用來收集胞外蛋 白。
[0023] (2)低溫高壓泵破碎細(xì)胞提取胞內(nèi)蛋白：取4g洗滌后的菌絲放入20mL預(yù)冷的上 述低溫破壁液中再加入到高壓均漿機(jī)里均漿破碎細(xì)胞。
[0024] (3)提取蛋白的濃縮和冷凍干燥：將步驟2)均漿破碎的細(xì)胞液和步驟1)的混合 蛋白液體混合均勻，加入10倍體積-20°c預(yù)冷的含100g/L三氯乙酸及0. 07%巰基乙醇的 丙酮溶液，并于-15°C靜置過夜；然后50000g、4°C離心30min，棄上清；再加入-20°C預(yù)冷的 含0.07%巰基乙醇的丙酮溶液，-20°C靜置2h，離心條件同上；重復(fù)上一步，立即離心，棄上 清；將沉淀冷凍干燥，干粉于_20°C放置備用。
[0025] (4)裂解和離心：稱取干粉0. 15g，加入2mL裂解液，30°C水浴保溫30min，然后 80000g、15°C離心lh，將上清液繼續(xù)在80000g、10°C離心40min，所得上清液按照上述方法 進(jìn)行蛋白三向電泳。
[0026] 所述的裂解液的配方優(yōu)選為：9.5mol/L尿素，20g/L3-[3-(膽酰胺丙基）二甲氨 基]丙磺酸內(nèi)鹽，l〇g/L二硫蘇糖醇。
[0027] 使用本發(fā)明的低溫破壁液和三向的電泳方法，更有利于蛋白的提取和區(qū)分蛋白表 達(dá)的差異，特別適用于對黑曲霉蛋白的提取和蛋白表達(dá)差異的分析。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1是電泳膠體盒示意圖。
[0029] 圖2是電泳盒1示意圖。
[0030] 圖3是電泳盒2示意圖。

【具體實施方式】
[0031] 以下實施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制，在不 背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換均屬于本 發(fā)明的范圍。若為特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手 段。
[0032] 實施例1蛋白的提取、電泳和掃描及質(zhì)譜分析
[0033] (1)蛋白提取
[0034] 1)離心收集胞外蛋白：黑曲霉液體發(fā)酵的發(fā)酵液5000g離心收集菌絲，取4g菌絲 用IOmL蒸餾水反復(fù)沖洗6次，洗滌菌絲的液體和離心收集的液體混合，用來收集胞外蛋白。
[0035] 2)低溫高壓泵破碎細(xì)胞提取胞內(nèi)蛋白：①制備低溫破壁液：無水乙醇20g，三氯乙 酸5g，醋酸5g，十六烷基吡啶0. 02g，十二烷基硫酸鈉0. 03g，蒸餾水定容至1L，在-20°C預(yù) 冷24h。②取4g洗滌后的菌絲放入20mL預(yù)冷的低溫破壁液中再加入到高壓均漿機(jī)（德國 APV-2000-4)里均漿破碎細(xì)胞，破碎壓力為lOOObar。
[0036] 3)提取蛋白的濃縮和冷凍干燥：將步驟2)均漿破碎的細(xì)胞液和步驟1)的混合 蛋白液體混合均勻，加入10倍體積-20°c預(yù)冷的含100g/L三氯乙酸及0. 07%巰基乙醇的 丙酮溶液，并于-15°C靜置過夜；然后50000g、4°C離心30min，棄上清；再加入-20°C預(yù)冷的 含0.07%巰基乙醇的丙酮溶液，-20°C靜置2h，離心條件同上；重復(fù)上一步，立即離心，棄上 清；將沉淀冷凍干燥，干粉于_20°C放置備用。
[0037] 4)裂解和離心：稱取干粉0·15g，加入2mL裂解液（9. 5mol/L尿素，20g/L 3-[3-(膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，10g/L二硫蘇糖醇），30°C水浴保溫30min，然 后80000g、15°C離心lh，將上清轉(zhuǎn)移至另一只離心管繼續(xù)在80000g、10°C離心40min，上清 液即可用于三向電泳。樣品的蛋白質(zhì)濃度用Bradford方法測定。
[0038] (2)高效電泳步驟
[0039] 1)電泳膠體盒的制備：用厚度為0. 5cm的PS塑料板制備如圖1所示的三向電泳 膠體盒。首先用電鋸切割制備14cmX14cm的塑料板一塊、14cmX6cm的塑料板4塊。用東 莞市聚力膠粘制品有限公司生產(chǎn)的幾-6287PC塑料粘接專用膠水按照圖1所示的粘接好。 用厚度為Icm的塑料加工一個14cmX3cm的塑料條。制備膠體時，塑料條放在膠體盒底板 (14cmX14cm的板）距離頂部（14cmX6cm的板）2cm的位置，如圖1所示。
[0040]2)電泳盒制備：用厚度為0.5cm的PS塑料板制造如圖2所示的電泳盒1。首先用 電鋸切割制備14cmX14cm的塑料板一塊，14cmX6cm的塑料板2塊。用JL-6287PC塑料粘 接專用膠水按照圖2所示粘接好。
[0041] 用厚度為0.5cm的PS塑料板制造如圖3所示的電泳盒2。首先用電鋸切割制備 14cmX6cm的塑料板4塊。用JL-6287PC塑料粘接專用膠水按照圖3所示粘接好。
[0042] 3)膠體制備：把14cmX3cmXIcm的塑料條用蒸餾水涂濕，放置在距制備膠體的盒 子底部距離端面2cm的位置（如圖1所示），然后向盒子里面澆注SDS-PAGE膠體液（50mL的 配方：蒸餾水13.31!^，30%六。1-818(29:1)16.711^，1]\11'1^ 8?!18.819.011^，10%503 0.511^， 10%過硫酸銨0. 5mL)到液體的高度達(dá)到I. 5cm時候停止?jié)沧?，放置一?4cmX14cm的 醋酸纖維薄膜，繼續(xù)澆注，每升高Icm就放置一張14cmX14cm的醋酸纖維薄膜，直到液面 達(dá)到5. 5cm高。室溫下冷卻，直到膠體凝固。然后取下塑料條，得到一個放置膠條的凹槽 (14cmX3cmX1cm)
[0043] 4)IPG膠條預(yù)處理：使用IPG干膠條（pH3-10,13cm，非線性）在電泳平衡液 I(50mmol/LTris-HCl，6mol/L尿素，30% 甘油，40g/LSDS，痕量溴酚藍(lán)，使用前加入 10g/L DTT)中浸泡24h。
[0044] 5)第一向電泳（等電聚焦）：用加樣杯上樣，樣品含IOOyg蛋白質(zhì)，樣品加入IPG 膠條。用Bio-Ral的ProteanIEFCell等電聚焦儀進(jìn)行等電聚焦，具體為：電泳儀的上槽 加入500mL0.IMH3PO4，下槽加入500mL0.IMNaOH，淹沒各管口和電極，用注射器或滴管吸 去管口的氣泡。上槽接正極，下槽接負(fù)極，開啟電泳儀，恒壓160V，聚焦3小時。
[0045] 6)第二向電泳：聚焦后的IPG膠條先在平衡液I(50mmol/LTris-HCl，6mol/L尿 素，30%甘油，40g/LSDS，痕量溴酚藍(lán)，使用前加入10g/LDTT)中平衡15min，再在平衡溶 液（50mmol/LTris-HCl，6mol/L尿素，30%甘油，40g/LSDS，痕量溴酚藍(lán)，25g/L碘乙酰胺） 中平衡15min。轉(zhuǎn)移到SDS-PAGE膠體（步驟3)制備的膠體）的凹槽內(nèi)。在凹槽底部放置 平展后，用SDS-PAGE膠體液（50mL的配方：蒸餾水 13. 3mL，30%Acr-Bis(29:1) 16. 7mL，IM TrisρΗ8· 819.OmL，10%SDS0· 5ml，10%過硫酸銨0· 5mL)倒?jié)M凹槽，密封膠條。使用鄭州 博邦儀器有限公司的JY-SPE型電泳儀器進(jìn)行電泳，然后把膠體放入到電泳盒1內(nèi)，再放入 到電泳儀內(nèi)，70V電泳到溴酚藍(lán)距離底部2cm停止電泳。第二向電泳的方向與IPG膠條長邊 垂直，電泳緩沖液為：25mMTris，192mMglycine，0. 1%SDS，溶劑為雙蒸水。
[0046] 7)第三向電泳：電泳的膠體放入到電泳盒2中，然后讓14cmX6cm的一個面朝下 (第三向電泳的方向與第二向電泳的電泳面垂直），讓膠條所在的14cmX14cm的面靠近正 極，然后70V電泳30min。電泳緩沖液為25mMTris，192mMglycine，0. 1%SDS，溶劑為雙蒸 水。
[0047] (3)固定和染色
[0048] 電泳完備的膠體以每層醋酸纖維薄膜為支撐，分為5片。分片的凝膠立即浸泡在 固定液（500mL乙醇，IOOmL冰醋酸，400mL蒸餾水）中至少30min;將固定后的凝膠在染色 液（0. 29g考馬斯亮藍(lán)溶解在250mL脫色液（250mL乙醇，80mL冰醋酸，加蒸餾水至1L)中， 在使用前邊攪拌邊加熱至60°C)中浸泡lOmin，然后用蒸餾水將凝膠淋洗一次；多次更換脫 色液（250mL乙醇，SOmL冰醋酸，加蒸餾水至1L)，直至凝膠背景脫凈為止。
[0049] 每片凝膠用Imagescanner掃描，用Melanie3102軟件分析圖譜。首先進(jìn)行點檢測， 然后選擇5個分布較好的點標(biāo)記并配齊（align)，接著選擇一個參考膠，以重疊方式進(jìn)行自 動匹配。分析顯示蛋白種類和表達(dá)量有差異的點。
[0050] (6)差異蛋白鑒定
[0051] 取目的蛋白質(zhì)點，用解剖刀沿染色邊緣切下蛋白點放在少量Mi11i2Q水中，用 MALDI2T0F質(zhì)譜儀制備肽質(zhì)量指紋譜。用含50%乙腈、25mmol/L碳酸氫銨的溶液將凝膠脫 色，膠片真空干燥后用胰蛋白酶水解提取肽段，然后與過量的基質(zhì)混合，加在樣品靶盤上， 溶劑揮發(fā)后蛋白質(zhì)與基質(zhì)形成共結(jié)晶，再用脈沖激光照射靶點，導(dǎo)致蛋白質(zhì)電離，經(jīng)過質(zhì)量 分析器檢測，獲得多肽混合物的質(zhì)量。
[0052] 實施例2
[0053] (1)菌株和培養(yǎng)基
[0054]黑曲霉（Aspergillusniger)從ATCC購買，菌株編號為ATCC10582。
[0055] 黑曲霉誘導(dǎo)液體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米芯或稻草秸桿堿水解產(chǎn)物5.Og，硫酸銨0.08g， 蛋白胨0. 075g，葡萄糖lg，酵母浸膏0. 03g，磷酸二氫鉀0. 5g，氯化媽0. 001g，硫酸鎂 0. 〇〇lg，硫酸亞鐵0. 271mg，硫酸錳0. 16g，氯化鈷0. 36g，氯化鈣0. 08g，蒸餾水定容至 100mL，115°C滅菌20min。其中，玉米芯或稻草秸桿堿水解產(chǎn)物的制備為：100g玉米芯或稻 草秸桿粉碎60目，IOOg氫氧化鈉，IOOOmL蒸餾水，30°C水解24h，水解完后，用蒸餾水沖洗至 中性，60°C烘干72h至恒重。
[0056] 黑曲霉非誘導(dǎo)液體發(fā)酵培養(yǎng)基：硫酸按0.08g，蛋白胨0.075g，葡萄糖lg，酵母 浸膏0. 03g，磷酸二氫鉀0. 5g，氯化鈣0. 001g，硫酸鎂0. 001g，硫酸亞鐵0. 271mg，硫酸錳 0. 16g，氯化鈷0. 36g，氯化媽0. 08g，蒸餾水定容至100mL，115°C滅菌20min。
[0057] (2)黑曲霉液體發(fā)酵
[0058] 將保藏的黑曲霉孢子斜面用液體發(fā)酵培養(yǎng)基沖洗并用液體發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)節(jié)孢子 數(shù)目，將50mL含孢子數(shù)目為IXIO8AiL的誘導(dǎo)或非誘導(dǎo)液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入150mL三角瓶 中于 28°C、150r/m發(fā)酵 168h。
[0059] (3)蛋白的提取、電泳和掃描及質(zhì)譜分析
[0060] 具體方法同實施例1蛋白的提取、電泳和掃描及質(zhì)譜分析。黑曲霉在誘導(dǎo)液體培 養(yǎng)基發(fā)酵后提取胞內(nèi)和胞外蛋白，電泳和染色后，得到的蛋白不同印跡點有1200個，得到 的蛋白不同印跡點經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)基和非誘導(dǎo)培養(yǎng)基有15種表達(dá)有差異的蛋白，如 表1。
[0061]表1
[0062]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于破碎細(xì)胞壁的低溫破壁液，其特征在于：每1L該低溫破壁液的配制為：無 水乙醇20g，三氯乙酸5g，醋酸5g，十六烷基吡啶0. 02g，十二烷基硫酸鈉0. 03g，蒸餾水定容 至1L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于破碎細(xì)胞壁的低溫破壁液，其特征在于：使用前在_20°C 預(yù)冷24h以上。
3. -種蛋白三向電泳方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 制備蛋白電泳膠體：把塑料條用蒸餾水涂濕，放置在距制備膠體的盒子底部靠近一 端的位置，然后向盒子里面澆注SDS-PAGE膠體液至液體的高度達(dá)到l-2cm時候停止?jié)沧ⅲ?放置一張醋酸纖維薄膜，繼續(xù)澆注，每升高l_2cm就放置一張醋酸纖維薄膜，直到液面達(dá)到 5-lOcm高，待膠體凝固后取下塑料條，得到一個放置IPG膠條的凹槽； (2) IPG膠條預(yù)處理：使用IPG干膠條在電泳平衡液I中浸泡24h以上； 所述的電泳平衡液I的配方為：50mmol/L Tris-HCl，6mol/L尿素，30%甘油，40g/L SDS，痕量溴酚藍(lán)，使用前加入10g/L DTT ; (3) 第一向電泳：將樣品加入IPG膠條進(jìn)行等電聚焦； (4) 第二、三向電泳：等電聚焦后的IPG膠條先后在電泳平衡液I和平衡溶液中平衡后 轉(zhuǎn)移到步驟（1)制備的膠體的凹槽內(nèi)，再用SDS-PAGE膠體液密封IPG膠條進(jìn)行第二向電泳； 第二向電泳結(jié)束后再進(jìn)行第三向電泳； 所述的平衡溶液的配方為：50mmol/L Tris-HCl，6mol/L尿素，30%甘油，40g/L SDS，痕 量溴酚藍(lán)，25g/L碘乙酰胺； (5) 電泳后的膠體以醋酸纖維薄膜為支撐分成多片，再經(jīng)過固定、染色和脫色處理后進(jìn) 行掃描和質(zhì)譜分析。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白三向電泳方法，其特征在于：所述的SDS-PAGE膠體液每 50mL 的配方為：蒸餾水 13.3mL，30% Acr-Bis (29:l)16.7mL，lM Tris pH8.8 19.0mL，10% SDS 0? 5mL，10% 過硫酸銨 0? 5mL。
5. 權(quán)利要求1所述的低溫破壁液或權(quán)利要求3所述的蛋白三向電泳方法在分析蛋白表 達(dá)量和表達(dá)種類的差異中的應(yīng)用。
6. -種便于蛋白質(zhì)譜高效分析黑曲霉表達(dá)量差異蛋白的蛋白提取和電泳方法，其特征 在于包括如下步驟： (1) 離心收集胞外蛋白：黑曲霉液體發(fā)酵的發(fā)酵液5000g離心收集菌絲，取4g菌絲用 10mL蒸餾水反復(fù)沖洗6次，洗滌菌絲的液體和離心收集的液體混合； (2) 低溫高壓泵破碎細(xì)胞提取胞內(nèi)蛋白：取4g洗滌后的菌絲放入20mL預(yù)冷的權(quán)利要 求1所述的低溫破壁液中再加入到高壓均漿機(jī)里均漿破碎細(xì)胞； (3) 提取蛋白的濃縮和冷凍干燥：將步驟2)均漿破碎的細(xì)胞液和步驟1)的混合蛋白 液體混合均勻，加入10倍體積-20°C預(yù)冷的含100g/L三氯乙酸及0. 07%巰基乙醇的丙酮 溶液，并于-15°C靜置過夜；然后50000g、4°C離心30min，棄上清；再加入-20°C預(yù)冷的含 0. 07%巰基乙醇的丙酮溶液，-20°C靜置2h，離心條件同上；重復(fù)離心棄上清；將沉淀冷凍干 燥得干粉； (4) 裂解和離心：稱取干粉0. 15g，加入2mL裂解液，30°C水浴保溫30min，然后80000g、 15°C離心lh，將上清液繼續(xù)在80000g、10°C離心40 min，所得上清液按照權(quán)利要求3所述的 方法進(jìn)行蛋白三向電泳。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白提取和電泳方法，其特征在于：步驟（4沖所述的裂解液 的配方為：9.5mol/L尿素，20g/L 3-[3-(膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，10g/L二硫 蘇糖醇。
【文檔編號】G01N30/72GK104483421SQ201410840382
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月29日
【發(fā)明者】薛棟升 申請人:湖北工業(yè)大學(xué)