專利名稱：一種毛細(xì)管電泳涂層柱的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種毛細(xì)管電泳柱，特別涉及一種采用新型聚合物涂層的毛細(xì)管電泳涂層柱。
背景技術(shù)：
毛細(xì)管內(nèi)表面由于Si-OH的電離，形成Si-O-，存在對堿性物質(zhì)的吸附，吸附容易造成譜圖拖尾，分離柱效下降，分離時間增長等缺陷。因此控制電滲流，降低吸附是提高堿性物質(zhì)分離效果的一個非常有效的手段。利用電壓減小的方法，可以降低電滲流，但是也降低了電泳的速度，堿性物質(zhì)之間的淌度減小，增大了分離時間。利用極限pH值可以減緩吸附，控制電滲流，但是像堿性蛋白質(zhì)、核苷等生物分子，在過高、過低pH值下均易發(fā)生水解，變性使分離失去意義。相比之下，毛細(xì)管涂層技術(shù)用于改變毛細(xì)管內(nèi)壁的表面電荷是控制電滲流，減小吸附的有效途徑。
傳統(tǒng)的涂層材料多采用傳統(tǒng)聚合物，而傳統(tǒng)聚合物一般為線性聚合物，線性聚合物的粘度往往隨著濃度的增加而增加，對毛細(xì)管進(jìn)行涂敷時，涂敷濃度增大，會造成粘度急劇增加，很容易造成涂敷不均，甚至堵塞毛細(xì)管。而濃度太小的話，又很容易造成涂層太薄，不能完全將毛細(xì)管壁上的Si-OH覆蓋；所以線性聚合物的涂敷濃度一般在5％左右，不能很好的覆蓋硅羥基，抑制堿性物質(zhì)的吸附。
樹狀支化大分子有著規(guī)整的樹冠結(jié)構(gòu)，空間結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)球形(如附錄一)。很大程度上避免了傳統(tǒng)聚合物的鏈與鏈之間交聯(lián)，宏觀上呈現(xiàn)出粘度較小，隨著濃度的增加粘度變化很小的特點，比較適合涂敷毛細(xì)管；由于樹狀支化大分子樹冠部分存在大量的官能團(tuán)，比較容易跟毛細(xì)管壁的Si-OH結(jié)合，涂敷簡單，涂層牢固。

發(fā)明內(nèi)容為了克服以上技術(shù)的不足，本發(fā)明利用提供一種采用新型聚合物涂層的毛細(xì)管電泳涂層柱，克服了傳統(tǒng)的涂層材料——線性聚合物涂敷濃度太低，涂層厚度不夠，不能很好抑制硅羥基的電離的缺點。
本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的本發(fā)明的毛細(xì)管電泳涂層柱，是由樹狀支化大分子經(jīng)過物理吸附和化學(xué)鍵合的方式制得毛細(xì)管電泳涂層柱，所述的樹狀支化大分子為超支化聚合物或樹枝狀大分子。
本發(fā)明的毛細(xì)管電泳涂層柱，所述的超支化聚合物為超支化聚(胺-酯)或超支化聚酯。所述的物理吸附方式為直接將超支化聚(胺-酯)、超支化聚酯涂敷在毛細(xì)管內(nèi)壁；所述的化學(xué)鍵合方式為利用硅烷化偶聯(lián)劑γ-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷將合成的超支化聚(胺-酯)或超支化聚酯涂于毛細(xì)管內(nèi)壁。
本發(fā)明的毛細(xì)管電泳涂層柱，所述的樹枝狀大分子為有機(jī)硅樹枝狀大分子。所述的物理吸附方式為直接將有機(jī)硅樹枝狀大分子涂敷到毛細(xì)管電泳柱內(nèi)壁；所述的化學(xué)鍵合方式為利用硅烷化偶聯(lián)劑γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(KH-550)、雙[γ-(三乙氧基硅基)丙基]胺(KH-402)將合成的硅氯鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子涂于毛細(xì)管內(nèi)壁?；蛞砸蚁┗已趸柰?Vinyl tirethoxysilane，A-151)為偶聯(lián)劑將合成的以雙鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子涂于毛細(xì)管內(nèi)壁。
1.本發(fā)明的涂層柱的原理根據(jù)樹狀支化大分子一個最突出的特點就是在同等的條件下，其比傳統(tǒng)的聚合物的粘度低。因此如果將樹狀支化大分子作為毛細(xì)管柱涂層材料，就解決了傳統(tǒng)聚合物高濃度必然伴隨著高粘度的問題。由于其粘度較低，因而很容易的涂敷于毛細(xì)管柱內(nèi)壁，形成穩(wěn)定的薄層，而且更為重要的是，樹狀支化大分子分子外圍有大量可供改性的活性端基，因而更易于鍵合于毛細(xì)管柱內(nèi)表面，提高聚合物涂層的穩(wěn)定性，這就為能夠更好的抑制電滲流和減少對蛋白質(zhì)、堿基等堿性物質(zhì)的吸附，改善對堿性物質(zhì)的分析分離效果提供了結(jié)構(gòu)上的保障。
樹狀支化大分子同傳統(tǒng)線性聚合物比較如表1。
表1
樹狀支化大分子由于具有高度支化三維立體球狀結(jié)構(gòu)以及大量的表面官能團(tuán)，因此顯示出與線性分子截然不同的性質(zhì)，如低粘度、無鏈纏繞和良好的溶解性。本發(fā)明的樹狀支化大分子涂層毛細(xì)管電泳柱在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、國防、醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、環(huán)境保護(hù)等國民經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景，對人類社會的進(jìn)步將產(chǎn)生一定的影響。
2.本發(fā)明的毛細(xì)管電泳涂層的制備2.1 物理吸附毛細(xì)電泳涂層柱2.1.1 Si-Cl封端有機(jī)硅樹枝狀大分子的物理吸附毛細(xì)管電泳涂層柱將已經(jīng)制得的各代以Si-Cl封端有機(jī)硅樹枝狀大分子分別溶于除水凈化的二氯甲烷中，配置成15％的溶液，以1～2Mpa的氮氣壓將溶液壓入毛細(xì)管柱內(nèi)，在0.5MPa的氮氣流下將涂漬液緩慢吹出，使涂漬液在毛細(xì)管內(nèi)壁上形成一層均勻的液膜。
涂層柱的老化處理將用有機(jī)硅樹枝狀大分子涂漬過的毛細(xì)管柱置于氣相色譜爐內(nèi)于1Mpa的氮氣流下從50℃半小時程序升溫至200℃，保持終點溫度3h，冷卻后用無水二氯甲烷沖洗掉未反應(yīng)的樹枝狀大分子，然后無水甲醇沖洗柱子半小時，反應(yīng)掉剩余的Si-Cl，即得物理吸附型涂層毛細(xì)管柱。反應(yīng)方程式如下 2.1.2雙鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子的物理吸附毛細(xì)管電泳涂層柱將制得得各代以雙鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子配置成20％得二氯甲烷溶液，以1～2Mpa的氮氣壓將溶液壓入毛細(xì)管柱內(nèi)，在0.5MPa的氮氣流下將涂漬液緩慢吹出，使涂漬液在毛細(xì)管內(nèi)壁上形成一層均勻的液膜即得雙鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子的物理吸附毛細(xì)管電泳涂層柱2.1.3超支化聚(胺-酯)的物理吸附毛細(xì)管電泳涂層柱將超支化聚(胺-酯)配置成10％的甲醇溶液用于涂敷毛細(xì)管電泳柱，詳細(xì)步驟同2.1.12.1.4超支化聚酯的物理吸附毛細(xì)管涂層柱詳細(xì)步驟同2.1.32.2化學(xué)鍵合毛細(xì)管電泳涂層柱
2.2.1 Si-Cl封端有機(jī)硅樹枝狀大分子的化學(xué)鍵合毛細(xì)管電泳柱涂層柱毛細(xì)管柱的預(yù)處理在一定的氮氣壓力下，先用氫氟酸侵蝕毛細(xì)管柱內(nèi)壁約5min，接著用二次蒸餾水和甲醇順序地清洗用氫氟酸預(yù)處理過的毛細(xì)管柱各10min，最后用氮氣將毛細(xì)管柱吹干。
毛細(xì)管柱的硅烷化處理將偶聯(lián)劑KH-550壓入經(jīng)預(yù)處理過的毛細(xì)管柱內(nèi)，并用氮氣緩緩吹出剩余的涂漬液，然后將毛細(xì)管柱置于氣相色譜爐內(nèi)于一定的氮氣流下從50℃半小時程序升溫至150℃，保持終點溫度3h進(jìn)行老化處理，以使涂層固化。該反應(yīng)為偶聯(lián)劑γ-氨基丙基三乙氧基硅烷上的乙氧基與毛細(xì)管壁上的Si-OH反應(yīng)，將活性端基胺基引入毛細(xì)管內(nèi)壁上，具體反應(yīng)方程式如下 有機(jī)硅樹枝狀大分子化學(xué)鍵合涂層柱的制備將已經(jīng)各代以Si-Cl封端有機(jī)硅樹枝狀大分子分別溶于除水凈化的二氯甲烷中，配置成15％的溶液，以1～2Mpa的氮氣壓將溶液壓入毛細(xì)管柱內(nèi)，在0.5MPa的氮氣流下將涂漬液緩慢吹出，使涂漬液在毛細(xì)管內(nèi)壁上形成一層均勻的液膜，然后將涂層毛細(xì)管柱置于氣相色譜爐內(nèi)于一定的氮氣流下從50℃半小時程序升溫至200℃，保持終點溫度3h進(jìn)行老化處理，以使有機(jī)硅有機(jī)硅樹枝狀大分子表面的端Si-Cl與硅烷化處理過毛細(xì)管壁上的-NH2反應(yīng)，從而將有機(jī)硅有機(jī)硅樹枝狀大分子鍵合于毛細(xì)管內(nèi)壁上。反應(yīng)方程式如下 最后利用二氯甲烷沖洗掉未反應(yīng)的樹枝狀大分子，用甲醇沖柱半小時來反應(yīng)掉未鍵合的Si-Cl，用氮氣吹干即得以KH-550為偶聯(lián)劑的熱交聯(lián)化學(xué)鍵合涂層柱。
2.2.2雙鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子的化學(xué)鍵合毛細(xì)管電泳涂層柱毛細(xì)管預(yù)處理同2.2.1。
雙鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子的化學(xué)鍵合毛細(xì)管電泳涂層柱的制備將各代以雙鍵封端的樹枝狀大分子、乙烯基三乙氧基硅烷和偶氮二異丁氰以質(zhì)量比10∶20∶1的比例混合后，溶于二氯甲烷溶劑中，制得樹枝狀大分子含量為15％的混合溶液。將混合溶液在2MPa氣壓下，將混合溶液充入毛細(xì)管柱中，保持5分鐘后用氮氣吹干，從40℃開始半小時程序升溫至120℃，使乙烯基三乙氧基硅烷與雙鍵封端的樹枝狀大分子的聚合和鍵合同時進(jìn)行。在終點保持溫度1h，用二氯甲烷沖洗掉未反應(yīng)的G3和乙烯基三乙氧基硅烷，用氮氣吹干即得雙鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子的化學(xué)鍵合涂層柱。
反應(yīng)方程式如下 2.2.3超支化聚(胺-酯)的化學(xué)鍵合毛細(xì)管電泳涂層柱毛細(xì)管預(yù)處理同2.2.1。
毛細(xì)管柱的硅烷化處理將偶聯(lián)劑γ-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷吸入經(jīng)預(yù)處理過的毛細(xì)管柱內(nèi)，并用氮氣緩緩吹出剩余的涂漬液，然后將毛細(xì)管柱置于氣相色譜爐內(nèi)于一定的氮氣流下從50℃至150℃程序升溫，保持終點溫度3h進(jìn)行老化處理，以使涂層固化。該反應(yīng)為偶聯(lián)劑γ-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷上的甲氧基與毛細(xì)管壁上的硅羥基反應(yīng)，將活性端基環(huán)氧基引入毛細(xì)管內(nèi)壁上，具體反應(yīng)方程式如下
超支化聚(胺-酯)化學(xué)鍵合涂層柱的制備將合成的分別以三羥甲基丙烷和季戊四醇為核的超支化聚(胺-酯)的第五代、第六代、第七代產(chǎn)物吸入經(jīng)硅烷化處理的毛細(xì)管柱內(nèi)，在一定的氮氣流下將剩余的涂漬液緩慢吹出，然后將化學(xué)鍵合涂層毛細(xì)管柱置于氣相色譜爐內(nèi)于一定的氮氣流下從50℃至150℃程序升溫，保持終點溫度3h進(jìn)行老化處理，以使超支化聚(胺-酯)的端羥基與毛細(xì)管壁上的環(huán)氧基反應(yīng)，從而將超支化聚(胺-酯)鍵合于毛細(xì)管內(nèi)壁上其具體反應(yīng)如下 2.2.4超支化聚酯的化學(xué)鍵合毛細(xì)管電泳涂層柱同2.2.33.本發(fā)明毛細(xì)管電泳涂層柱的性能測試所制得的樹狀支化大分子毛細(xì)管電泳涂層柱，涂層性能良好，在pH＝5時，對堿性蛋白質(zhì)的分離柱效普遍達(dá)到106，有效的抑制了硅羥基的電離對堿性蛋白質(zhì)的吸附。適用堿性蛋白質(zhì)等生物大分子的毛細(xì)管電泳分離所制得的有機(jī)硅樹枝狀大分子毛細(xì)管電泳涂層柱，涂層性能良好，在pH＝4.5時，對堿基及其衍生物的分離柱效普遍達(dá)到1.2×105，分離效果良好，有效的抑制了硅羥基的電離對堿基及其衍生物的吸附。適用于有機(jī)堿性小分子和無機(jī)陽離子的分離。
本發(fā)明的有益效果是，具有涂層性能好，對堿性蛋白質(zhì)、有機(jī)堿性小分子、無機(jī)陽離子等的分離效果好，有效抑制了對堿基及其衍生物的吸附。
(四)附錄說明

圖1.為本發(fā)明的樹狀支化大分子聚合物的兩種平面結(jié)構(gòu)2.為本發(fā)明的毛細(xì)管電泳涂層柱的分離譜圖。
圖中，a，g的電泳條件pH＝5.0的磷酸鹽緩沖溶液，分離電壓15.8KV；內(nèi)徑75μm電泳柱，51cm×35.5cm；賓達(dá)1229毛細(xì)管電泳儀，UV-214檢測；1.細(xì)胞色素C、2.溶菌酶、3.α胰凝乳蛋白酶原A。
h的電泳條件pH＝5.0的磷酸鹽緩沖溶液，分離電壓16KV；內(nèi)徑75μm電泳柱，55cm×50cm；賓達(dá)1229毛細(xì)管電泳儀，UV-214檢測；1.細(xì)胞色素C、2.溶菌酶、3.α胰凝乳蛋白酶原A。
b，c，d，e，f的電泳條件pH＝4.5的磷酸鹽緩沖溶液，分離電壓16KV；內(nèi)徑75μm電泳柱，55cm×50cm；賓達(dá)1229毛細(xì)管電泳儀，UV-254檢測；1.腺嘌呤、2.腺苷和3.6-糠氨基嘌呤。
具體實施方式
實例一空白柱pH＝5時對細(xì)胞色素C、溶菌酶、α胰凝乳蛋白酶原A三種堿性蛋白質(zhì)的分離譜圖如圖2a，無法分離；pH＝4.5時對腺嘌呤、腺苷和6-糠氨基嘌呤三種堿基及其衍生物如圖2b，分離效果不好，柱效普遍為1.8×104，分離時間過長，近50分鐘方能分離完全。
實例二以四氯硅烷為中心起始核，以烯丙基溴化鎂、甲基氫二氯硅烷為增長單體，反復(fù)進(jìn)行Grignard反應(yīng)和硅氫加成反應(yīng)三次得3代以硅氯鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子。
3代以硅氯鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子物理吸附涂層柱如2.1.1所述制得涂層毛細(xì)管電泳柱，測試其柱性能。得到譜圖如圖2c，分離柱效平均達(dá)到9×104，20分鐘內(nèi)即可將腺嘌呤、腺苷和6-糠氨基嘌呤三種堿基及其衍生物分離完全。
實例三以四甲基四乙烯基環(huán)四硅氧烷為中心起始核，以甲基氫二氯硅烷，烯丙基溴化鎂為增長單體，反復(fù)進(jìn)行硅氫加成，Grignard反應(yīng)3.5次得3.5代以硅氯鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子3.5代以硅氯鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子化學(xué)鍵合涂層柱(KH-550為偶聯(lián)劑)如2.2.1所述制得涂層毛細(xì)管電泳柱，測試其柱性能。得到譜圖如圖2d，分離柱效平均達(dá)到12×104，18分鐘內(nèi)即可將三種物質(zhì)分離完全。
實例四如實例三制得3.5代以硅氯鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子。
3.5代以硅氯鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子化學(xué)鍵合涂層柱(KH-402為偶聯(lián)劑)如2.2.1所述以KH-402為偶聯(lián)劑制得涂層毛細(xì)管電泳柱。反應(yīng)方程如下 得到譜圖如圖2e，分離柱效平均達(dá)到5×104，23分鐘內(nèi)即可將三種物質(zhì)分離完全。
實例五如實例三反復(fù)進(jìn)行反應(yīng)三次得3代以雙鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子。
3代以雙鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子化學(xué)鍵合涂層柱(A-151為偶聯(lián)劑)如2.2.2制得化學(xué)鍵合涂層柱，測定其柱性能得到譜圖如圖2f，分離柱效平均達(dá)到10×104，17分鐘內(nèi)即可將三種物質(zhì)分離完全。
實例6其中1為對甲苯磺酸。
一步法合成三羥甲基丙烷7代為核的超支化聚(胺-酯)在95.5g N，N-二羥乙基-3-胺基丙酸甲酯單體中，加入505.9mg對甲苯磺酸和723.0mg三羥甲基丙烷，升溫至回流溫度保持不變，反應(yīng)4小時，再抽真空除去反應(yīng)中生成的甲醇和未反應(yīng)的小分子化合物，即得超支化聚(胺-酯)第五代產(chǎn)物(G5)。改變單體的比例，在同樣條件下聚合，分別得到超支化聚(胺-酯)第六代(G6)和第七代(G7)產(chǎn)物以三羥甲基丙烷7代為核的超支化聚(胺-酯)的化學(xué)涂層毛細(xì)管電泳柱同2.2.3制得化學(xué)涂層毛細(xì)管電泳柱。
將制得的毛細(xì)管電泳柱用于分離細(xì)胞色素C、溶菌酶、α胰凝乳蛋白酶原A三種堿性蛋白質(zhì)，得到如圖2g的譜圖，分離柱效達(dá)到73×104。分離效果良好，完全抑制了堿性蛋白質(zhì)的吸附。
實例7準(zhǔn)一步法合成超支化聚酯在四頸瓶中加入2.0g三羥甲基丙烷、30mg對甲苯磺酸和6.0g 2，2-二羥甲基丙酸，升溫至140℃保持不變，反應(yīng)2小時，在此溫度下真空抽濾1小時即得超支化聚酯的第一代產(chǎn)物(G1)；在此反應(yīng)體系內(nèi)加入12.0g 2，2-二羥甲基丙酸和60mg對甲苯磺酸，在同樣的反應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)，即得超支化聚酯的第二代產(chǎn)物(G2)；依次按不同比例加入2，2-二羥甲基丙酸和對甲苯磺酸，在同樣條件下進(jìn)行反應(yīng)，分別得到以三羥甲基丙烷為核的超支化聚酯的第三代產(chǎn)物(G3)、第四代產(chǎn)物(G4)、第五代產(chǎn)物(G5)和第六代產(chǎn)物(G6)。
準(zhǔn)一步法合成的以三羥甲基丙烷5代為核的超支化聚酯的化學(xué)涂層毛細(xì)管電泳柱按照2.1.4所示制得物理吸附涂層柱，用于分離細(xì)胞色素C、溶菌酶、α胰凝乳蛋白酶原A三種堿性蛋白質(zhì)。測得其柱性能，得到如圖2.h的譜圖，分離柱效平均為3×104。
權(quán)利要求
1.一種毛細(xì)管電泳涂層柱，其特征在于由樹狀支化大分子經(jīng)過物理吸附或化學(xué)鍵合的方式粘合在電泳毛細(xì)管的內(nèi)壁制成，所述的樹狀支化大分子為超支化聚合物或樹枝狀大分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳涂層柱，其特征在于所述的超支化聚合物為超支化聚(胺-酯)或超支化聚酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳涂層柱，其特征在于所述的樹枝狀大分子為有機(jī)硅樹枝狀大分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的毛細(xì)管電泳涂層柱，其特征在于所述的化學(xué)鍵合方式的偶聯(lián)劑為γ-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的毛細(xì)管電泳涂層柱，其特征在于所述的化學(xué)鍵合方式的偶聯(lián)劑為γ-氨基丙基三乙氧基硅烷或雙[γ-(三乙氧基硅基)丙基]胺，所述的有機(jī)硅樹枝狀大分子為硅氯鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的毛細(xì)管電泳涂層柱，其特征在于所述的化學(xué)鍵合方式的偶聯(lián)劑為乙烯基三乙氧基硅烷，所述的有機(jī)硅樹枝狀大分子為雙鍵封端的有機(jī)硅樹枝狀大分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種毛細(xì)管電泳柱，特別涉及一種采用新型聚合物涂層的毛細(xì)管電泳涂層柱，用對堿性蛋白質(zhì)、有機(jī)堿性小分子、無機(jī)陽離子等的電泳分離。本發(fā)明的毛細(xì)管電泳涂層柱，是由樹狀支化大分子經(jīng)過物理吸附和化學(xué)鍵合的方式制得毛細(xì)管電泳涂層柱，所述的樹狀支化大分子為超支化聚合物或樹枝狀大分子。本發(fā)明的有益效果是，具有涂層性能好，對堿性蛋白質(zhì)、有機(jī)堿性小分子、無機(jī)陽離子等的分離效果好，有效抑制了對堿基及其衍生物的吸附。
文檔編號G01N27/447GK1885026SQ200610044550
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月29日
發(fā)明者壽崇琦, 邢希學(xué), 康杰分, 張志良, 宋南京, 尚盼 申請人:濟(jì)南大學(xué)