專利名稱：高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析系統(tǒng)及其分析法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種液相串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC-MS/MS)系統(tǒng)及方法，特別是涉及一種用于藥物篩選及生物樣品分析的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析系統(tǒng)及其分析法。
背景技術(shù)：
高通量篩選(high throughput screening, HTS)技術(shù)是新藥開發(fā)過程中不可缺少的一環(huán)。新藥研發(fā)的長周期要求必須提高開發(fā)效率，因此，高通量篩選方法得到了大力推廣。LC-MS/MS是液相色譜與質(zhì)譜儀串聯(lián)使用的一種分離分析檢測儀，它主要利用液相色譜出色的分離效果以及質(zhì)譜的高靈敏度，高選擇性的特點(diǎn)來完成化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)的高通量篩選以及更進(jìn)一步地研究。LC-MS/MS聯(lián)用方法有很多種，目前使用較多的有普通HPLC(High Performance LiquidChromatography，高效液相色譜法)、CTC自動進(jìn)樣器(瑞士 CTC公司)與質(zhì)譜串聯(lián)使用，也有自帶自動進(jìn)樣器的 HPLC 或者 UPLC(Ultra Performance Liquid chromatography, 超高效液相色譜)與質(zhì)譜串聯(lián)使用，這兩者的缺點(diǎn)在于自動進(jìn)樣器的延遲時間太長導(dǎo)致整個樣品分析的時間延長導(dǎo)致浪費(fèi)，此外還有因?yàn)樽詭У淖詣舆M(jìn)樣器板位少，所以一次所能承載的樣品數(shù)比較少不利于充分利用儀器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于藥物篩選及生物樣品分析的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析系統(tǒng)及其分析法。本發(fā)明可以減少進(jìn)樣體積、縮短進(jìn)樣時間，并且能根據(jù)不同項(xiàng)目的要求最大限度地減少分析物殘留(Carry over)的影響，以及能更進(jìn)一步地提高被分析物的檢測靈敏度。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的用于藥物篩選及生物樣品分析的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)分析系統(tǒng)，包括高效液相色譜儀、質(zhì)譜儀，還包括脈沖進(jìn)樣器，用于調(diào)整脈沖進(jìn)樣體積，確保樣品分析的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度以及精密度；電子脈沖裝置，用于反沖進(jìn)樣閥，輔助完成洗針過程；數(shù)據(jù)自動處理模塊，用于經(jīng)高效液相色譜儀和質(zhì)譜儀分析得到的批量數(shù)據(jù)，通過運(yùn)用宏來完成自動化處理。所述高效液相色譜儀中，色譜柱為2 3cm長的反相C18色譜柱。
所述脈沖進(jìn)樣器為杰爾森自動進(jìn)樣器。 所述電子脈沖裝置為電子脈沖反沖閥，其組成部分包括220V電源、交流適配器、 中間繼電器、時間繼電器、計量泵和杰爾森限位開關(guān)六部分組成；其連接關(guān)系為Gilson(杰爾森)限位開關(guān)接中間繼電器；中間繼電器和時間繼電器接220V電源；中間繼電器和計量泵接24V直流電源；計量泵接中間繼電器和時間繼電器。電子脈沖反沖閥的運(yùn)作原理是外部限位開關(guān)給中間繼電器一個12V信號，中間繼電器開始工作；利用中間繼電器常開狀態(tài)供給時間繼電器220V電源，時間繼電器開始工作；通過調(diào)節(jié)可使時間繼電器在規(guī)定時間內(nèi)閉合和斷開其控制線路的頻率；線路開閉控制計量泵工作。所述數(shù)據(jù)自動處理模塊為以DiscoveryQuant 2. O和Microsoft Excel VBA(MicrosoftCorporation)為基礎(chǔ)設(shè)計的數(shù)據(jù)處理模塊；其中，DiscoveryQuant 2. O包括 DiscoveryQuant-Optimize 禾口 DiscoveryQuant—Analyze(Applied Biosystems Inc.)另外，本發(fā)明還公開了一種用于藥物篩選及生物樣品分析的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法，包括步驟

(1)待測樣品經(jīng)體外的生物孵育實(shí)驗(yàn)后，生成體外的生物樣品； (2)加入終止溶劑(包括乙腈和甲醇)，終止反應(yīng)；(3)終止后的生物樣品經(jīng)過離心，取上清，經(jīng)稀釋后進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析。其中，步驟(1)中的體外的生物孵育實(shí)驗(yàn)，包括肝微粒體代謝穩(wěn)定性的孵育實(shí)驗(yàn)、血漿蛋白結(jié)合的孵育實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞滲透性的孵育實(shí)驗(yàn)、肝細(xì)胞代謝穩(wěn)定性的孵育實(shí)驗(yàn)、待測樣品間相互作用的生物孵育實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明中的關(guān)于分析方法的建立過程中，涉及多個方面，包括1)挑選內(nèi)標(biāo)，對多個穩(wěn)定的化合物進(jìn)行方法考察優(yōu)化其質(zhì)譜參數(shù)并建立方法優(yōu)化的模板，將選定的內(nèi)標(biāo)化合物參數(shù)增加到數(shù)據(jù)庫中備用；2)根據(jù)需要建立不同的LC-MS/MS的方法模板；3)化合物質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，應(yīng)用自動化軟件完成批量化合物的方法優(yōu)化；4)質(zhì)譜方法的建立，從數(shù)據(jù)庫中選擇目標(biāo)化合物的名稱并同時選擇一個或多個內(nèi)標(biāo)按照一定的模板批次導(dǎo)出化合物完整的LC-MS/MS的方法；5)用已經(jīng)生成的方法對低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行靈敏度考察同時進(jìn)行方法的進(jìn)一步優(yōu)化，包括流動相的優(yōu)化，液相條件的優(yōu)化；6)電子脈沖裝置的應(yīng)用幫助改善殘留對化合物分析的影響。本發(fā)明具有高靈敏、高選擇性、高通量等優(yōu)點(diǎn)，因此，能廣泛應(yīng)用于藥物的高通量篩選及生物樣品的分析。通過利用本發(fā)明的方法能夠大大地節(jié)約分析時間，提高儀器使用率，節(jié)約人力等方面的成本，從而也為在新藥篩選階段節(jié)約了大量的時間，加快了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。


下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明圖1是杰爾森_高效液相色譜_質(zhì)譜串聯(lián)系統(tǒng)連接示意圖；圖2是洗閥裝置結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例中的用于藥物篩選及生物樣品分析的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS) 分析系統(tǒng)，其系統(tǒng)連接圖如圖1所示，具體包括日本島津高效液相色譜儀LC 20 AD (Shimadzu Inc)，本實(shí)施例中色譜柱為3cm長的型號為Synergi Hydro-RP(Phenomenex. Inc)的C18反相色譜柱；日本島津高效液相色譜儀，該系統(tǒng)為二元泵色譜，它的特點(diǎn)在于與質(zhì)譜兼容性好，操作簡便并且液相泵速度比較快，主要作用為快速提供梯度的液相變化；API 4000質(zhì)譜儀(Applied Biosystems Inc)，該質(zhì)譜儀設(shè)備是分析器，其掃描速度快，能夠與本實(shí)施例中的自動進(jìn)樣器的快速進(jìn)樣匹配，靈敏度高，選擇性強(qiáng)；Gilson(杰爾森)自動進(jìn)樣器，用于調(diào)整脈沖進(jìn)樣體積，優(yōu)化脈沖進(jìn)樣方式，確保樣品分析的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度以及精密度；而Gilson自動進(jìn)樣器的特點(diǎn)是進(jìn)樣速度快，延遲時間短，可容納12塊384或96孔板；本實(shí)施例中選用Gilson 235自動進(jìn)樣器；電子脈沖裝置，用于反沖進(jìn)樣閥，輔助完成洗針過程，從而降低分析物殘留；本實(shí)施例中選用電子脈沖反沖閥(即洗閥裝置，如圖2所示)，其組成部分有220V電源、交流適配器、中間繼電器、時間繼電器、計量泵和杰爾森限位開關(guān)六部分組成；其連接關(guān)系為 Gilson限位開關(guān)接中間繼電器；中間繼電器和時間繼電器接220V電源；中間繼電器和計量泵接24V直流電源；計量泵接中間繼電器和時間繼電器；電子脈沖反沖閥的運(yùn)作原理是外部限位開關(guān)給中間繼電器一個12V信號，中間繼電器開始工作；利用中間繼電器常開狀態(tài)供給時間繼電器220V電源，時間繼電器開始工作；通過調(diào)節(jié)可使時間繼電器在規(guī)定時間內(nèi)閉合和斷開其控制線路的頻率；線路開閉控制計量泵工作；數(shù)據(jù)自動處理模塊，是以DiscoveryQuant 2. O 和 Microsoft Excel VBA (MicrosoftCorporati on)為基礎(chǔ)設(shè)計的數(shù)據(jù)處理模塊，用于經(jīng)高效液相色譜儀和質(zhì)譜儀分析得到的批量數(shù)據(jù)，通過運(yùn)用宏來完成自動化處理，提供工作效率；其 ψ, DiscoveryQuant 2. O 包括 DiscoveryQuant-Optimize 禾口 DiscoveryQuant-Analyze(Applied Biosystems Inc.)。 DiscoveryQuant 2·O 設(shè)置 于分析軟件 Analyst 1. 4. 2 (Applied Biosystems Inc.)內(nèi)；VBA 設(shè)置于 Microsoft Excel (Microsoft Corporation)內(nèi)。利用上述系統(tǒng)，對生物樣品進(jìn)行分析，具體方法如下一、待分析的生物樣品1)肝微粒體代謝穩(wěn)定性生物樣品采用不同種屬的肝微粒體(人、大鼠、狗、猴)， 在體外模擬藥物在肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性情況。該反應(yīng)體系中含有100毫摩爾磷酸鉀緩沖鹽，1毫摩爾氯化鎂，1毫摩爾NADP，6毫摩爾異檸檬酸和1單位異檸檬酸脫氫酶，微粒體濃度為0. 7毫克每毫升，孵育溫度為37°C， 底物濃度為1微摩爾，該實(shí)驗(yàn)中的底物有睪丸留酮(testosterone，由Merck公司提供)，普羅帕酮(Propafenone，購買于Sigma)，雙氯芬酸(Diclofenac，購買于Sigma)，這三種化合物分別是肝P450酶中的3A4、2D6和2C9的底物；孵育時間分別為0、5、10、20、30、60分鐘， 到達(dá)每一時間點(diǎn)立即加入3倍體積的含有內(nèi)標(biāo)甲苯磺丁脲的冷甲醇或乙腈終止該反應(yīng)，收集不同時間點(diǎn)的樣品后，在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心大約20分鐘，取50微升上清后用150微升 0. 甲酸水或50%甲醇水稀釋。2)血漿蛋白結(jié)合生物樣品采用不同種屬的血漿(人、大鼠、狗、猴)考察藥物與血漿蛋白的結(jié)合情況；將華法靈(購買于Sigma)加入到超濾管的血漿中配制成2微摩爾，在37°C條件下經(jīng)過兩小時的超濾，分別取出超濾過后的結(jié)合血漿樣品和游離緩沖液樣品，在兩種不同基質(zhì)樣品中加入等體積不同空白基質(zhì)匹配后，分別加入2倍體積的含有內(nèi)標(biāo)甲苯磺丁脲的冷甲醇或乙腈沉淀蛋白，在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心大約20分鐘，取50微升上清后用150微升 0. 甲酸水或50%甲醇水稀釋。 3)細(xì)胞滲透性生物樣品采用不同的細(xì)胞模型如MDCK-MDR1，Caco-2等考察化合物腸道的吸收以快速篩選口服藥物，其中MDCK(Madin-Darby canine kidney)細(xì)胞系為馬丁達(dá)比犬腎上皮細(xì)胞發(fā)展的一種細(xì)胞間連接非常緊密的細(xì)胞系，低水平表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，低代謝活性。MDCK細(xì)胞是在遺傳學(xué)方面及細(xì)胞的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)組成方面最為理想的上皮細(xì)胞系。MDRl是一種膜蛋白，最主要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體，在藥物的吸收、排泄及代謝，起著至關(guān)重要的作用。它可以保護(hù)細(xì)胞免受外來毒性物質(zhì)侵害。將哺乳動物腫瘤細(xì)胞暴露在一種細(xì)胞毒類藥物中一段時間后，這些細(xì)胞可通過降低胞內(nèi)藥物濃度而對一系列的藥物產(chǎn)生抗性。 將MDRl基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到MDCK細(xì)胞后，建立細(xì)胞模型用于研究MDRl與藥物的相互作用； Caco-2細(xì)胞系來源于人類結(jié)腸和直腸癌細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)和生化特點(diǎn)類似于人類小腸上皮細(xì)胞，細(xì)胞在生長至融合后有柱狀突起，類似小腸絨毛，并且含有小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶。 目前，Caco-2已經(jīng)廣泛應(yīng)用于新藥的篩選與開發(fā)、藥物腸吸收機(jī)制以及體外代謝模型的研究。關(guān)于Caco-2細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)主要通過測定電阻值(TEER)對模型進(jìn)行評價。3. 1)MDCK-MDR1 實(shí)驗(yàn)步驟3. 1. 1)細(xì)胞準(zhǔn)備將MDR1-MDCK 細(xì)胞終于 BD 96-well Insert 板中，密度為 2X 105cells/cm2。然后于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6天，即可用于滲透性實(shí)驗(yàn)。3. 1. 2)配藥步驟1 將化合物非諾特羅(fenoterol，購自Sigma Aldrich)、普萘洛爾 (propanolol，購自 Sigma Aldrich)和地高辛(Digoxin，購自 Sigma Aldrich)用 DMSO稀釋成0. 5mM的母液。步驟2 然后將化合物(0. 5mM)用溫浴到37攝氏度的HBSS溶液稀釋到反應(yīng)終濃度 2uM。步驟3 將反應(yīng)溶液于37攝氏度的水浴中預(yù)熱1小時。3. 1. 3)滲透性實(shí)驗(yàn)時間點(diǎn)-.2. 5小時；孵育條件溫度37攝氏度；5%的二氧化碳；濕度95%給藥濃度2uM3. 1. 4)樣品收集收集50 μ L的溶液包括給藥孔，接收孔，細(xì)胞裂解液及初始給藥溶液與新的96孔分析板中，再加入100 μ L的HBSS溶液和250 μ L的含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液，封板并充分混合； 4000rpm離心20分鐘，取上清加入1倍體積的水稀釋，封板；LC-MS檢測。3. 2) Caco-2 實(shí)驗(yàn)步驟3. 2. 1)細(xì)胞準(zhǔn)備將Caco-2 細(xì)胞終于 BD 96-well Insert 板中，密度為 1 X 105cells/cm2。然后于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21-28天，每兩天更換培養(yǎng)液即可用于滲透性實(shí)驗(yàn)。3. 2. 2)配藥步驟1 將化合物阿替洛爾(Atenolol，購自Sigma Aldrich)、普萘洛爾(propanolol，購自 Sigma Aldrich)和地高辛(Digoxin，購自 Sigma Aldrich)用 DMSO稀釋成0. 2mM的母液。步驟2 然后將化合物(0. 2mM)用溫浴到37攝氏度的HBSS溶液稀釋到反應(yīng)終濃度 2uM。步驟3 將反應(yīng)溶液于37攝氏度的水浴中預(yù)熱1小時。3. 2. 3)滲透性實(shí)驗(yàn)時間點(diǎn)2小時；孵育條件溫度37攝氏度、5%的二氧化碳、濕度95%;給藥濃度 2uM3. 2. 4)樣品收集 收集50 μ L的溶液包括給藥孔，接收孔，細(xì)胞裂解液及初始給藥溶液與新的96孔分析板中，再加入100 μ L的HBSS溶液和250 μ L的含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液，封板并充分混合。然后4000rpm離心20分鐘，取上清加入1倍體積的水稀釋，封板；LC-MS檢測。4)肝細(xì)胞代謝穩(wěn)定性生物樣品采用離體方法考察化合物在不同種屬的肝細(xì)胞 (人、大鼠、狗、猴)中的代謝穩(wěn)定性情況。配制5 X化合物將化合物七-乙氧基香豆素(7-Ethoxycoumarin，Sigma Aldrich 購買)，七羥基香豆素(7-Hydroxycoumarin，F(xiàn)luka 購買)，戊脈安(Verapamil，Sigma Aldrich購買)，睪丸激素(Testosterone，Tokyo購買)用DMSO稀釋成3mM的母液。分步稀釋用50%甲醇-水溶液將化合物(3mM母液)稀釋到150uM。然后將化合物(150uM)用溫浴到37攝氏度的威廉姆斯培養(yǎng)基稀釋到30uM。最后將化合物(30uM)用威廉姆斯培養(yǎng)基稀釋到反應(yīng)終濃度15uM。配制IX IO6ceIlsAiL細(xì)胞懸浮液細(xì)胞從液氮罐中拿出，放入37度水浴孵育解凍，不超過90秒，待細(xì)胞化成小冰球后加入孵育到37度的威廉姆斯培養(yǎng)液將細(xì)胞混勻，計數(shù)，如細(xì)胞活率超過70%，直接進(jìn)行反應(yīng)。如細(xì)胞活率低于70%，則需要用Percoll梯度離心法富集活細(xì)胞。計數(shù)，將細(xì)胞用威廉姆斯培養(yǎng)基稀釋到反應(yīng)體系濃度為1. 25X IO6Cells/ mL的細(xì)胞懸浮液。時間點(diǎn)反應(yīng)將細(xì)胞與化合物按4 1的混合到孵育板中，將加好細(xì)胞的孵育板放入孵箱中開始計時，按時間點(diǎn)0，5，10，20，40，80分鐘記錄時間，孵育條件37攝氏度、5%的二氧化碳、濕度95%。終止反應(yīng)到時間點(diǎn)后，將孵育板從孵箱中取出，加入2-3倍體積的含有內(nèi)標(biāo)的乙腈或者甲醇終止反應(yīng)，搖板10分鐘，4000rpm離心20分鐘，取上清加入2_3倍體積的0. 1 % 甲酸水稀釋，封板，在搖板機(jī)上搖10分鐘后LC/MS/MS檢測。5)藥物之間相互作用生物樣品細(xì)胞色素P450酶家族存在很多種酶，每種酶都存在特定的底物，特定的酶可以將底物代謝成相應(yīng)的代謝物。實(shí) ^t 貞 M 5 ^ 1 /β ^ (Phenacetin, diclofenac, S-mephenytoin, dextromethorphan，Midazolam)，將待測藥物和底物，NADPH，微粒體混合，反應(yīng)體積200 μ L， 37攝氏度條件下孵育10分鐘，加入200 μ L含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液終止反應(yīng)；4000rpm離心20 分鐘，取上清后用加一倍體積的水稀釋，LC/MS/MS檢測代謝產(chǎn)物。二、分析過程儀器和試劑
1)質(zhì)譜儀API 4000 (Applied Biosystems Inc.)2)高效液相色譜儀日本島津高效液相色譜儀LC 20 AD(Shimadzu Inc.)3)Gilson自動進(jìn)樣器Gilson 235自動進(jìn)樣器(Gilson Inc. ) ；CTC自動進(jìn)樣器 (AgilentTechnologies 公司的 CTC PAL)4) 3cm 色譜柱Synergi Hydro-RP, C18,80A, 4 μ m, 2. 1 X 30mm(Phenomenex Inc.)5) 96 孑L板(Axygen Inc.)6)乙B青(Merck Inc.)7)甲醇(Merck Inc.)8)甲酸(Fluka Inc.)9)醋酸銨(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)實(shí)驗(yàn)過程高效液相色譜儀條件流動相A :0. 1 %甲酸水，流動相B :0. 1 %甲酸乙腈；或流動相A 2毫摩爾的醋酸銨水，流動相B 100%乙腈進(jìn)樣體積20微升 液相梯度流速1.00毫升/分鐘
Time (min)A (%)B (%)
οΓο 982
0. 25298
0. 35298
0. 36982
0. 50 System ControllerStop質(zhì)譜檢測條件離子源類型ESI (電噴霧離子源)掃描模式MRM(+)(正離子下的多反應(yīng)監(jiān)測模式)質(zhì)譜參數(shù)氣簾氣20 ；霧化氣50 ；加熱氣60 ；離子源溫度550°C ；ihe on ；CAD 8 ； 噴霧電壓5500;CXP 12或掃描模式MRM(_)(負(fù)離子下的多反應(yīng)監(jiān)測模式)質(zhì)譜參數(shù)氣簾氣20 ；霧化氣55 ；加熱氣60 ；離子源溫度600°C ；ihe on ；CAD 8 ； 噴霧電壓-4500 ； CXP-61)樣品產(chǎn)生上述五種生物樣品產(chǎn)生后，經(jīng)過離心，取上清后用合適比例的稀釋液稀釋，稀釋液作為最終樣品可以經(jīng)LC-MS/MS監(jiān)測。2)樣品檢測采用兩套方案對相同樣品進(jìn)行檢測分析并比較結(jié)果以及方法上的差異。第一套方案采用杰爾森自動進(jìn)樣器與島津液相色譜儀以及質(zhì)譜儀串聯(lián)檢測，具體步驟為第一步，采用VBA進(jìn)行樣品進(jìn)樣Batch編輯，只需輸入每塊樣品板上相關(guān)位置的化合物信息，程序自動生成所需Batch ；第二步，采用DiscoveryQuant-Optimize自動找出化合物的質(zhì)譜分析方法(Ql/ Q3 ；Ql為一級質(zhì)譜掃描，其主要目的是找出特征母離子；Q3為二級質(zhì)譜掃描，主要目的是掃描特征碎片離子)；第三步，采用DiscoveryQuant-Analyze批量建立液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法(采用 MRM掃描方式進(jìn)行監(jiān)測)，杰爾森自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，由質(zhì)譜監(jiān)測。待樣品檢測完畢，得到所需數(shù)據(jù)。第二套方案采用CTC自動進(jìn)樣器與島津高校液相色譜儀以及質(zhì)譜串聯(lián)檢測，具體步驟與第一套方案相同，但兩者所使用的LC-MS/MS方法不一樣。3)數(shù)據(jù)處理經(jīng)高效液相色譜儀和質(zhì)譜儀分析得到的批量數(shù)據(jù)用 DiscoveryQuant-Analyze處理結(jié)果并導(dǎo)出數(shù)據(jù)；并將數(shù)據(jù)拷入數(shù)據(jù)自動處理模塊中的數(shù)據(jù)分析模板，經(jīng)過VBA篩選判斷相同時 間點(diǎn)的平行性樣品之間數(shù)據(jù)是否平行(偏差不超過 20% )，是否有未積分的樣品等進(jìn)行標(biāo)注和判斷，最終得到報告所需數(shù)據(jù)。三、分析結(jié)果對于上述生物樣品，采用兩套分析方案所得數(shù)據(jù)結(jié)果相近，但每一個樣品所需的分析時間存在一定的差異，具體比較結(jié)果如表1所示，在肝微粒體以及肝細(xì)胞代謝穩(wěn)定性試驗(yàn)以及細(xì)胞滲透性實(shí)驗(yàn)中，使用杰爾森-高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)系統(tǒng)比使用CTC自動進(jìn)樣器-高效液相系統(tǒng)-質(zhì)譜串聯(lián)系統(tǒng)每-個樣品所需時間從96秒縮短到40秒，效率提高了 58% ；此外，該效率的提高還體現(xiàn)在了血漿蛋白結(jié)合以及藥物之間相互作用的試驗(yàn)中， 分別提高了 22%和50%。表1生物樣品的分析結(jié)果
CTC上每針““Gilson上每
改進(jìn)后節(jié)約效率提高
生物樣品樣品所需時針樣品所需
的時間(s)(%)
間(S)時間(S)
肝微粒體代謝穩(wěn)定性96405658
^肝細(xì)胞代謝穩(wěn)定性96405658
血菜蛋白結(jié)合1381083022
細(xì)胞滲透性96405658
藥物之間相互作用180909050應(yīng)用本發(fā)明的系統(tǒng)對不同類型的體外生物樣品進(jìn)行測試的結(jié)果表明該系統(tǒng)的適用范圍可以擴(kuò)大到體外生物樣品分析的試驗(yàn)中。本實(shí)施例中，通過提高杰爾森進(jìn)樣速度減少延遲時間，同時外加電子脈沖反沖閥對進(jìn)樣閥與進(jìn)樣針進(jìn)行反復(fù)沖洗，采用2 3cm長度的色譜柱以及液相梯度洗脫，在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件的基 礎(chǔ)上進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)了低成本高效率的轉(zhuǎn)換。
權(quán)利要求
1.一種用于藥物篩選及生物樣品分析的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析系統(tǒng)，包括高效液相色譜儀、質(zhì)譜儀，其特征在于還包括脈沖進(jìn)樣器，用于調(diào)整脈沖進(jìn)樣體積，確保樣品分析的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度以及精密度；電子脈沖裝置，用于反沖進(jìn)樣閥，輔助完成洗針過程；數(shù)據(jù)自動處理模塊，用于經(jīng)高效液相色譜儀和質(zhì)譜儀分析得到的批量數(shù)據(jù)，通過運(yùn)用宏來完成自動化處理。
2.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于所述高效液相色譜儀為日本島津高效液相色譜儀；質(zhì)譜儀為API4000質(zhì)譜儀。
3.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于所述高效液相色譜儀中，色譜柱為2 3cm 長的反相C18色譜柱。
4.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于所述脈沖進(jìn)樣器為Gilson自動進(jìn)樣器。
5.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于所述電子脈沖裝置為電子脈沖反沖閥，其組成部分包括220V電源、交流適配器、中間繼電器、時間繼電器、計量泵和杰爾森限位開關(guān)； 其連接關(guān)系為杰爾森限位開關(guān)接中間繼電器沖間繼電器和時間繼電器接220V電源沖間繼電器和計量泵接24V直流電源；計量泵接中間繼電器和時間繼電器。
6.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于所述數(shù)據(jù)自動處理模塊為以 DiscoveryQuant2. O和Microsoft Excel VBA為基礎(chǔ)設(shè)計的數(shù)據(jù)處理模塊；其中，DiscoveryQuant 2. O 包括 DiscoveryQuant-Optimize 禾口 DiscoveryQuant-Analyze0
7.如權(quán)利要求1所述的用于藥物篩選及生物樣品分析的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法，包括步驟(1)待測樣品經(jīng)體外的生物孵育實(shí)驗(yàn)后，生成體外的生物樣品；(2)加入終止溶劑，終止反應(yīng)；(3)終止后的生物樣品經(jīng)過離心，取上清，經(jīng)稀釋后進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析。
8.如權(quán)利要求7所述的分析方法，其特征在于所述步驟(1)中的體外的生物孵育實(shí)驗(yàn)，包括肝微粒體代謝穩(wěn)定性的孵育實(shí)驗(yàn)、血漿蛋白結(jié)合的孵育實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞滲透性的孵育實(shí)驗(yàn)、肝細(xì)胞代謝穩(wěn)定性的孵育實(shí)驗(yàn)、待測樣品間相互作用的生物孵育實(shí)驗(yàn)。
9.如權(quán)利要求7所述的分析方法，其特征在于所述步驟(2)中的終止溶劑，包括乙腈、甲醇。
10.如權(quán)利要求7所述的分析方法，其特征在于所述步驟(3)中，高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析的步驟，包括(1)采用MicrosoftExcel VBA進(jìn)行樣品進(jìn)樣Batch編輯；(2)采用DiscoveryQuant-Optimize自動找出化合物的質(zhì)譜分析方法；(3)采用DiscoveryQuant-Analyze批量建立質(zhì)譜和液相進(jìn)樣方法，系統(tǒng)進(jìn)樣，由質(zhì)譜監(jiān)測；(4)待測樣品檢測完畢后，所得數(shù)據(jù)經(jīng)DiscoveryQuant-Analyze處理后，并拷入數(shù)據(jù)自動處理模塊的數(shù)據(jù)分析模板，經(jīng)Microsoft Excel VBA篩選和判斷，最終得到所需數(shù)據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析系統(tǒng)及其分析法，該系統(tǒng)包括高效液相色譜儀、質(zhì)譜儀、脈沖進(jìn)樣器、電子脈沖裝置、數(shù)據(jù)自動處理模塊；其分析方法，包括(1)待測樣品經(jīng)體外的生物孵育實(shí)驗(yàn)后，生成體外的生物樣品；(2)加入終止溶劑，終止反應(yīng)；(3)終止后的生物樣品經(jīng)過離心，取上清，經(jīng)稀釋后進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析。本發(fā)明能夠大大地節(jié)約分析時間，提高儀器使用率，節(jié)約人力等方面的成本，從而也為在新藥篩選階段節(jié)約了大量的時間，加快了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。
文檔編號G01N30/02GK102253141SQ20111017257
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月24日
發(fā)明者馮萬勇, 李勇 申請人:上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司