酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法，能夠低成本、高效準確的檢測水體環(huán)境中酚類化合物。該檢測方法包括：制備酪氨酸酶生物傳感器，在玻碳電極的檢測端表面沉積有聚硫堇分子，聚硫堇分子外表面偶聯(lián)一層戊二醛薄膜，在戊二醛薄膜外側(cè)鍵合酪氨酸酶分子；檢測溶液中酚類化合物，以酪氨酸酶生物傳感器作為工作電極，銀/氯化銀作為參比電極，鉑電極作為對電極，根據(jù)酚類化合物濃度與還原電流的線性回歸方程，測定待測溶液中的酚類化合物的種類和含量。本發(fā)明與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比，成本低廉、操作簡單、響應速度快、檢測精度高、抗干擾性強。
【專利說明】酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測酚類化合物的方法，特別是一種酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中 酚類化合物的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 酚類化合物是環(huán)境中廣泛存在的一類有機污染物，主要來自化工、醫(yī)藥、煉焦等工 業(yè)排放及農(nóng)藥降解，威脅人類用水安全。隨著人們對環(huán)境安全意識的逐步提高，迫切要求快 速準確測量地表水及飲用水的安全狀況。目前對于酚類有機污染物的主要測定方法有色譜 法、紫外分光光度法、流動注射分析法等。但這些方法都存在著儀器昂貴、樣品預處理、操作 過程復雜、分析周期長以及對工作人員的操作水平要求高等缺點，難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，無法滿 足環(huán)境中酚類化合物的準確快速檢測的要求。
[0003] 生物傳感器是基于生物組分對底物進行專一的識別，通過信號傳導器將產(chǎn)生的信 號以光、電等形式傳遞出來，通過信號大小定量檢測底物的一項新技術(shù)。運用生物傳感器來 檢測環(huán)境中的有機污染物、重金屬、病菌微生物具有專一性強、靈敏度高、樣品量少、成本低 廉的特點，因此成為環(huán)境保護研究中的一個熱點課題。
[0004] 酪氨酸酶是一種具有生物催化活性的蛋白質(zhì)，在生物體外容易失去活性，在生物 傳感器應用中，生物酶需要被固定在一個基板上以實現(xiàn)直接電子傳遞或者增大表面積以達 到效率放大作用。利用各種固定方法將生物敏感元件固定于基板表面并保持活性是生物傳 感器發(fā)展的重要方向。目前許多酪氨酸酶傳感器普遍存在的問題是制備方法復雜、成本高、 操作和存儲穩(wěn)定性不夠高等。
[0005] 查閱相關專利文獻，公開（公告）號：102854233A，公開了一種"基于修飾電極的酪 氨酸酶生物傳感器及其制備方法和應用"，通過在玻碳電極表面沉積納米金粒子，之后吸附 L-賴氨酸薄膜，在L-賴氨酸薄膜上加載有序介孔碳載納米金，最后吸附酪氨酸酶。制備過 程中所使用的納米金材料昂貴，制備過程復雜，并且酪氨酸酶的用量為〇. 〇5mg/ μ L-0. Img/ UL，生產(chǎn)成本很高。公開（公告）號：102928488Α，公開了一種"酶電化學生物傳感器檢測 水體環(huán)境中酚類化合物的方法"，利用親水性離子液體與介孔碳制備復合材料，再將酪氨酸 酶加入到復合材料中制備酪氨酸酶工作電極。介孔碳材料的制備過程復雜，需要使用濃硫 酸，并且制備過程中需要升溫750-950度，使用有機溶劑，易造成環(huán)境污染，酪氨酸酶的用 量為2. 5-20mg/mL，生產(chǎn)成本較高。公開（公告）號：103278541Α公開了一種"用于檢測雙 酚A的電化學生物傳感器及其制備方法和應用"，使用石墨烯/金復合物以及殼聚糖來修飾 固定酪氨酸酶電極，使用的石墨烯及金等材料價格昂貴，其中氧化石墨烯的制備過程復雜， 需要多種有機及無機試劑，并且使用酪氨酸酶的濃度為4. 5mg/mL。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法，能夠低成 本、高效準確的檢測水體環(huán)境中酚類化合物。
[0007] 本發(fā)明提供的酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法包括以下內(nèi) 容：
[0008] 一.酪氨酸酶生物傳感器的制備
[0009] 酪氨酸酶生物傳感器包括一玻碳電極，在玻碳電極的檢測端表面沉積有聚硫堇分 子，聚硫堇分子外表面偶聯(lián)一層戊二醛薄膜，在戊二醛薄膜外側(cè)鍵合酪氨酸酶分子；
[0010] 二·檢測溶液中酚類化合物
[0011] 以酪氨酸酶生物傳感器作為工作電極，銀/氯化銀作為參比電極，鉬電極作為對 電極，建立三電極系統(tǒng)，三電極系統(tǒng)與電化學工作站連接，將工作電極的檢測端置于待測溶 液中，通過電化學工作站檢測出待測溶液中還原電流大小，然后根據(jù)酚類化合物濃度與還 原電流的線性回歸方程，測定待測溶液中的酚類化合物的種類和含量。
[0012] 所述酪氨酸酶生物傳感器的制備包括以下步驟：
[0013] a.沉積聚硫堇分子膜，在一清洗好的玻碳電極的檢測端表面用電化學方法沉積硫 堇分子，得到聚硫堇分子膜修飾電極，晾干備用；
[0014] b.偶聯(lián)戊二醛，向步驟a中制得的硫堇修飾電極上滴加配制好的戊二醛水溶液， 通過化學偶聯(lián)反應使戊二醛與玻碳電極上的硫堇共價偶聯(lián)，得到戊二醛-硫堇修飾電極；
[0015] c.固定酪氨酸酶，在步驟b中制得的戊二醛-硫堇修飾電極上滴加配制好的酪氨 酸酶溶液，通過化學偶聯(lián)反應使酪氨酸酶固定于修飾電極的戊二醛上，得到酪氨酸酶生物 傳感器。
[0016] 所述酪氨酸酶生物傳感器的制備，步驟a中，硫堇的濃度為0. lmmol/L-1. Ommol/ L，所用溶劑為Britton-Robinson緩沖溶液，包括硼酸、醋酸、磷酸和氫氧化鈉，緩沖溶液 濃度為10-lOOmM，PH值為4. 0-9. 5,掃描起始電壓為0. 4V，終止電壓為0. 4V，最高電壓為 1. IV，最低電壓為-0. 4V，掃面方向負向，掃描循環(huán)為20-100次，掃描速度為100mV/S ;所述 步驟b中的戊二醛水溶液體積百分比濃度為5-25%，用量為5 μ L-10 μ L，反應時間為15分 鐘-1小時；所述步驟c中酪氨酸酶濃度范圍為0. lmg/mL-lmg/mL，用量為5μ L-ΙΟμ L。
[0017] 所述的測定待測溶液中的酚類化合物為苯二酚，特別是對苯二酚或鄰苯二酚，待 測溶液中對苯二酚、鄰苯二酚的濃度線性檢測范圍均為5X 10_7?IX 10_4Μ。
[0018] 所述的根據(jù)酚類化合物濃度與還原電流的線性回歸方程，測定待測溶液中的酚類 化合物的含量，電流信號變化公式為：P = Ib-Ia，式中P為酚類污染物溶液處理前后電流信 號變化量；Ia為修飾后玻碳電極在空白緩沖溶液中掃描的電流；I b為酚類污染物溶液滴加 到檢測緩沖溶液后掃描的電流，對苯二酚濃度與還原電流變化的線性回歸方程為：
[0019] Phq = 67. 582-5. 46141gCHQ (1)
[0020] 式⑴中，Phq為對苯二酚檢測時電流信號變化值，單位為μ A ;CHQ為待測溶液中對 苯二酚的濃度值，單位為M ;以底物濃度為橫坐標，所對應的電流信號變化量作為縱坐標， 作校正曲線，找出校正曲線的線性范圍后，所得到相關系數(shù)R2,式（1)的相關系數(shù)為R 2 = 0. 9502,檢測下限為5X KT8M ;鄰苯二酚濃度與還原電流變化的線性回歸方程為：
[0021] Pcc = 86. 954-7. 03861gCcc (2)
[0022] 式⑵中，Prc為鄰苯二酚檢測時電流信號變化值，單位為μ A 為待測溶液中鄰 苯二酚的濃度值，單位為M ;式（2)的相關系數(shù)為R2 = 0.9751，檢測下限為1.5 X 10_8M。
[0023] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著的有益效果體現(xiàn)在：
[0024] 1.本發(fā)明的基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器采用了化學偶聯(lián)的修飾方式，具 有較好的穩(wěn)定性。首先，將硫堇溶液用電化學的方法沉積在電極表面，使玻碳表面具有伯胺 基團，然后通過戊二醛作為偶聯(lián)試劑，通過化學反應固定到玻碳電極表面，化學鍵的形成能 夠提高酶電極的操作穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性，最后通過戊二醛的另一端醛基與酪氨酸酶的伯 胺基團發(fā)生反應，將酪氨酸酶固定在玻碳電極上，因化學偶聯(lián)方法提供了穩(wěn)定的化學鍵，因 此能夠維持酪氨酸酶的高活性，使酪氨酸酶生物傳感器使用壽命更長，酪氨酸酶活性更高。 此外，本發(fā)明所使用的有機染料并不局限于吩噻嗪類染料，對于吖啶橙類染料同樣適用，具 有很好的生物兼容性，擴大了制備電極的物質(zhì)種類，電極的修飾材料更易獲得。可見，本發(fā) 明的酪氨酸酶生物傳感器充分集成了現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)手段，使組合后的生物傳感器實現(xiàn) 了各技術(shù)手段的優(yōu)勢互補、協(xié)同增效，大大提高了生物傳感器的穩(wěn)定性、重復性，提高了現(xiàn) 有生物傳感器的檢測水平。
[0025] 2.本發(fā)明的基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器可用于檢測鄰苯二酚、對苯二酚 等有機酚類污染物，由于生物傳感器上酪氨酸酶的高活性，對于鄰苯二酚、對苯二酚的氧化 能夠起到良好的催化效果，本發(fā)明的酪氨酸酶生物傳感器具有卓越的電子傳導能力，使得 每次達到穩(wěn)定響應電流的時間很短，因此，在可測定的濃度范圍內(nèi)，測定結(jié)果較理想，用于 水樣測定的響應值準確，與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比，成本低廉、操作簡單、響應速度快、 檢測精度高、抗干擾性強。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法中，酪氨酸酶生物傳感 器的制備過程示意圖。圖中編號：1.玻碳電極（GC) ;2.聚硫堇分子膜（TN) ;3.戊二醛分子 (GA) ;4.酪氨酸酶（TYR)
[0027] 圖2為酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法的檢測反應原理圖。
[0028] 圖3為酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法制得的（TN-GA-TYR/ GC)修飾電極的掃描電鏡圖。
[0029] 圖4為酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法中檢測酪氨酸酶與玻 碳電極組裝過程。圖中a為未修飾的玻碳電極在IOOmmol · T1PBS緩沖溶液中的循環(huán)伏安 (CV)曲線；b為酪氨酸酶修飾的玻碳電極的CV曲線，掃描速度為100mV/ S。
[0030] 圖5為酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法中酪氨酸酶生物傳感 器檢測時的PH值優(yōu)化圖。
[0031] 圖6為酪氨酸酶修飾電極在PBS溶液中不同掃速下掃描曲線，自上到下為100、90、 80、70、60、50、30、20、10mV/s。
[0032] 圖7為酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法中掃描速度與電流信 號相關曲線。
[0033] 圖8為酪氨酸酶生物傳感器組裝過程，圖中a為未修飾的玻碳電極在 IOOmmol · T1PBS緩沖溶液中的電化學阻抗譜圖（EIS) ;b為硫堇修飾的玻碳電極的EIS譜 圖；c為戊二醛/硫堇修飾的玻碳電極的EIS譜圖；d為酪氨酸酶/戊二醛/硫堇修飾玻碳 電極的電化學阻抗譜圖。

【具體實施方式】
[0034] 下面結(jié)合附圖用實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0035] 如圖1所示，酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法，該方法采用基 于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器，酪氨酸酶生物傳感器包括一玻碳電極1，在玻碳電極1 的檢測端表面沉積有硫堇聚合物分子膜2,硫堇聚合物分子膜2外表面吸附一層戊二醛分 子3,戊二醛分子3外層偶聯(lián)酪氨酸酶4。
[0036] -.酪氨酸酶生物傳感器的制備步驟
[0037] 1.直徑為0. 3cm的玻碳電極用粒徑分別為1 μ M、0. 3 μ M、0. 05 μ M的三氧化二鋁粉 末拋光，然后在去離子水中超聲清洗3次，每次2分鐘；
[0038] 2.在一清洗好的玻碳電極的檢測端表面用電化學方法沉積硫堇（TN)分子，具體 操作方法是：將該玻碳電極放入含有〇. lmmol/LTN的磷酸緩沖溶液中，循環(huán)伏安法掃描，初 始電位為〇. 4V，時間為50min，得到硫堇修飾電極，備用；
[0039] 3.在步驟2中制得的硫堇修飾電極的檢測端滴加配置好的5%的戊二醛水溶液， 室溫靜置放置1小時，使硫堇與戊二醛充分反應，其掃描電鏡圖如圖3所示。由圖3可知， 戊二醛已經(jīng)分布在玻碳電極的表面，驗證了戊二醛/硫堇修飾電極的固定化過程；
[0040] 4.在步驟3)中制得的戊二醛/硫堇修飾電極的檢測端滴加10 μ L的酪氨酸酶溶 液（0. lmg/mL)，室溫放置1小時，通過充分的化學偶聯(lián)反應使酪氨酸酶固定于硫堇/戊二醛 修飾電極表面，得到酪氨酸酶生物傳感器，其掃描電鏡圖如圖3所示。由圖3可知，酪氨酸 酶被固定在玻碳電極表面；
[0041] 5.將修飾后的玻碳電極放入0. Imol T1PBS溶液中攪拌清洗3次，每次5分鐘，去 除表面吸附弱的酶分子，將該酪氨酸酶生物傳感器保存于4°C條件下備用。
[0042] 二.采用酪氨酸酶生物傳感器檢測酚類化合物
[0043] 將酪氨酸酶生物傳感器作為工作電極，銀/氯化銀作為參比電極，鉬電極作為對 電極，建立三電極系統(tǒng)，將三電極系統(tǒng)與電化學工作站連接，對待測溶液中的對苯二酚、鄰 苯二酚濃度進行檢測。
[0044] 工作條件：所用的電解液為0· lmol/L的Britton-Robinson緩沖溶液（BRS)，在pH =4. 0-9. 5范圍內(nèi)測定酪氨酸酶生物傳感器對同一濃度鄰苯二酚的電流響應值，優(yōu)化結(jié)果 如圖5所示，選定pH = 6. 5為最佳pH值，因此在此pH值下，其響應電流大且穩(wěn)定。
[0045] 酪氨酸酶生物傳感器的檢測原理如下：酪氨酸酶催化氧化鄰苯二酚成鄰醌，鄰醌 在電極上得到電子，又被還原成鄰苯二酚，通過檢測還原電流的大小來定量指示待測液中 鄰苯二酚的濃度；但對苯二酚不是酪氨酸酶的直接底物，在酪氨酸酶和鄰醌的作用下形成 對醌，對醌在電極上得到電子，又被還原成鄰苯二酚，通過檢測還原電流的大小來定量指示 待測液中對苯二酚的濃度，由于對苯二酚不是酪氨酸酶的直接底物，因此，在后面檢測下限 中，鄰苯二酚的檢測下限更低。
[0046] 本發(fā)明檢測過程的主反應式如下所示：
[0047] CC+02 - o_quinone+2H20
[0048] CC+02 - benzoquinone+2H20
[0049] o-quinone (benzoquinone) +2e+2H+ - CC (HQ)
[0050] 對苯二酚濃度與還原電流變化的線性回歸方程為：
[0051] Phq = 67. 582-5. 46141gCHQ (I)
[0052] 式⑴中，Phq為對苯二酚檢測時的電流變化值，單位為μ A ;CHQ為待測溶液中對苯 二酚的濃度值，單位為M ;式（1)的相關系數(shù)為R2 = 9502,檢測下限為5X 10_8M。
[0053] 鄰苯二酚濃度與還原電流變化的線性回歸方程為：
[0054] Pcc = 86. 954-7. 03861gCcc (2)
[0055] 式⑵中，Prc鄰苯二酚檢測時的電流變化值，單位為μ A 為待測溶液中鄰苯二 酚的濃度值，單位為M ;式（1)的相關系數(shù)為R2 = 0.9751，檢測下限為1.5 X 10_8M。
[0056] 本實施例中對苯二酚、鄰苯二酚的線性范圍均為5X KT7?IX 1(Γ4Μ。
[0057] 本實施例檢測的是水樣樣品，檢測結(jié)果如下表1、表2所示，該表中原水取自鞍山 城市飲用水，C 1為原水過濾后測定的對苯二酚、鄰苯二酚的濃度，經(jīng)過過濾后加入確定濃度 的對苯二酚、鄰苯二酚，制成A、B、C、D四個水樣，四個水樣的配置濃度為C 2欄所示，而C3欄 為按照本實施例的檢測方法和檢測條件測定的濃度值。從加標回收率可以看出，本發(fā)明在 可測定的濃度范圍內(nèi)，加標回收率在95. 4% -103. 2 %之間，測定結(jié)果理想，相比傳統(tǒng)的高 效液相色譜法，本發(fā)明的檢測方法操作簡單，且不受其它污染物的干擾。
[0058] 在上述檢測方法下，對30 μ M濃度的鄰苯二酚標準溶液連續(xù)進行10次平行測定， 鄰苯二酚峰電流和遷移時間的相對標準偏差分別是為3. 2%和1. 5%。將電極保存在4°C環(huán) 境下，每5天檢測一次活性，一個月后仍然保持初始活性的90%。
[0059] 表1酪氨酸酶生物傳感器檢測水中的對苯二酚

【權(quán)利要求】
1. 一種酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法，其特征是該方法包括以下 內(nèi)容： 一. 酪氨酸酶生物傳感器的制備 酪氨酸酶生物傳感器包括一玻碳電極，在玻碳電極的檢測端表面沉積有聚硫堇分子， 聚硫堇分子外表面偶聯(lián)一層戊二醛薄膜，在戊二醛薄膜外側(cè)鍵合酪氨酸酶分子； 二. 檢測溶液中酚類化合物 以酪氨酸酶生物傳感器作為工作電極，銀/氯化銀作為參比電極，鉬電極作為對電極， 建立三電極系統(tǒng)，三電極系統(tǒng)與電化學工作站連接，將工作電極的檢測端置于待測溶液中， 通過電化學工作站檢測出待測溶液中還原電流大小，然后根據(jù)酚類化合物濃度與還原電流 的線性回歸方程，測定待測溶液中的酚類化合物的種類和含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法，其 特征是所說的酪氨酸酶生物傳感器的制備包括以下步驟： a. 沉積聚硫堇分子膜，在一清洗好的玻碳電極的檢測端表面用電化學方法沉積硫堇分 子，得到聚硫堇分子膜修飾電極，晾干備用； b. 偶聯(lián)戊二醛，向步驟a中制得的硫堇修飾電極上滴加配制好的戊二醛水溶液，通過 化學偶聯(lián)反應使戊二醛與玻碳電極上的硫堇共價偶聯(lián)，得到戊二醛-硫堇修飾電極； c. 固定酪氨酸酶，在步驟b中制得的戊二醛-硫堇修飾電極上滴加配制好的酪氨酸酶 溶液，通過化學偶聯(lián)反應使酪氨酸酶固定于修飾電極的戊二醛上，得到酪氨酸酶生物傳感 器。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法，其 特征是所述步驟a中，硫堇的濃度為0. lmmol/L-1. Ommol/L，所用溶劑為Britton-Robinson 緩沖溶液，包括硼酸、醋酸、磷酸和氫氧化鈉，緩沖溶液濃度為l〇-l〇〇mM，pH值為4. 0-9. 5， 掃描起始電壓為〇. 4V，終止電壓為0. 4V，最高電壓為1. IV，最低電壓為-0. 4V，掃面方向負 向，掃描循環(huán)為20-100次，掃描速度為100mV/S ;所述步驟b中的戊二醛水溶液體積百分比 濃度為5-25%，用量為5 y L-10 y L，反應時間為15分鐘-1小時；所述步驟c中酪氨酸酶濃 度范圍為 〇? lmg/mL-lmg/mL，用量為 5 u L-10 u L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法，其 特征是所述的測定待測溶液中的酚類化合物為苯二酚，特別是對苯二酚或鄰苯二酚，對苯 二酚和鄰苯二酚的濃度線性檢測范圍均為5X 1(T7?1 X 1(T4M。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酪氨酸酶生物傳感器檢測溶液中酚類化合物的方法，其 特征是所說的根據(jù)酚類化合物濃度與還原電流的線性回歸方程，測定待測溶液中的酚類化 合物的含量，電流信號變化公式為：P = Ib_Ia，式中P為酚類污染物溶液處理前后電流信號 變化量；Ia為修飾后玻碳電極在空白緩沖溶液中掃描的電流；Ib為酚類污染物溶液滴加到 檢測緩沖溶液后掃描的電流，對苯二酚濃度與還原電流變化的線性回歸方程為： PHQ = 67. 582-5. 46141gCHQ (1) 式（1)中，PHQ為對苯二酚檢測時電流信號變化值，單位為y A ;CHQ為待測溶液中對 苯二酚的濃度值，單位為M ;以底物濃度為橫坐標，所對應的電流信號變化值作為縱坐標， 作校正曲線，找出校正曲線的線性范圍后，所得到相關系數(shù)R2,式（1)的相關系數(shù)為R2 = 0. 9502,檢測下限為5X 1(T8M ;鄰苯二酚濃度與還原電流變化的線性回歸方程為： Pcc = 86. 954-7. 03861gCcc (2) 式（2)中，P。。為鄰苯二酚檢測時電流信號變化值，單位為U A ;C。。為待測溶液中鄰苯二 酚的濃度值，單位為M ;式（2)的相關系數(shù)為R2 = 0. 9751，檢測下限為1. 5X 10_8M。
【文檔編號】G01N27/327GK104391021SQ201410665396
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】王月, 張志強, 王翠蘋, 崔勇, 劉飛, 賈宏敏, 孟慶濤 申請人:遼寧科技大學