一株降解苯酚類化合物的菌株及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株降解苯酚類化合物的菌株及其應(yīng)用，所述的菌株分類命名為Sphingomonas paucimobilis DL?10，已于2014年3月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為：CCTCC NO：M 2014058。其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。菌株DL?10為好氧型微生物，最適生長溫度為30℃，最適生長pH為6.0，NaCl濃度高于3%時其生長即受到明顯的抑制。菌株DL?10在12 h內(nèi)可以完全降解100 mg/L的苯酚，并利用其作為唯一碳源生長，可以完全降解鄰苯二酚、對苯二酚、鄰甲基苯酚、間甲基苯酚、2,6?二甲基苯酚、3,5?二甲基苯酚、2,6?二甲基對苯二酚等苯酚類化合物降解。本發(fā)明對于工業(yè)廢水中苯酚類化合物的生物治理上具有重要的應(yīng)用價值。CCTCC NO：M201405820140303
【專利說明】
一株降解苯酚類化合物的菌株及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高效降解苯酚類化合物的菌株及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 含酚廢水的來源廣泛、成分復(fù)雜，如醫(yī)藥廢水、焦化廢水、化工及印染廢水等，廢水 中含有的高濃度酚類化合物會對微生物的生長產(chǎn)生抑制作用，從而增加生物處理的難度， 成為現(xiàn)階段國內(nèi)外含酚廢水處理技術(shù)領(lǐng)域亟待解決的一個難題。
[0003] 生物降解是農(nóng)藥在環(huán)境中的一類重要轉(zhuǎn)化過程。微生物由于大量存在于自然界、 并且具有種類繁多、繁殖迅速和對環(huán)境適應(yīng)性強等特點，在農(nóng)藥的生物降解過程中起到了 重要作用。當(dāng)前國內(nèi)研究者已分離到一些能降解酚類化合物微生物，但主要集中在苯酚的 降解，其衍生物的微生物降解情況較少。聶玉冰等分離到兩株微生物Alcaligenes faecalis TF1 和Acinetobacte calcoaceticus TF2在20h內(nèi)可以降解 110mg/L的苯酸。許甜 甜等分離到兩株微生物〇61代丨3 8口31'1'-1和5口11；[1^01]10的8 8。]1'1'-3在共代謝的情況下 48h內(nèi)可以降解500mg/L的苯酚。因此，篩選高效廣譜降解苯酚衍生物的菌株，在工業(yè)廢水的 生物治理上具有潛在的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對工業(yè)含酚廢水對生物會產(chǎn)生高毒性，而現(xiàn)有微生物對苯酚衍 生物降解量較少的問題，提供一種高效廣譜降解苯酚及其衍生物的微生物。
[0005] 為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] -株降解苯酚類化合物的菌株，所述微生物為少動鞘氨醇單胞菌，其分類命名為 Sphingomonas paucimobilis DL-10,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號 為:CCTCC Ν0:Μ 2014058,保藏日期為:2014年3月3日，保藏地址為：中國.武漢.武漢大學(xué)。
[0007] 本發(fā)明所述的菌株DL-10,其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所 不。
[0008] 本發(fā)明所述的Sphingomonas paucimobilis DL-10篩選方法:在以苯酸為唯一碳 源的無機鹽養(yǎng)基(pH 7.0)中，對含酚工業(yè)廢水中的苯酚降解菌株進行分離篩選。
[0009] 具體地，以含酚工業(yè)廢水菌群作為篩選目標(biāo)，利用含l〇〇mg/L苯酚的無機鹽培養(yǎng)基 作為介質(zhì)，連續(xù)富集馴化具有苯酚利用能力的菌株，將無機鹽培養(yǎng)基稀釋涂布至含有 100mg/L苯酚的無機鹽固體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)2-3d，挑取形態(tài)不同的苯酚類化合物降解菌株 進行劃線分離獲得純培養(yǎng)，命名為菌株DL-10,再次驗證純種微生物菌株DL-10對苯酚降解 能力，利用液相色譜檢測苯酚殘余含量。
[0010] 具體地，所述的無機鹽培養(yǎng)基是由硝酸銨1. 〇g，氯化鈉1. 〇g，磷酸二氫鉀〇. 5g，磷 酸氫二鉀1.5g，加水至1.0L配制，調(diào)節(jié)pH值至7.0，固體培養(yǎng)基加入瓊脂20.0g、121°C滅菌 20min，使用前添加終濃度100mg/L的苯酸作為碳源。
[0011] 本發(fā)明所述的Sphingomonas paucimobilis DL-10在1/3LB固體培養(yǎng)基上生長較 快，30 °C，48h可形成直徑為2mm的黃色菌落，菌落邊緣整齊，有光澤，突出，粘稠，濕潤，光滑， 不透明，菌體呈長桿狀(0· 8 X 1 ·8μηι)。Sphingomonas paucimobilis DL-10的V-P試驗、尿酶 試驗、接觸酶試驗為陽性，甲基紅試驗、檸檬酸鹽利用試驗、淀粉水解試驗、脂酶試驗、吲哚 試驗、精氨酸雙水解試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、產(chǎn)硫化氫試驗、苯丙氨酸脫氨酶 試驗為陰性，菌株DL-10生理生化鑒定的結(jié)果與鞘氨醇單胞菌屬的特征最為接近。
[0012] 具體地，所述的1/3LB培養(yǎng)基是由蛋白胨3.0g，酵母粉1.5g，氯化鈉3.0g，加水至 1.0L配制，調(diào)節(jié)pH值至7.0，固體培養(yǎng)基加入瓊脂20.0g、121°C滅菌20min。
[0013] 本發(fā)明的另一目的是構(gòu)建含有該苯酚類化合物降解菌株16S rDNA序列的克隆載 體以及含有該載體的工程菌株，在分子水平上對苯酚降解菌株進行鑒定。
[0014] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0015] 一種含有本發(fā)明所述的苯酸降解菌株Sphingomonas paucimobilis DL-10 16S rDNA序列的克隆載體。
[0016] 所述的重組克隆載體，優(yōu)選出發(fā)載體為pMD19T。
[0017] 含所述的苯酸降解菌株Sphingomonas paucimobilis DL-10 16S rDNA序列的基 因工程菌Escherich coli DH5a(pMD19T-16S)〇
[0018] 所述的基因工程菌Escherich coli DH5a構(gòu)建方法：利用引物27F:5'_ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'擴增菌株DL-10的 16S rDNA， 通過T/A克隆的方式連接至克隆載體pMD19T，構(gòu)建重組克隆載體pMD19T-16S，將其轉(zhuǎn)化到克 隆宿主菌Escherich coli DH5a獲得重組微生物Escherich coli DH5a(pMD19T-16S)，將所 獲得的重組微生物外源片段進行測序，NCBI數(shù)據(jù)庫比對該16SrDNA序列，在分子水平上將菌 株DL-10鑒定至鞘氨醇單胞菌屬。
[0019] 本發(fā)明的又一目的是提供該苯酚降解菌株在苯酚類化合物降解中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0021 ] 一株苯酸類化合物降解菌株Sphingomonas paucimobilis DL-10在廢水處理過程 中的應(yīng)用，具體步驟如下：
[0022] (1)菌株DL-10種子液培養(yǎng):從1/3LB平板上挑取菌株DL-10單菌落，分別接種于3mL 1/3LB液體培養(yǎng)基中于30°C，搖床180r · mirT1培養(yǎng)48h。然后將該菌株的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到20mL 新鮮的液體1/3LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)18Κ6000γ · mirT1離心10min，收集菌體，用滅菌的無 機鹽培養(yǎng)基洗滌一次后，制成〇〇6(Χ)γ?= 1.0的菌懸液，即種子液。
[0023] (2)菌株DL-10降解苯酚的動力學(xué):在苯酚終濃度為100mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中，按 5%接種量接入種子液，于30°(：，18(^.111^1震蕩培養(yǎng)，每隔211取樣一次，測定006()() 1?和苯酚 的殘留濃度。
[0024] (3)溫度和pH對菌株DL-10降解苯酚的影響：在苯酚終濃度為lOOmg/1的無機鹽培 養(yǎng)基中，按5 %接種量接入種子液，分別于20 °C、25 °C、30 °C、37 °C、42 °C，pH 7 · 0，180r · min-1 震蕩培養(yǎng);分別于初始pH 4.0、6.0、7.0、8.0、10.0，30°C、180r · mirT1震蕩培養(yǎng)，測定溫度和 pH對菌株DL-10降解苯酚的影響。
[0025] (4)底物初始濃度和接種量對菌株DL-10降解苯酚的影響：在苯酚終濃度為100mg/ L的無機鹽培養(yǎng)基中，分別按1%、3%、5%、10%的接種量接入種子液于30°C，180r · mirT1震 蕩培養(yǎng);分別在苯酸終濃度為5011^凡、10011^凡、20011^凡、30011^凡、40011^凡、50011^凡的無機 鹽培養(yǎng)基中，按5%接種量接入種子液，于30°(：，18(^*1^1^震蕩培養(yǎng)，測定底物初始濃度和 接種量對菌株DL-10降解苯酚的影響。
[0026] (5)菌株DL-10對苯酚類化合物的降解能力測定:分別在終濃度為lOOmg/1的含苯 酚，鄰苯二酚，對苯二酚，鄰甲基苯酚，間甲基苯酚，3,5_二甲基苯酚，3,4_二甲基苯酚，2,6_ 二甲基苯酚的無機鹽培養(yǎng)基中，按5%接種量接入種子液，于30°C，180r · mirT1震蕩培養(yǎng)，測 定菌株DL-10對苯酸類化合物的降解能力。
[0027] 將苯酚、鄰苯二酚、對苯二酚、鄰甲基苯酚、間甲基苯酚、對甲基苯酚、2,6-二甲基 苯酚、3，5-二甲基苯酚等苯酚類化合物等濃度混合，終濃度達到500m g//L作為菌株DL-10降 解底物，接種量10 %，于30°C，180r · min-1震蕩培養(yǎng)48h后，測定菌株DL-10對苯酚類化合物 混合物的降解能力。
[0028] 本發(fā)明以化工廢水為分離材料，分離純化到一株可以高效廣譜的降解酚類衍生物 的微生物，對降解基因資源的開發(fā)利用和工業(yè)廢水修復(fù)非常具有現(xiàn)實意義。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，該菌株對苯酸類的降解是高效，對500mg/L苯酸類混合物在48h 降解率達到80%以上，降解明顯高于現(xiàn)在國內(nèi)的苯酚降解菌。此外，該菌株對苯酚類的降解 是廣譜的，它可以降解鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚等苯二酚，也可以降解鄰甲基苯酚、間 甲基苯酚等單甲基苯酚類化合物，還可以降解3，5-二甲基苯酚、2，6-二甲基苯酚、2，6-二甲 基對苯二酚等二甲基苯酚類化合物，降解譜有豐富的多樣性，適合應(yīng)用在工業(yè)廢水的生物 治理上。
【附圖說明】
[0030]圖1是菌株DL-10降解苯酚效果圖。
[0031]圖2是菌株DL-10的電鏡圖片。
[0032]圖3a是溫度對菌株DL-10生長的影響示意圖。
[0033]圖3b是pH值對菌株DL-10生長的影響示意圖。
[0034]圖3c是裝液量對菌株DL-10生長的影響示意圖。
[0035]圖3d是鹽濃度對菌株DL-10生長的影響示意圖。
[0036]圖4是苯酚降解曲線及菌株DL-10生長曲線。
[0037]圖5a是溫度對菌株DL-10降解苯酚的影響示意圖。
[0038]圖5b是pH值對菌株DL-10降解苯酚的影響示意圖。
[0039]圖5c是底物初始濃度對菌株DL-10降解苯酚的影響示意圖。
[0040]圖5d是接種量對菌株DL-10降解苯酚的影響示意圖。
[0041 ]圖5e是金屬離子對菌株DL-10降解苯酚的影響示意圖。
[0042] 本發(fā)明所述的生物材料，其分類命名為Sphingomonas paucimobilis DL-10,已保 藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC)，保藏編號為：CCTCC NO:M2014058，保藏日期 為:2014年3月3日，保藏地址為：中國.武漢.武漢大學(xué)。
【具體實施方式】
[0043] 下面結(jié)合【附圖說明】和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步描述，但不應(yīng)視為 對本發(fā)明保護范圍的限制。下述的實施例中所使用的實驗方法無特殊說明均為常規(guī)方法。 下述的實施例中所使用的實驗試劑耗材等無特殊說明均可從商業(yè)用途購買。
[0044] 實施例1
[0045] 苯酸降解菌株Sphingomonas paucimobilis DL-10的分離篩選：
[0046] 取5mL含酸工業(yè)廢水樣品置于100mL含50mg/L苯酸的無機鹽培養(yǎng)基中，于30°C、 180r · mirT1培養(yǎng)2-3d。用紫外掃描儀測定富集液對苯酸的降解情況，確定苯酸被降解后，以 10%的接種量接入到含75mg/L苯酚無機鹽培養(yǎng)基中，繼續(xù)富集并測定降解情況，按此方法 直至苯酚濃度提高至200mg/L，并傳代3次。
[0047]將苯酚富集液經(jīng)梯度稀釋后涂布以100mg/L苯酚為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基平板 上，于30°C培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2-3d。將平板上長出的菌落形態(tài)不同的單菌落分別劃線于1/ 3LB平板純化，并接種于以50mg/L苯酸為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，于30°C、180r · mirT1 搖床培養(yǎng)2d后，取2mL樣品離心收集上清，在波長200-350nm范圍內(nèi)進行紫外掃描，苯酚最大 吸收峰為240nm和280nm，根據(jù)特征吸收峰的變化情況來確定富集液和菌株對苯酚的降解能 力。如圖1所示，通過紫外掃描發(fā)現(xiàn)，編號為DL-10的菌株可以使苯酚的紫外吸收圖譜消失。 [0048]上述無機鹽培養(yǎng)基是由硝酸銨1.0g，氯化鈉1.0g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀 1.5g，加水至1.0L配制，調(diào)節(jié)pH值至7.0，固體培養(yǎng)基加入瓊脂20.0g、121°C滅菌20min，使用 前添加苯酚作為碳源。
[0049] 上述1/3LB培養(yǎng)基是由蛋白胨3.0g，酵母粉1.5g，氯化鈉3.0g，加水至1.0L配制，調(diào) 節(jié)pH值至7.0，固體培養(yǎng)基加入瓊脂20.0g、121°C滅菌20min。
[0050]將DL-10降解苯酚前后的培養(yǎng)液冷凍干燥后用2mL的甲醇溶解，過0.22um有機濾 膜，樣品用于高效液相色譜檢測（HPLC)。未接菌的對照培養(yǎng)液中苯酚的保留時間為 3.97min，而接種菌株DL-10并培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)液中苯酚的含量明顯下降，但是苯酚開環(huán)后 的產(chǎn)物極容易降解，不會形成累積，所以沒有檢測到中間代謝產(chǎn)物。
[0051 ] 實施例2
[0052] 苯酸降解菌株Sphingomonas paucimobilis DL-10的鑒定及其生長特性：
[0053] DL-10 的鑒定：
[0054] 對DL-10進行 16S rDNA鑒定：利用引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 1492R: 5' -TACCTTGTTACGACTT-3'擴增菌株DL-10的16S rDNA，通過T/A克隆的方式連接至克 隆載體PMD19T，構(gòu)建重組克隆載體pMD19T-16S，將其轉(zhuǎn)化到克隆宿主菌Escherich coli DH5a獲得重組微生物Escherich coli DH5a(pMD19T_16S)，將所獲得的重組微生物外源片 段進行測序，NCBI數(shù)據(jù)庫比對該16S rDNA序列，在分子水平上將菌株DL-10鑒定至鞘氨醇單 胞菌屬，其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0055] DL-10的生長特性：
[0056] Sphingomonas paucimobilis DL-10在LB平板上生長較慢，30°C，96h可形成直徑 為2_的黃色菌落，菌落邊緣整齊，有光澤，突出，粘稠，濕潤，光滑，不透明。其電鏡圖片中菌 體呈長桿狀，大小為〇.8X 1.8μπι，如圖2所示，基于其16S rDNA序列以及生理生化特征，菌株 DL-10 被鑒定為 Sphingomonas 屬。
[0057] 菌株DL-10的最適生長溫度為30°C，在37°C也可以很好的生長，但在較低溫度（20 °(：和25°〇和較高溫度(42°C)時，其生長則受到明顯抑制。菌株DL-10在pH為6和7時，生長良 好，其最適生長pH為6;當(dāng)pH為5和8時，其生長就受到明顯抑制，菌株DL-10生長時隨著搖瓶 裝液量的增加其生長量下降，表明菌株DL-10也是好氧型微生物。菌株DL-10在NaCl濃度為 2%時生長良好;當(dāng)NaCl濃度為3%時其生長即受到明顯的抑制，如圖3a-3d所示。
[0058] 實施例3
[0059] 苯酸降解菌Sphingomonas paucimobilis DL-10的降解特性：
[0060]從1/3LB平板上挑取菌株DL-10單菌落，分別接種于3mL 1/3LB液體培養(yǎng)基中于30 °C，搖床180r · mirT1培養(yǎng)48h。然后將該菌株的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到20mL新鮮的液體1/3LB培養(yǎng)基 中，繼續(xù)培養(yǎng)1811。600〇1· · mirT1離心10min，收集菌體，用滅菌的無機鹽培養(yǎng)基洗滌一次后， 制成0D_· = 1 · 0的菌懸液，即種子液。
[0061] 在苯酚終濃度為100mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中，按5%接種量接入0D6Q()nm=1.0菌株 DL-10種子液，于30°C、180r · min-1震蕩培養(yǎng)，每隔2h取樣一次，測定0D6mn4P苯酚的濃度。 [0062]由圖4可以看出，菌株DL-10接種到培養(yǎng)基中2h，就開始降解苯酚，而沒有明顯的延 滯現(xiàn)象;之后降解速率逐漸增加，到12h就已將100mg/L的苯酚基本降解完全。另外，從圖中 還可以看出，隨著苯酚的降解，菌株DL-10的生長量經(jīng)歷了2h的停滯后，開始逐漸增加；當(dāng)苯 酚完全降解以后，菌株DL-10的生長量也達到最大;并且在12-14h時，由于培養(yǎng)基中已無苯 酚可利用，這時菌株DL-10的生長量開始下降。該結(jié)果表明菌株DL-10可以利用苯酚進行生 長。
[0063] 菌株DL-10在25°C和30°C時，對苯酚的降解率基本相同；而在37°C時，苯酚的降解 率就受到明顯抑制；當(dāng)溫度為42°C時，幾乎不降解苯酸，如圖5a所示。菌株DL-10在降解苯酚 時對pH的適應(yīng)范圍很寬，在pH 5-9之間均具有很好的效果；即使在pH為4時，苯酚的降解率 也可以達到57%。將此結(jié)果與菌株DL-10的生長pH相比，發(fā)現(xiàn)其降解pH范圍比生長pH范圍寬 的多，說明菌株DL-10產(chǎn)生的降解酶具有較強的pH適應(yīng)性，如圖5b所示。菌株DL-10對苯酚的 降解速率隨著底物濃度的增加而降低。當(dāng)苯酚初始濃度為50mg/L時，其在12h的降解率為 95.5% ;而當(dāng)苯酚初始濃度為200mg/L時，其在12h的降解率仍然可以達到75.3%，說明該菌 株對苯酚具有高效的降解效率如圖5c所示。隨著接種量的增大，苯酚的降解速率明顯增加。 當(dāng)接種量為1 %時，苯酚在12h的降解率為67.3% ;而當(dāng)接種量為5%和10%時，苯酚分別在 10h和6h時即基本降解完全如圖5(1所示。Fe2+、Ca 2+、Mg2+和Ba2+對菌株DL-10的降解能力幾乎 沒有影響;Zn 2+對菌株DL-10的降解能力有輕微的抑制作用;而Cu2+、Cr3+、C 〇2+、Mn2+、Ni2H +則對菌株DL-10的降解能力有明顯的抑制作用，在有Mn2+存在時苯酚的降解率僅為21%，如 圖5e所示。
[0064] 實施例4
[0065] 苯酸降解菌Sphingomonas paucimobilis DL-10對其他苯酸類化合物的降解：
[0066] 菌株Sphingomonas paucimobilis DL-10可以將苯酸、鄰苯二酸、對苯二酸、鄰甲 基苯酚、間甲基苯酚、2，6-二甲基苯酚、3，5-二甲基苯酚、2，6-二甲基對苯二酚等苯酚類化 合物降解至HPLC檢測不到物質(zhì)，如表1所示，說明菌株DL-10可以完全礦化上述底物。
[0067] 將苯酚、鄰苯二酚、對苯二酚、鄰甲基苯酚、間甲基苯酚、對甲基苯酚、2,6-二甲基 苯酚、3，5-二甲基苯酚等苯酚類化合物等濃度混合，終濃度達到500m g//L作為菌株DL-10降 解底物，接種量10 %，于30 °C，180r · mirT1震蕩培養(yǎng)48h后，苯酚、鄰苯二酚、對苯二酚、鄰甲 基苯酚的降解率在90 %以上，間甲基苯酚、對甲基苯酚、2，6-二甲基苯酚的降解率在75 %左 右，3,5-二甲基苯酚的降解率在60 %左右。 [0068]表1菌株DL-10的降解底物譜
[0069]
【主權(quán)項】
1. 一株降解苯酸類化合物的菌株，其特征在于，分類命名為OffiOfias pauciffioMhs DL-10,已于2014年3月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號 為：CCTCC NO:M 2014058。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于，其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。3. 權(quán)利要求1所述菌株的篩選方法，其特征在于，利用含苯酚的無機鹽培養(yǎng)基作為介 質(zhì)，從含酚工業(yè)廢水中連續(xù)富集馴化具有苯酚利用能力的菌株;所述苯酚濃度為100 mg/L。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述無機鹽培養(yǎng)基是由硝酸銨1.0 g，氯化 鈉1.0 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀1.5 g，加水至1.0 L配制，調(diào)節(jié)pH值至7.0,固體 培養(yǎng)基加入瓊脂20.0 g、121°C滅菌20 min，使用前添加苯酚作為碳源。5. 權(quán)利要求1~2所述菌株在苯酚類化合物降解中的應(yīng)用。
【文檔編號】C02F3/34GK105907688SQ201610481724
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月27日
【發(fā)明人】董維亮, 馬江鋒, 章文明, 信豐學(xué), 姜岷
【申請人】南京工業(yè)大學(xué)