一種AuAg-PPY復合納米材料和L-半胱氨酸雙層膜固定葡萄糖氧化酶修飾電極的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種AuAg-PPY復合納米材料和L-半胱氨酸雙層膜固定葡萄糖氧化酶修飾電極的制備方法，其通過納米金顆粒制備、AuAg-PPY復合納米材料的制備、電極的處理、L-半胱氨酸雙層膜的形成、AuAg-PPY復合納米材料的固定、酶的吸附、修飾電極后處理步驟，得到酶修飾電極。本發(fā)明通過AuAg-PPY復合納米材料/L-半胱氨酸雙層膜實現(xiàn)了酶與電極之間的直接電子傳遞，成功構建了一種高靈敏度的第三代生物傳感器。
【專利說明】-種Au@Ag-PPY復合納米材料和L-半胱氨酸雙層膜固定葡 萄糖氧化酶修飾電極的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物電化學傳感器領域，具體地涉及一種固定葡萄糖氧化酶修飾電極 的制備方法。

【背景技術】
[0002] 電化學生物傳感器是指由生物體成分（酶、抗原、抗體、激素等）或生物體本身 (細胞、細胞器、組織等）作為敏感元件，電極（固體電極、離子選擇性電極、氣敏電極等）作 為轉換元件，以電勢或電流為特征檢測信號進行傳感檢測的一種的傳感器。由于它響應快， 靈敏度高，制作簡單而被廣泛研究和應用。利用酶在電極上的直接發(fā)生氧化或還原反應而 構造成的生物傳感器稱為第三代生物傳感器。在這類生物傳感器中，電子傳輸與氧和其它 電子受體無關，也無需任何媒介體的加入，克服了使用介體存在的測量電位偏正、電活性物 質干擾多、電極制作復雜、介體污染等缺點。
[0003] 葡萄糖傳感器在生物和醫(yī)學上有極其重要的研究與應用價值，不僅能用于醫(yī)學上 的疾病控制，而且能用到化工、食品工業(yè)的檢測之中，用途廣泛。但是，在葡萄糖生物傳感器 的研制中，靈敏度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性始終是葡萄糖傳感器發(fā)展需要提高的重要因素。發(fā)展新 型固定材料、選擇合適的酶固定化方法是解決這些問題的有效方法。
[0004] 近年來，隨著納米科學的發(fā)展和納米材料制備技術的不斷發(fā)展，納米材料以其獨 特的物理化學特性而被廣泛的應用于生物傳感器的研制，人們一直致力于尋找具有良好生 物相容性的新型納米材料以提高生物傳感器的電化學性能。貴金屬納米粒子由于具有較大 的比表面積，較高的表面反應活性和催化效率以及較強的吸附能力，在生物傳感器中表現(xiàn) 出較好的催化活性；而雙金屬納米材料的性能更為優(yōu)越。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的再一個目的在于提供一種Au@Ag-PPY復合納米材料和L-半胱氨酸雙層 膜固定葡萄糖氧化酶修飾電極的制備方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種Au@Ag-PPY復合納米材料和 L-半胱氨酸雙層膜固定葡萄糖氧化酶修飾電極的制備方法，包括如下步驟： a. Au@Ag-PPY復合納米材料由納米金和銀及聚批咯復合而成，制備過程如下： (1) 取納米金顆粒的懸浮液，納米金顆粒離心后取沉淀，得到物質A ; (2) 向物質A中加入吡咯和十二烷基磺酸鈉的混合液，充分振蕩后，加入硝酸銀溶液， 再振蕩后，于室溫下陳化，得物質B ; (3) 將物質B離心，取沉淀，并用十二烷基磺酸鈉分散，得到Au@Ag-PPY納米復合材料； b. 電極的處理：將金電極先用三氧化二鋁懸濁液處理，再用三氧化二鋁懸濁液在打磨 布上拋光成鏡面，最后用乙醇、二次水超聲清洗； c. 制備雙層L-半胱氨酸膜修飾的金電極：將處理好的金電極浸泡在L-半胱氨酸溶液 中，然后取出用二次蒸餾水沖洗干凈即得； d. Au@Ag-PPY復合納米材料的固定：在L-半胱氨酸雙層膜修飾的金電極上滴涂Au@ Ag-PPY復合納米材料的分散液，室溫下放置； e. 酶的吸附：在Au@Ag-PPY/L-半胱氨酸雙層膜修飾的金電極上滴涂葡萄糖氧化酶溶 液，在4°C冰箱中放置； f. 修飾電極后處理：將吸附有葡萄糖氧化酶的電極從酶溶液中取出，用pH值為7. 0的 磷酸緩沖溶液沖洗干凈后即得到酶修飾電極。
[0007] 優(yōu)選的，步驟a的（1)中納米金顆粒采用檸檬酸鈉還原法制備：將100ml 0. 01%的 氯金酸溶液在三口燒瓶內加熱煮沸后，迅速加入3. 5ml質量分數(shù)為1%的檸檬酸三鈉，并攪 拌；在攪拌狀態(tài)下繼續(xù)煮沸6分鐘，溶液從淺黃色變成無色、灰色，最后變成酒紅色，移去熱 源，停止攪拌冷卻至室溫即得。
[0008] 優(yōu)選的，制備的納米金顆粒粒徑約為17nm。
[0009] 優(yōu)選的，步驟a的具體操作過程如下， (1) 取9ml制備好的納米金顆粒，平均裝在3支容量為5ml的離心管中，在14000rpm的 轉速下離心5min，取沉淀，并將三份沉淀混合，得到物質A ; (2) 向物質A中加入3ml新蒸好的吡咯和0. 5ml的40毫摩爾的十二烷基磺酸鈉混合 液，充分振蕩5s后加入3ml 5毫摩爾的硝酸銀溶液，再振蕩10s后，于室溫下陳化12h，得物 質B ; (3) 將物質B在12000rpm轉速下離心12min，取沉淀，并用3. 6毫摩爾的十二烷基磺酸 鈉分散。
[0010] 優(yōu)選的，所述步驟c中采用的L-半胱氨酸溶液物質的量濃度為0. 03 M。
[0011] 優(yōu)選的，所述步驟c中金電極在L-半胱氨酸溶液中浸泡的時間為4h。本發(fā)明以 雙貴金屬納米粒子與聚合物材料復合，產生很強的界面作用，使納米粒子的剛性、熱穩(wěn)定性 與聚合物材料的韌性、介電性相結合，從而得到性能優(yōu)良的復合材料。將該類復合材料應用 到酶固定化技術中，可提高酶活性中心和基底電極之間的電子傳遞能力，提高生物傳感器 的靈敏度。本發(fā)明采用的酶固定方法是通過在金電極上修飾L-半胱氨酸雙層膜、吸附Au@ Ag-PPY納米顆粒、吸附葡萄糖氧化酶完成的，本方法提高了修飾電極對酶的相容性，有效保 持了酶的活性。利用這種方法制得的酶修飾電極不僅實現(xiàn)了酶與電極之間的直接電子轉 移，而且提高了修飾電極的生物相容性和檢測靈敏度。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點： 1、 本發(fā)明中設計的L-半胱氨酸雙層膜在pH值大于5. 0的環(huán)境中表面帶大量負電荷， 可有效吸附Au@Ag-PPY納米顆粒； 2、 本發(fā)明在電極修飾過程中加入Au、Ag雙金屬納米顆粒，它能夠促進實現(xiàn)酶與電極之 間的直接電子轉移，成功構建了第三代生物傳感器； 3、 本發(fā)明在電極修飾過程中加入聚吡咯，使修飾電極具有更好的生物相容性。采用 的導電聚合物吡咯雖可引起檢測過程中電位過高的現(xiàn)象，但是聚吡咯與雙金屬納米材料復 合，會顯著降低修飾電極對葡萄糖的檢測電位。
[0013] 4、本發(fā)明采用的酶固定方法將足夠量的高活性酶盡可能牢固地固定在電極表面， 制備的酶修飾電極靈敏度高，響應時間短，使用壽命長。本發(fā)明制備的葡萄糖氧化酶酶修飾 電極對葡萄糖的檢測范圍為2· 5X 10_7?1· 2X 10_4 mol/L。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是裸電極和雙層L-半胱氨酸膜修飾的電極在0.025 mol/ L PBS (pH=7.0) 中的循環(huán)伏安掃描圖； 圖2是雙層L-半胱氨酸膜、Au@Ag-PPY修飾的電極和雙層L-半胱氨酸膜、Au@Ag-PPY、 葡萄糖氧化酶修飾的電極在0.025 mol/ L PBS (pH=7.0)中的循環(huán)伏安掃描圖； 圖3是雙層L-半胱氨酸膜、Au@Ag-PPY、葡萄糖氧化酶修飾電極在0. 02 M PBS + 0. 1 M KC1 (pH = 7)溶液中的差分脈沖曲線圖； 圖4是電極電流響應與葡萄糖濃度的線性關系圖。

【具體實施方式】
[0015] 為了更清楚地說明本發(fā)明的內容，下面結合附圖和具體的實施例對本發(fā)明再作進 一步的說明： 實驗過程中使用的水均為二次蒸餾水，實驗所用的試劑均為分析純。實驗均在室溫下 進行。
[0016] 實施例1 (1)、本實施例所使用的儀器與試劑 儀器：AUTOLABPGSTAT 128N模塊式電化學綜合測試系統(tǒng)(瑞士萬通公司），電化學測 量采用三電極體系：酶電極為工作電極，鉬絲電極作輔助電極，飽和甘汞（SCE)電極為參 比電極。所有電化學實驗均在室溫下進行。
[0017] 試劑：氯金酸（HC104，上海試劑一廠)、十二烷基磺酸鈉 （SDS，Sigma)、硝酸銀 (AgN03，西安化學試劑廠)、吡咯（Py，上海試劑一廠)、L-半胱氨酸（Sigma)、磷酸氫二鈉 (Na2HP04, Aldrich)、磷酸二氫鈉 （NaH2P04, Aldrich)、鐵氰化鉀（K3Fe(CN)6, Aldrich)、氯 化鈉 （NaCl, Aldrich)、高純氮氣（N2，中國科學院蘭州化物所特種氣體中心)、葡萄糖氧化酶 (GOD，Sigma)、葡萄糖(上海試劑一廠)。所有試劑均為分析純。除特殊說明外，所有試劑均 用二次蒸餾水配制。葡萄糖溶液需在使用前提前配制，放置隔夜后使用。
[0018] (2)、酶修飾電極的制備 a. 檸檬酸鈉還原法制備納米金顆粒：將100ml 0. 01%的氯金酸溶液在三口燒瓶內加 熱煮沸后，迅速加入3.5ml質量份數(shù)為1%的檸檬酸三鈉，并攪拌。在攪拌狀態(tài)下繼續(xù)煮沸 6分鐘，溶液從淺黃色變成無色、灰色，最后變成酒紅色，移去熱源，停止攪拌冷卻至室溫，得 到納米金顆粒（AuNP); b. Au@Ag-PPY復合納米材料的制備：（1)取9ml制備好的納米金顆粒，平均裝在3支容 量為5ml的離心管中，在14000rpm的轉速下離心5min，取沉淀，并將三份沉淀混合，得到物 質A。（2)向物質A中加入3ml新蒸的吡咯和0. 5ml 40毫摩爾十二烷基磺酸鈉（SDS)的 混合液，充分振蕩5s后加入3ml 5毫摩爾的硝酸銀溶液，再振蕩10s后，于室溫下陳化12h， 得物質B。此過程中溶液顏色由酒紅色逐漸變?yōu)樽厣＃?)將物質B在12000rpm轉速下離 心12min，取沉淀，并用3. 6毫摩爾SDS分散，得到實驗所需的Au@Ag-PPY納米復合材料； c. 電極的處理：將金電極先用0. 3 μπι的三氧化二鋁懸濁液在打磨布上處理，再用 0. 05 μ m的三氧化二鋁懸濁液在打磨布上拋光成鏡面，最后用乙醇、二次水超聲清洗； d. L-半胱氨酸雙層膜的形成：將處理好的金電極浸泡在0.03 Μ的L-半胱氨酸溶液 中4 h后取出，并用二次蒸餾水沖洗干凈。此方法制備出雙層L-半胱氨酸膜修飾的金電 極； e. Au@Ag-PPY復合納米材料的固定：在L-半胱氨酸雙層膜修飾的金電極上滴涂3mL的 Au@Ag-PPY分散液，室溫下放置12h ; f. 酶的吸附：在Au@Ag-PPY/L-半胱氨酸雙層膜修飾的金電極上滴涂3mL 2000U/mL的 葡萄糖氧化酶溶液，在4°C冰箱中放置12h ; g. 修飾電極后處理：將吸附有葡萄糖氧化酶的電極從酶溶液中取出，用pH值為7. 0的 磷酸緩沖溶液沖洗干凈后即得到酶修飾電極。將酶修飾電極放置在4 °C的冰箱中待用。
[0019] 步驟a所述的方法制備的納米金顆粒粒徑約為17nm。
[0020] 步驟d所述的方法制備L-半胱氨酸雙層膜時，采用的L-半胱氨酸溶液物質的量 濃度為〇. 03 Μ ;金電極在L-半胱氨酸溶液中浸泡的時間為4h。
[0021] 對比試驗： (1)采用循環(huán)伏安法將不同修飾電極與裸電極做了對比，如圖1、圖2所示，圖1和圖2 是不同修飾電極在〇. 025 mol/ L PBS (pH=7. 0)中的循環(huán)伏安掃描圖，掃速為50 mVs-1。 圖1中a為裸金電極，b為雙層L-半胱氨酸修飾的金電極；圖2中a為L-半胱氨酸/Au@ Ag-PPY修飾的金電極，b為L半胱氨酸/Au@Ag-PPY/G0D修飾的金電極。
[0022] 對比可知修飾膜有效地提高了電極的比表面積，本發(fā)明提供的固載酶的方法可有 效地將葡萄糖氧化酶固定到電極表面。

【權利要求】
1. 一種Au@Ag-PPY復合納米材料和L-半胱氨酸雙層膜固定葡萄糖氧化酶修飾電極的 制備方法，其特征在于它包括如下步驟： a. Au@Ag-PPY復合納米材料由納米金和銀及聚批咯復合而成，制備過程如下： (1) 取納米金顆粒的懸浮液，納米金顆粒離心后取沉淀，得到物質A ; (2) 向物質A中加入吡咯和十二烷基磺酸鈉的混合液，充分振蕩后，加入硝酸銀溶液， 再振蕩后，于室溫下陳化，得物質B ; (3) 將物質B離心，取沉淀，并用十二烷基磺酸鈉分散，得到Au@Ag-PPY納米復合材料； b. 電極的處理：將金電極先用三氧化二鋁懸濁液處理，再用三氧化二鋁懸濁液在打磨 布上拋光成鏡面，最后用乙醇、二次水超聲清洗； c. 制備雙層L-半胱氨酸膜修飾的金電極：將處理好的金電極浸泡在L-半胱氨酸溶液 中，然后取出用二次蒸餾水沖洗干凈即得； d. Au@Ag-PPY復合納米材料的固定：在L-半胱氨酸雙層膜修飾的金電極上滴涂Au@ Ag-PPY復合納米材料的分散液，室溫下放置； e. 酶的吸附：在Au@Ag-PPY/L-半胱氨酸雙層膜修飾的金電極上滴涂葡萄糖氧化酶溶 液，在4°C冰箱中放置； f. 修飾電極后處理：將吸附有葡萄糖氧化酶的電極從酶溶液中取出，用pH值為7. 0的 磷酸緩沖溶液沖洗干凈后即得到酶修飾電極。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種AuOAg-PPY復合納米材料和L-半胱氨酸雙層膜固定葡 萄糖氧化酶修飾電極的制備方法，其特征在于：步驟a的（1)中納米金顆粒采用檸檬酸鈉還 原法制備：將l〇〇ml 0. 01%的氯金酸溶液在三口燒瓶內加熱煮沸后，迅速加入3. 5ml質量分 數(shù)為1%的檸檬酸三鈉，并攪拌；在攪拌狀態(tài)下繼續(xù)煮沸6分鐘，溶液從淺黃色變成無色、灰 色，最后變成酒紅色，移去熱源，停止攪拌冷卻至室溫即得。
3. 根據(jù)權利要求2所述的一種AuOAg-PPY復合納米材料和L-半胱氨酸雙層膜固定葡 萄糖氧化酶修飾電極的制備方法，其特征在于：制備的納米金顆粒粒徑約為17nm。
4. 根據(jù)權利要求1所述的一種AuOAg-PPY復合納米材料和L-半胱氨酸雙層膜固定葡 萄糖氧化酶修飾電極的制備方法，其特征在于：步驟a的具體操作過程如下， (1) 取9ml制備好的納米金顆粒，平均裝在3支容量為5ml的離心管中，在14000rpm的 轉速下離心5min，取沉淀，并將三份沉淀混合，得到物質A ; (2) 向物質A中加入3ml新蒸好的吡咯和0. 5ml的40毫摩爾的十二烷基磺酸鈉混合 液，充分振蕩5s后加入3ml 5毫摩爾的硝酸銀溶液，再振蕩10s后，于室溫下陳化12h，得物 質B ; (3) 將物質8在12000印111轉速下離心121^11，取沉淀，并用3.6毫摩爾的十二烷基磺酸 鈉分散。
5. 根據(jù)權利要求1所述的一種AuOAg-PPY復合納米材料和L-半胱氨酸雙層膜固定葡 萄糖氧化酶修飾電極的制備方法，其特征在于：所述步驟c中采用的L-半胱氨酸溶液物質 的量濃度為〇. 03M。
6. 根據(jù)權利要求1所述的一種AuOAg-PPY復合納米材料和L-半胱氨酸雙層膜固定葡 萄糖氧化酶修飾電極的制備方法，其特征在于：所述步驟c中金電極在L-半胱氨酸溶液中 浸泡的時間為4h。
【文檔編號】G01N27/327GK104280441SQ201410544759
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權日:2014年10月15日
【發(fā)明者】王艷鳳, 韓根亮, 李云霞, 馬麗萍, 宋玉哲, 左顯維 申請人:甘肅省科學院傳感技術研究所