一種檢測(cè)β-hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)β-hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，包括盒體和盒體上方的盒蓋，所述盒體內(nèi)設(shè)有放置包被抗β-hCG單克隆抗體的酶標(biāo)板的隔層；所述盒體內(nèi)設(shè)有放置試劑瓶的容器孔，所述容器孔內(nèi)放置有：裝有分析液的試劑瓶；裝有清洗液的試劑瓶；裝有增強(qiáng)液的試劑瓶；裝有β-hCG校準(zhǔn)品的試劑瓶；裝有標(biāo)記的抗α-TSH單克隆抗體的試劑瓶。此外，本發(fā)明還公開(kāi)了該試劑盒的制備方法及其在檢測(cè)β-hCG含量中的應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒的靈敏度高、檢測(cè)范圍廣、穩(wěn)定性好。本發(fā)明可利用全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀進(jìn)行全自動(dòng)操作，操作簡(jiǎn)單省時(shí)，靈敏度高，可達(dá)到0.01mIU/ml；準(zhǔn)確性好、且無(wú)輻射污染。
【專利說(shuō)明】—種檢測(cè)β -hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及體外免疫診斷試劑領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)尿液中β-hCG的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒及其制備方法和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)對(duì)尿液中β -hCG含量的定量檢測(cè)。

【背景技術(shù)】
[0002]人絨毛膜促性腺激素(hCG)，是由胎盤絨毛膜的合體滋養(yǎng)層產(chǎn)生的一種糖蛋白，β亞單位是特異性抗原，其結(jié)構(gòu)與其它垂體前葉激素不同。
[0003]質(zhì)量是一家生產(chǎn)型企業(yè)的立足之本。許多做hCG測(cè)試筆的體外診斷公司，需要利用含一定濃度β -hCG標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)試筆功能性檢測(cè)，從而確認(rèn)此批測(cè)試筆是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，能否出售，這是一個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量控制點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)品若不合格，有可能對(duì)測(cè)試筆的性能進(jìn)行誤判，對(duì)企業(yè)產(chǎn)生不利的影響。因此有必要發(fā)展一種靈敏度高、檢測(cè)范圍廣、穩(wěn)定性好的定量檢測(cè)試劑盒，用于監(jiān)測(cè)含一定濃度的β -hCG標(biāo)準(zhǔn)品的性能。
[0004]目前市售的試劑盒大多以酶聯(lián)免疫為主，以血清為標(biāo)本進(jìn)行定量檢測(cè)β-hCG含量，靈敏度一般，檢測(cè)范圍偏窄，取樣操作復(fù)雜、不方便。尿液中β-hCG含量的測(cè)定已經(jīng)是體外快速檢測(cè)產(chǎn)品的一項(xiàng)重要指標(biāo)，通過(guò)尿液中β-hCG含量的多少，可直接判斷出是否懷孕以及懷孕的周數(shù)，取樣簡(jiǎn)單、便捷。作為早早孕體外快速檢測(cè)產(chǎn)品的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，也是用尿液來(lái)配制或者標(biāo)定的；容易引起疏忽的是:不管是正常男性或婦女的尿液中，本身就存在一定含量(極低水平)的β-hCG抗原。因此定量測(cè)定尿液中β-hCG的含量，可為標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確性提供一種定量的保證，也可輔助早期判斷妊娠、流產(chǎn)、宮外孕等。
[0005]時(shí)間分辨免疫突光分析法(Time-resolvedfluoroimmunoassay, TRFIA),是利用具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素作為標(biāo)記示蹤物，代替酶、同位素等，成為發(fā)光免疫分析中的一種重要方法，具有靈敏度高、示蹤物穩(wěn)定、不受樣品自然熒光干擾、無(wú)放射性污染等許多優(yōu)點(diǎn)。
[0006]目前，對(duì)于采用時(shí)間分辨免疫熒光分析法檢測(cè)尿液中β-hCG含量尚未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種檢測(cè)尿液中β -hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其靈敏度高、檢測(cè)范圍廣、穩(wěn)定性好，取樣方便，快速。
[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供該試劑盒的制備方法。
[0009]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供該試劑盒在檢測(cè)β -hCG含量中的應(yīng)用。
[0010]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0011]在本發(fā)明的一方面，提供一種檢測(cè)β-hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，包括盒體和盒體上方的盒蓋，所述盒體內(nèi)設(shè)有放置包被抗β-hCG單克隆抗體的酶標(biāo)板的隔層；所述盒體內(nèi)設(shè)有放置試劑瓶的容器孔，所述容器孔內(nèi)放置有:
[0012]裝有分析液的試劑瓶；
[0013]裝有清洗液的試劑瓶；
[0014]裝有增強(qiáng)液的試劑瓶；
[0015]裝有β -hCG校準(zhǔn)品的試劑瓶；其中，β -hCG校準(zhǔn)品的濃度已知，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.-^4 ，
[0016]裝有標(biāo)記的抗a -TSH單克隆抗體的試劑瓶。
[0017]作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述容器孔內(nèi)還放置有:裝有包被液的試劑瓶、裝有封閉保護(hù)液的試劑瓶、以及裝有洗脫液的試劑瓶。
[0018]作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述酶標(biāo)板為帶保護(hù)膜的96孔酶標(biāo)板。
[0019]作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述抗β _hCG單克隆抗體的濃度為l-ΙΟμ g/ml。
[0020]所述標(biāo)記的抗a -TSH單克隆抗體的標(biāo)記物可以采用本領(lǐng)域常用的標(biāo)記物，例如鑭系元素。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述標(biāo)記的抗a-TSH單克隆抗體的標(biāo)記物優(yōu)選是三價(jià)銪離子。
[0021]作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述標(biāo)記的抗a-TSH單克隆抗體中抗體與標(biāo)記物的標(biāo)記重量比例是(6-10):1。
[0022]作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述β-hCG校準(zhǔn)品為尿液配制的β-hCG標(biāo)準(zhǔn)品。
[0023]在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
[0024](I)抗β -hCG單克隆抗體包被酶標(biāo)板的制備:
[0025]將抗β -hCG單克隆抗體在包被液中透析，再加入到酶標(biāo)板上，于2_8°C包被48小時(shí)以上；用清洗液清洗酶標(biāo)板后，加入封閉保護(hù)液，室溫封閉20小時(shí)以上；甩干封閉保護(hù)液干燥密封，置于2-8°C冰箱備用；
[0026](2)三價(jià)銪標(biāo)記的抗a -TSH單克隆抗體的制備:
[0027]將抗C1-TSH單克隆抗體，用標(biāo)記液進(jìn)行透析，取透析好的抗a-TSH單克隆抗體，用標(biāo)記液稀釋；將抗體加入到凍干的銪標(biāo)記液中緩慢搖勻后置于2-8°C冰箱中過(guò)夜；用純化柱純化2-8°C過(guò)夜的標(biāo)記液，收集標(biāo)記物，加入0.1 % BSA置于_80± 10°C冷凍保存?zhèn)溆茫?br> [0028](3) β -hCG校準(zhǔn)品的制備:
[0029]用3-1^6干粉和陰性尿液配制濃度為0、15、25、37.5、50、75和100mIU/ml的β -hCG校準(zhǔn)尿液，置于_80± 10°C冷凍保存?zhèn)溆茫?br> [0030]所述清洗液、分析液和增強(qiáng)液為市售商品。
[0031]作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(2)中，所述將抗體加入到凍干的銪標(biāo)記液中，其中抗體與銪標(biāo)記液的重量比例為(6-10):1。
[0032]作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(2)中，所述用純化柱純化2_8°C過(guò)夜的標(biāo)記液，收集標(biāo)記物具體為:取純化柱，用洗脫液洗脫平衡至少2小時(shí)，將2-8°C過(guò)夜的標(biāo)記液全部轉(zhuǎn)入柱子的頂端，重力自然洗脫，以0.25ml/管為單位進(jìn)行收集。
[0033]在本發(fā)明的另一方面，還提供該試劑盒在檢測(cè)β-hCG含量中的應(yīng)用，該檢測(cè)方法包括如下步驟:
[0034](I)將β -hCG校準(zhǔn)品和待檢樣品依次加入到抗β -hCG單克隆抗體包被的酶標(biāo)板上，再加入分析液，震蕩孵育；
[0035](2)將清洗液用去離子水進(jìn)行稀釋，然后用已稀釋的清洗液清洗酶標(biāo)板并甩干；
[0036](3)將純化好的三價(jià)銪標(biāo)記的抗a-TSH單克隆抗體，用分析液稀釋，加入酶標(biāo)板中，震湯鮮育；
[0037](4)用清洗液清洗酶標(biāo)板并甩干；
[0038](5)加入增強(qiáng)液，使用全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀檢測(cè)熒光信號(hào)；
[0039](6)根據(jù)熒光數(shù)值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待檢樣品的熒光信號(hào)代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求得待檢樣品的濃度。
[0040]上述術(shù)語(yǔ)說(shuō)明如下:
[0041]本發(fā)明所述的“分析液”:Assay Buffer,市售商品，采購(gòu)自Perkin Elmer,貨號(hào):4002-0010。在檢測(cè)時(shí)使用的緩沖液。
[0042]本發(fā)明所述的“清洗液”:Wash Solut1n,市售商品,采購(gòu)自Perkin Elmer,貨號(hào):B117-100。用于酶標(biāo)板清洗的溶液。
[0043]本發(fā)明所述的“增強(qiáng)液” !Enhancement Solut1n,市售商品，采購(gòu)自PerkinElmer，貨號(hào):Β118_100?？墒箻?biāo)記物從反應(yīng)復(fù)合物上解離下來(lái)的溶液。
[0044]本發(fā)明所述的“包被液”:可自行配制，用于將抗體包被在酶標(biāo)板上的溶液。
[0045]本發(fā)明所述的“標(biāo)記液”:可自行配制，用于將抗原與標(biāo)記物結(jié)合到一起的溶液。
[0046]本發(fā)明所述的“封閉保護(hù)液”:可自行配制，用于將包被在酶標(biāo)板上的抗體封閉保護(hù)在酶標(biāo)板上的溶液。
[0047]本發(fā)明所述的“洗脫液”:可自行配制，用于洗脫平衡ro1柱子的溶液。
[0048]和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0049]I使用本發(fā)明能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)QC標(biāo)準(zhǔn)品中β -hCG含量，即確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)品性能，為準(zhǔn)確檢測(cè)hCG測(cè)試筆提供保障，增加了企業(yè)對(duì)hCG測(cè)試筆的質(zhì)量控制，避免了因標(biāo)準(zhǔn)品問(wèn)題引起的產(chǎn)品質(zhì)量調(diào)查、返工、客戶投訴等，節(jié)約了企業(yè)的人力、物力和時(shí)間成本，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。
[0050]2使用本發(fā)明也能夠用于定量檢測(cè)尿液中β-hCG的含量，對(duì)于早期判斷妊娠、流產(chǎn)、宮外孕等起到一定幫助，定量檢測(cè)尿液中β-hCG的含量相比檢測(cè)血液中的β-hCG的含量，其取樣更簡(jiǎn)便，操作性更強(qiáng)。
[0051]3與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可利用AutoDELFIA1235(全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀)進(jìn)行全自動(dòng)操作，操作簡(jiǎn)單省時(shí)，加樣量小(50ul/份)；靈敏度高，可達(dá)到0.0lmIU/ml ;準(zhǔn)確性好，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值接近1，線性穩(wěn)定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合出的回歸方程準(zhǔn)確，便于樣品濃度計(jì)算；無(wú)輻射污染；檢測(cè)樣品量大，一次可最多檢測(cè)953份樣品。
[0052]4.本發(fā)明檢測(cè)范圍廣，可檢測(cè)β-hCG含量范圍為O?3500IU/ml。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0053]圖1是時(shí)間免疫熒光試劑盒的原理示意圖；
[0054]圖2是本發(fā)明一種檢測(cè)β -hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0055]圖3是本發(fā)明的試劑瓶的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0056]圖4是本發(fā)明的酶標(biāo)板的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0057]圖5是本發(fā)明實(shí)施例1中的洗脫曲線示意圖；
[0058]圖6是本發(fā)明實(shí)施例2中熒光數(shù)值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
[0059]圖中附圖標(biāo)記說(shuō)明:
[0060]I是裝有分析液的試劑瓶，2是裝有清洗液的試劑瓶，3是裝有增強(qiáng)液的試劑瓶，4是裝有包被液的試劑瓶，5是裝有封閉保護(hù)液的試劑瓶，6是裝有洗脫液的試劑瓶，7是裝有β-hCG校準(zhǔn)品的試劑瓶，8是裝有標(biāo)記的抗a-TSH單克隆抗體的試劑瓶，9是酶標(biāo)板，11是包被在酶標(biāo)板上的抗β-hCG單克隆抗體，12是待測(cè)樣品中的β-hCG抗原，13是三價(jià)銪離子(Eu3+)標(biāo)記的抗a-TSH單克隆抗體，14是雙抗體夾心法免疫復(fù)合物，15是含銪的熒光物質(zhì)，21是5ml試劑瓶，22是30ml試劑瓶，91是加樣孔，92是保護(hù)膜。

【具體實(shí)施方式】
[0061]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0062]如圖1所示,本發(fā)明的原理是雙抗體夾心法,具體包括如下步驟:將抗β -hCG單克隆抗體包被到96孔酶標(biāo)板上,形成包被在酶標(biāo)板上的抗β -hCG單克隆抗體11,標(biāo)記物是三價(jià)銪離子(Eu3+)標(biāo)記的抗α-TSH單克隆抗體3，待測(cè)樣品中的β-hCG抗原12先與包被在酶標(biāo)板上的抗β -hCG單克隆抗體I反應(yīng)(震蕩、洗板)，然后與Eu3+標(biāo)記的抗a -TSH單克隆抗體13反應(yīng)(震蕩、洗板)，形成雙抗體夾心法免疫復(fù)合物14，加入增強(qiáng)液震蕩反應(yīng)，加入含銪的熒光物質(zhì)15在熒光檢測(cè)設(shè)備如AutoDELFIA1235上讀熒光信號(hào)，進(jìn)行TRFIA檢測(cè)從而確定標(biāo)準(zhǔn)品中β -hCG的濃度。
[0063]如圖2所示，本發(fā)明的一種檢測(cè)β -hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，包括盒體和盒體上方的盒蓋，所述盒體內(nèi)設(shè)有放置包被抗β-hCG單克隆抗體的酶標(biāo)板9的隔層；所述盒體內(nèi)設(shè)有放置試劑瓶的容器孔，所述容器孔內(nèi)放置有:裝有分析液的試劑瓶I ;裝有清洗液的試劑瓶2 ;裝有增強(qiáng)液的試劑瓶3 ;裝有包被液的試劑瓶4 ;裝有封閉保護(hù)液的試劑瓶5 ;裝有洗脫液的試劑瓶6 ;裝有β-hCG校準(zhǔn)品的試劑瓶7 ;裝有標(biāo)記的抗a-TSH單克隆抗體的試劑瓶8。
[0064]如圖3所示，試劑瓶采用5ml試劑瓶21或30ml試劑瓶22。5ml試劑瓶21是塑料廣口瓶(采用聚丙烯材質(zhì))。30ml試劑瓶22是塑料離心管(采用聚丙烯材質(zhì))。
[0065]如圖4所示，酶標(biāo)板9為帶保護(hù)膜92的96孔酶標(biāo)板，有96個(gè)加樣孔91。
[0066]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按重量計(jì)。
[0067]實(shí)施例1試劑盒的制備
[0068]上述試劑盒的制備方法如下:
[0069]1.200mmol/L pH = 6.8±0.1 包被液的配制
[0070]將35.08g Na2HPO4.12Η20、5.91g NaH2PO4.2H20 和 9g NaCl 加入到 600ml 去離子水中，用IN HCl和IN NaOH調(diào)整PH值至6.8 ±0.1，定容到1L。
[0071]2.50mmol/L pH = 6.8封閉保護(hù)液的配制
[0072]將8.77g Na2HPO4.Iffi2O 和 3.98g NaH2PO4.2H20 加入到 600ml 去離子水中，再依次加入Ig BSA(牛血清白蛋白)，60g Trehalose (海藻糖)和Ig Diazolidinyl Urea(雙咪唑烷基脲)，待完全溶解后調(diào)整PH值至6.8±0.1，定容到1L。
[0073]3.100mmol/L pH = 9.3Eu3+標(biāo)記液的配制
[0074]將2.12g Na2CO3 和 6.72g NaHCO3 加入到 600ml 去離子水中，用 IN HCl 和 IN NaOH調(diào)整PH值至9.3±0.1，定容到IL0
[0075]4.50mmol/L pH = 7.8±0.1 洗脫液的配制
[0076]將6.057g Tris，9g NaCl 和 345ml 0.1N HCl 加入 600ml 去離子水中，用 IN HCl和IN NaOH調(diào)整PH值至7.8±0.1，定容到IL0
[0077]5.抗β -hCG單克隆抗體包被酶標(biāo)板的制備
[0078]5.1從冰箱中取出抗β -hCG單克隆抗體(采購(gòu)自AlereSanDiego，貨號(hào):3468，作為包被抗體使用)，用200mmol/L pH = 6.8±0.1的包被液進(jìn)行透析，將透析好的抗β _hCG單克隆抗體在紫外分光光度計(jì)下測(cè)定濃度，然后用此包被液將抗體稀釋到8μ g/ml，混勻備用。
[0079]5.2取出96孔酶標(biāo)板，恢復(fù)至室溫，每孔加入150 μ I用包被液稀釋好的8 μ g/ml抗β -hCG單克隆抗體，將96孔酶標(biāo)板置于2-8°C包被48小時(shí)以上。
[0080]5.3取出96孔酶標(biāo)板，將液體甩干，用1:25清洗液清洗3次，甩干，仔細(xì)檢查孔中不能存有液體。每孔加入200 μ I 50mmol/L pH = 6.8±0.1的封閉保護(hù)液，于室溫封閉20小時(shí)以上。
[0081]5.4取出96孔酶標(biāo)板，將封閉保護(hù)液甩干，放入自封袋中并同時(shí)放入適量的干燥劑，2-8 °C冰箱干燥備用。
[0082]6.抗a-TSH單克隆抗體的三價(jià)銪(Eu3+)標(biāo)記
[0083]6.1將抗a -TSH單克隆抗體(采購(gòu)自AlereSanDiego，貨號(hào):3299，作為標(biāo)記抗體使用)，用100mmol/L pH = 9.3±0.1的標(biāo)記液進(jìn)行透析。
[0084]6.2取透析好的抗a -TSH單克隆抗體,用標(biāo)記液稀釋至1.2mg/ml。
[0085]6.3按照抗體與銪標(biāo)(6-10):1的結(jié)合比例，將1.2mg/ml抗a -TSH單克隆抗體加入到凍干的Eu-Labelling Reagent (銪標(biāo)記液)中，緩慢搖勻，置于2_8°C冰箱中過(guò)夜,待用。
[0086]6.3 取 PD-10(S印hadex G-50M 填料)純化柱，用 50 m mol/L PH = 7.8±0.I 的洗脫液洗脫平衡至少2小時(shí)。
[0087]6.4將2_8°C過(guò)夜的標(biāo)記液(含抗a -TSH單克隆抗體)全部轉(zhuǎn)入柱子的頂端，重力自然洗脫，以0.25ml/管為單位進(jìn)行收集。收集好后，每管取10 μ L依次加入到96孔酶標(biāo)板中，用AutoDELFIA 1235 (全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀)進(jìn)行熒光讀數(shù)，將所得數(shù)據(jù)利用Excel (或其它軟件)進(jìn)行描繪曲線。
[0088]6.5按照?qǐng)D5的洗脫曲線，收集兩個(gè)箭頭中間的部分用于檢測(cè)，把兩個(gè)箭頭中間的部分合并后，根據(jù)體積估算，加入總體積0.1 %的BSA，_80± 10°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0089]7.β-hCG校準(zhǔn)品(濃度已知，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線)
[0090]用β-hCG干粉(來(lái)源于世界衛(wèi)生組織WHO)和陰性尿液配制濃度為0、15、25、37.5,50,75和100mIU/ml的β -hCG校準(zhǔn)尿液，_80± 10°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0091]8.分析液(市售商品)Assay Buffer,采購(gòu)自 Perkin Elmer,貨號(hào):4002_0010。
[0092]9.清洗液(市售商品)Wash Solut1n,采購(gòu)自 Perkin Elmer,貨號(hào):Β117_100。
[0093]10.增強(qiáng)液(市售商品)Enhancement Solut1n,米購(gòu)自 Perkin Elmer,貨號(hào):B118-100。
[0094]實(shí)施例2試劑盒的應(yīng)用
[0095]本發(fā)明還提供了試劑盒的應(yīng)用方法:
[0096]1.將濃度為0、15、25、37.5、50、75和100mIU/ml的β -hCG校準(zhǔn)品和待檢樣品依次加入到抗β -hCG單克隆抗體包被的酶標(biāo)板上，每個(gè)校準(zhǔn)品和待檢樣品重復(fù)三孔，每孔加樣50 μ 1，再加入150 μ I分析液，震蕩孵育30分鐘。
[0097]2.將清洗液用去離子水進(jìn)行25倍稀釋，然后用已稀釋的清洗液清洗酶標(biāo)板3次并甩干。
[0098]3.將純化好的三價(jià)銪標(biāo)記的抗a -TSH單克隆抗體，用分析液1:100稀釋，200 μ I/孔加入酶標(biāo)板中，震蕩孵育30分鐘。
[0099]4.用1:25清洗液清洗酶標(biāo)板6次并甩干。
[0100]5.每孔加入300 μ I增強(qiáng)液，使用AutoDELFIA 1235檢測(cè)熒光信號(hào)。
[0101]6.使用EXCEL或其他軟件，根據(jù)熒光數(shù)值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖6)，將待檢樣品的熒光信號(hào)代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可求得待檢樣品的濃度，即檢測(cè)出β -hCG的含量。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)β-hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，包括盒體和盒體上方的盒蓋，其特征在于，所述盒體內(nèi)設(shè)有放置包被抗β-hCG單克隆抗體的酶標(biāo)板的隔層；所述盒體內(nèi)設(shè)有放置試劑瓶的容器孔，所述容器孔內(nèi)放置有: 裝有分析液的試劑瓶； 裝有清洗液的試劑瓶； 裝有增強(qiáng)液的試劑瓶； 裝有β -hCG校準(zhǔn)品的試劑瓶； 裝有標(biāo)記的抗a-TSH單克隆抗體的試劑瓶。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)β-hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述容器孔內(nèi)還放置有:裝有包被液的試劑瓶、裝有封閉保護(hù)液的試劑瓶、以及裝有洗脫液的試劑瓶。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)β-hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)板為帶保護(hù)膜的96孔酶標(biāo)板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)β-hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述抗β-hCG單克隆抗體的濃度為l-10yg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)β-hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)記的抗a -TSH單克隆抗體的標(biāo)記物是三價(jià)銪離子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種檢測(cè)β-hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)記的抗a-TSH單克隆抗體中抗體與標(biāo)記物的標(biāo)記重量比例是(6-10):1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)β-hCG含量的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述β-hCG校準(zhǔn)品為尿液配制的β-hCG標(biāo)準(zhǔn)品。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)抗β-hCG單克隆抗體包被酶標(biāo)板的制備: 將抗β-hCG單克隆抗體在包被液中透析，再加入到酶標(biāo)板上，于2-8°C包被48小時(shí)以上；用清洗液清洗酶標(biāo)板后，加入封閉保護(hù)液，室溫封閉20小時(shí)以上；甩干封閉保護(hù)液干燥密封，置于2-8°C冰箱備用； (2)三價(jià)銪標(biāo)記的抗a-TSH單克隆抗體的制備: 將抗a-TSH單克隆抗體，用標(biāo)記液進(jìn)行透析，取透析好的抗a-TSH單克隆抗體，用標(biāo)記液稀釋；將抗體加入到凍干的銪標(biāo)記液中緩慢搖勻后置于2_8°C冰箱中過(guò)夜；用純化柱純化2-8°C過(guò)夜的標(biāo)記液，收集標(biāo)記物，加入0.1 % BSA置于_80± 10°C冷凍保存?zhèn)溆茫? (3)β-hCG校準(zhǔn)品的制備: 用@-1^6干粉和陰性尿液配制濃度為0、15、25、37.5、50、75和100mIU/ml的β-hCG校準(zhǔn)尿液，置于_80±10°C冷凍保存?zhèn)溆茫? 所述清洗液、分析液和增強(qiáng)液為市售商品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述將抗體加入到凍干的銪標(biāo)記液中，其中抗體與銪標(biāo)記液的重量比例為(6-10):1。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述用純化柱純化2_8°C過(guò)夜的標(biāo)記液，收集標(biāo)記物具體為:取純化柱，用洗脫液洗脫平衡至少2小時(shí)，將2_8°C過(guò)夜的標(biāo)記液全部轉(zhuǎn)入柱子的頂端，重力自然洗脫，以0.25ml/管為單位進(jìn)行收集。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒在檢測(cè)β-hCG含量中的應(yīng)用，其特征在于，該檢測(cè)方法包括如下步驟: (1)將β-hCG校準(zhǔn)品和待檢樣品依次加入到抗β -hCG單克隆抗體包被的酶標(biāo)板上，再加入分析液，震蕩孵育； (2)將清洗液用去離子水進(jìn)行稀釋，然后用已稀釋的清洗液清洗酶標(biāo)板并甩干； (3)將純化好的三價(jià)銪標(biāo)記的抗a-TSH單克隆抗體，用分析液稀釋，加入酶標(biāo)板中，震蕩孵育； (4)用清洗液清洗酶標(biāo)板并甩干； (5)加入增強(qiáng)液，使用全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀檢測(cè)熒光信號(hào)； (6)根據(jù)熒光數(shù)值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待檢樣品的熒光信號(hào)代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求得待檢樣品的濃度。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK104181310SQ201410368022
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月30日
【發(fā)明者】趙金博, 張展英, 周蓓昕 申請(qǐng)人:美艾利爾（上海）診斷產(chǎn)品有限公司