一種檢測樣品中汞離子濃度的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測樣品中汞離子濃度的方法，其包括：（1）設(shè)計(jì)與合成能與汞離子特異性結(jié)合的富含T堿基的DNA探針分子；（2）將DNA探針分子與陽離子聚合物加入到緩沖液中，并向其中加入待測樣品及金納米溶液，進(jìn)行T-Hg2+-T雜交反應(yīng)；（3）金納米粒子發(fā)生聚集，體系顏色發(fā)生改變，測定相對吸光度值，確定所述待測樣品中的汞離子濃度。本發(fā)明所述方法能夠簡單、快速、準(zhǔn)確地檢測樣品中汞離子濃度。
【專利說明】—種檢測樣品中汞離子濃度的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種檢測樣品中汞離子濃度的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]核酸配子是一個(gè)單鏈的DNA或RNA分子，選擇性地綁定到各種具有高親和力的目標(biāo)物如小分子、蛋白質(zhì)和藥物等。與傳統(tǒng)的分子識別系統(tǒng)相比，寡核苷酸適配子由于容易合成而有很大的優(yōu)勢。寡核苷酸適配子容易被標(biāo)記，可以長期穩(wěn)定存儲，具有優(yōu)良的穩(wěn)定性，、廣泛的適用性，以及高敏感特性。因此，它們的優(yōu)異屬性使其在醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測、生物分析方面的應(yīng)用有很大潛力。此外核酸配子可以與陽離子聚合物由于靜電引力而吸引相互纏繞。
[0003]汞是一種劇毒的全球性環(huán)境污染物。汞離子的長時(shí)間沉積會造成土壤和水域環(huán)境的不可逆性污染，水溶性汞離子是其中最常見也是最穩(wěn)當(dāng)?shù)墓廴疚?。無機(jī)汞能夠損傷哺乳動物的心臟，腎臟，胃以及小腸系統(tǒng)，對人類的危害顯而易見。因此，對于檢測水溶性汞離子的技術(shù)的開發(fā)隨之而來。目前對汞離子的檢測主要有光譜法和電化學(xué)兩大類，但這些方法往往還需要大量的預(yù)處理，增加了很多成本，而且對操作人員有很高的技術(shù)要求，所以不能滿足社會對實(shí)際樣品檢測的日益增加的需求。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了二價(jià)的金屬汞離子能夠與核酸中的兩個(gè)胸腺嘧啶堿基(T)形成非常穩(wěn)定的T-Hg2+-T配合物結(jié)構(gòu)，基于這個(gè)重大發(fā)現(xiàn)，好多學(xué)者利用寡聚核苷酸對汞離子的特異性識別作用，分別構(gòu)建了一系列對汞離子檢測的生物傳感器，這類傳感器具有選擇性好，特異性好的優(yōu)點(diǎn)，成為最近人們研究的熱點(diǎn)。
[0004]作為現(xiàn)代四大標(biāo)記技術(shù)之一的納米金標(biāo)記技術(shù)(nanogold labellingtechique)，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到納米金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理可能是納米金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合，而且吸附后不會使生物分子變性，由于金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中。利用氯金酸還原出的納米金溶液為酒紅色，當(dāng)在其中加入少量電解質(zhì)后，誘導(dǎo)金納米顆粒團(tuán)聚，可使溶液由紅寶石色變?yōu)樗{(lán)色，并最終凝集為無色，故在其中加入適當(dāng)?shù)柠}溶液或者陽離子聚合物時(shí)會導(dǎo)致溶液顏色的變化。
[0005]但目前未有理想的以納米金標(biāo)記技術(shù)檢測樣品中汞離子濃度的技術(shù)方案。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種檢測樣品中汞離子濃度的方法，用以實(shí)現(xiàn)水中汞離子的簡單、快速、高靈敏檢測。
[0007]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
一種檢測樣品中汞離子濃度的方法，其特征在于，包括:
(I)設(shè)計(jì)與合成能與汞離子特異性結(jié)合的富含T堿基的DNA探針分子；(2)將DNA探針分子與陽離子聚合物加入到緩沖液中，并向其中加入待測樣品及金納米溶液，進(jìn)行T-Hg2+-T雜交反應(yīng)；
(3)金納米粒子發(fā)生聚集，體系顏色發(fā)生改變，測定相對吸光度值，確定所述待測樣品中的汞離子濃度。
[0008]DNA探針分子其中，所述的富含T堿基的DNA探針分子具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其相對于緩沖液的濃度為ΙΟηΜ。
[0009]其中，結(jié)合文獻(xiàn)中的合成方法，所述的金納米粒子的濃度為4.9ηΜ，直徑為15nm，其在可見光523nm處有較好的吸光度。
[0010]其中，步驟(2)所述陽離子聚合物為聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)，TODA具有較高的探測限，且能與DNA較好的結(jié)合。所述緩沖液為Tris-HCl溶液。
[0011]其中，所述聚二烯丙基二甲基氯化銨(TODA)相對于緩沖液的濃度為ΙΟηΜ，以獲得更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。
[0012]本發(fā)明所述方法對于汞離子的檢測限為不低于0.02ng/mL。優(yōu)選所述的待測樣品中汞離子濃度為0.05-10 ng/mL。
[0013]進(jìn)一步的，基于下列線性方程，確定所述樣品中汞離子的濃度:
y=0.177+0.064x, y為不同汞離子濃度下的相對吸光度值，x為相應(yīng)汞離子的濃度。由此，可以進(jìn)一步提高利用本發(fā)明方法進(jìn)行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0014]根據(jù)本發(fā)明所述的技術(shù)方案，基于體系的顏色變化，確定所述樣品中的汞離子濃度是通過將所述體系的顏色與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較而完成的，其中，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是基于已知萊離子濃度分別為 0ng/mL、0.05ng/mL、0.lng/mL、0.5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)而建立的。從而進(jìn)一步提高利用本發(fā)明方法進(jìn)行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0015]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
圖1是利用不同汞離子濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測所得到的紫外吸收曲線，其中汞離子濃度分別取 0ng/mL、0.05ng/mL、0.lng/mL、0.5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、lOOng/mL ；
圖2是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例建立的汞離子標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的特異性分析圖。

【具體實(shí)施方式】
[0017]為使實(shí)驗(yàn)傳感條件最優(yōu)化，本發(fā)明對TODA與TBA的最佳濃度做出了如下篩選試驗(yàn):
取7個(gè)小離心管，均加入500uL Tris-HCl (20 mM, pH 7.41)的緩沖液，在每個(gè)試管中加入聚二烯丙基二甲基氯化銨(^)04)，使其最終濃度分別為1、3、5、8、10、30和50 nM，然后向其中加入500uL的金納米溶液?？梢姽鈭D譜顯示，當(dāng)I3DDA的濃度為1nM時(shí)，可見光吸收值最低，金納米粒子團(tuán)聚程度最大，可知F1DDA的最優(yōu)濃度為ΙΟηΜ。再取7個(gè)離心管,均加入500uL Tris-HCl (20 mM, pH 7.41)的緩沖液和終濃度為1nM的PDDA，將TBA加入到各離心管中，使其最終濃度分別為1、3、5、8、10、30和50 nM，混合并在室溫下穩(wěn)定20min，然后向每個(gè)離心管中加入500uL的金納米溶液，由可見光吸收圖譜可知TBA的最優(yōu)濃度為ΙΟηΜ。故以下實(shí)驗(yàn)中I3DDA與TBA的濃度均選用1nM作為最優(yōu)反應(yīng)條件探測溶液中的汞離子。
[0018]實(shí)施例1設(shè)計(jì)與合成相應(yīng)的寡核苷酸片段
通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)一段能夠?qū)x子特異性識別且含T堿基的DNA片段，序列通過DNA合成儀制備。
[0019]DNA探針分子(TBA)序列:
TTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTT (SEQ ID NO:1)
實(shí)施例2金納米顆粒的合成；
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以檸檬酸鈉還原氯金酸獲得直徑為15nm的金納米粒子，獲得的金納米溶液的濃度為4.9nM，冷卻至室溫，在4°C下保存。
[0020]實(shí)施例3汞離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立；
取7個(gè)離心管，將TBA(1nM)和PDDA(1nM)加入到500uL的Tris-HCl緩沖液中，向離心管中加入汞離子，使其終濃度分別為0、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50和100 ng/mL，混合并在室溫下穩(wěn)定20min，然后向每個(gè)離心管中加入500uL的金納米溶液，在波長為558處測量可見光吸收值，根據(jù)測定的不同汞離子濃度下可見光吸收值繪制汞離子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，隨著汞離子的加入，金納米顆粒聚集度增大，從而導(dǎo)致吸光度降低，在汞離子濃度為零時(shí)，金納米溶液的吸光度為0.91 ;為使實(shí)驗(yàn)展示出較好的效果，線性比較明顯，圖2中的吸光度值為空白溶液吸光值(0.91)減去加入汞離子溶液后得到的吸光度值。本傳感器的線性范圍0.05-10ng/mL，檢測限為0.02ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.177+0.064x, y為不同汞離子濃度下校正后得到的可見光吸收值，x為相應(yīng)汞離子的濃度，線性相關(guān)性>0.98 (見圖1和圖2)
實(shí)施例4汞離子的特異性測定；
取5個(gè)小離心管，將TBA(1nM)和I3DDA(1nM)加入到500uL的Tris-HCl緩沖液中，向各離心管中分別加Hg2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+、Ni2+、Fe2+，使加入金屬離子的最終濃度為10ng/mL，混合并在室溫下反應(yīng)20分鐘，然后向每個(gè)離心管中加入500uL的金納米溶液，在波長為558處測量可見光吸收值。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知這種基于比色檢測技術(shù)的汞離子檢測傳感器具有很高的特異性(詳見圖3)。
[0021]實(shí)施例5實(shí)際含汞粒子待測樣品的測定；
向自來水樣品中分別添加0.1 ng/mL、0.5ng/mL、l ng/mL及5 ng/mL的萊離子作為待測樣品，按照實(shí)施例1所述的方法設(shè)計(jì)與合成能與汞離子特異性結(jié)合的富含T堿基的DNA探針分子，按照實(shí)施例2所述的方法制備金納米顆粒溶液；取4個(gè)離心管，在其中將TBA(1nM)和TODA(1nM)加入到500uL的Tris-HCl緩沖液中，向離心管中分別加入上述4個(gè)待測樣品，混合并在室溫下穩(wěn)定20min，然后向每個(gè)離心管中加入500uL的金納米溶液，在波長為558處測量可見光吸收值，代入實(shí)施例3所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.177+0.064x，y為不同汞離子濃度下的相對吸光度值，X為相應(yīng)汞離子的濃度)，計(jì)算汞離子濃度，結(jié)果見表I:
表1:汞離子水樣品的測定

【權(quán)利要求】
1.一種檢測樣品中汞離子濃度的方法，其特征在于，包括: (1)設(shè)計(jì)與合成能與汞離子特異性結(jié)合的富含T堿基的DNA探針分子； (2)將DNA探針分子與陽離子聚合物加入到緩沖液中，并向其中加入待測樣品及金納米溶液，進(jìn)行T-Hg2+-T雜交反應(yīng)； (3)金納米粒子發(fā)生聚集，體系顏色發(fā)生改變，測定相對吸光度值，確定所述待測樣品中的汞離子濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的富含T堿基的DNA探針分子具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的富含T堿基的DNA探針分子相對于緩沖液的濃度為ΙΟηΜ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的金納米粒子的濃度為4.9nM，直徑為 15nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)所述陽離子聚合物為聚二烯丙基二甲基氯化銨，緩沖液為Tris-HCl溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述聚二烯丙基二甲基氯化銨相對于緩沖液的濃度為ΙΟηΜ。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法對于汞離子的檢測限為不低于0.02ng/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的方法，其特征在于:所述的待測樣品中汞離子濃度為0.05-10 ng/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:基于下列線性方程，確定所述樣品中汞離子的濃度: y=0.177+0.064x, y為不同汞離子濃度下的相對吸光度值，x為相應(yīng)汞離子的濃度。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的方法，其特征在于:所述的相對吸光度值在波長558處測量得到。
【文檔編號】G01N21/78GK104076004SQ201410339731
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】朱穎越, 蔡義林, 丁鑫, 王立梅, 齊斌 申請人:常熟理工學(xué)院