一種測定藍藻蓄積無機正磷酸鹽的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定藍藻蓄積無機正磷酸鹽的方法，采集所需測定藻液適量，離心得沉淀物，加入適量去離子水混勻，恒溫水浴2h，使得藻細胞與膠鞘分離，得均勻藻液，加入三氯乙酸抽提，取上清液，調(diào)節(jié)pH至中性，測定正磷酸鹽濃度。本方法可以可以快速的測定具有厚膠被的藍藻如群體微囊藻和藍藻水華樣品所蓄積的正磷酸鹽含量，而且只測定正磷酸鹽的蓄積量，避免了藻體中有機磷和聚磷顆粒對測定正磷酸鹽量的影響。采用本方法測定藍藻蓄積正磷酸鹽濃度，簡單易行，適應(yīng)范圍廣。
【專利說明】一種測定藍藻蓄積無機正磷酸鹽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及測定藍藻或藍藻水華樣品中所蓄積的無機正磷酸鹽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]富營養(yǎng)化已成為我國大多數(shù)淡水水體面臨的環(huán)境問題，藍藻水華的頻繁發(fā)生是富營養(yǎng)湖泊的一個重要特征。磷與浮游植物生物量之間存在顯著的相關(guān)性，所以磷被認為是湖泊水體中藻類種群和密度的第一限制性元素。為適應(yīng)磷限制環(huán)境，部分藍藻已發(fā)展出一些適應(yīng)機制，其一就是能吸收過量的磷儲存在細胞內(nèi)。藍藻具有蓄積磷的能力是其在磷限制水體中占優(yōu)勢的原因之一，研究藍藻對于磷的蓄積行為對于揭示藍藻水華發(fā)生機理及其防治有著重要意義。
[0003]國內(nèi)外學者針對于藍藻對磷吸收的問題開展了廣泛的研究。在研究藍藻對磷代謝和蓄積行為過程中，需要測定藻體的各種磷形態(tài)。正磷酸鹽是唯一能被藻類吸收利用的磷形態(tài)，因此對于藍藻蓄積的正磷酸鹽量的測定也是必不可少的研究內(nèi)容之一。關(guān)于測定藻體蓄積的磷，目前文獻報道的方法主要有消解的方法測定細胞內(nèi)磷(易文利等，不同質(zhì)量濃度的磷對銅綠微囊藻生長及細胞內(nèi)磷的影響，環(huán)境科學研究，2004)，三氯乙酸抽提的方法(楊柳燕等，銅綠微囊藻磷代謝過程研究，農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2005),無機酸抽提和直接顯色的方法等(張勝花等，不同氮磷營養(yǎng)條件下銅綠微囊藻對正磷酸鹽的蓄積效果，長江流域資源與環(huán)境，2008)測定藻體蓄積正磷酸鹽。消解的方法即將藻液加入過硫酸鉀溶液，置于121°C的高壓鍋中消解，冷卻后測定其中正磷酸鹽含量。三氯乙酸抽提和無機酸抽提的方法分別是將適量藻液加入三氯乙酸或無機酸進行抽提，抽提后的藻液過濾得上清液，調(diào)為中性后測定其中正磷酸鹽含量。直接顯色法，是指取藻液適量，加入抗壞血酸和鑰酸鹽顯色劑，顯色后離心測定吸光度值，換算成正磷酸鹽濃度。在對單細胞銅綠微囊藻的相關(guān)研究中，對比所列幾種方法，采用消解的方法，藻體內(nèi)的有機磷被消解，所測得的正磷酸鹽濃度值要比其他的兩種方法大，但又無法區(qū)分其中有機磷的量，所以消解的方法不能真實反應(yīng)藻類蓄積正磷酸鹽的量。采用無機酸抽提與有機酸抽提的結(jié)果無顯著性差異&>0.05)，說明無機酸抽提法可以應(yīng)用于對室內(nèi)單細胞藻類蓄積的正磷酸的提取。直接顯色法測定的結(jié)果與三氯乙酸抽提法和無機酸抽提法測定的結(jié)果一致，說明對于單細胞銅綠微囊藻可以采用直接顯色法測定其蓄積的正磷酸鹽濃度(張勝花等，不同氮磷營養(yǎng)條件下銅綠微囊藻對正磷酸鹽的蓄積效果，長江流域資源與環(huán)境，2008)。
[0004]雖然，對于類似單細胞銅綠微囊藻這樣的藍藻，現(xiàn)有方法已經(jīng)可以解決測定藻體正磷酸鹽濃度的問題，但野外水體中存在的一些藻類往往具有較厚的膠鞘(如群體銅綠微囊藻)，此時采用無機酸和有機酸抽提的方法，無法破壞其外部的膠鞘層，從而蓄積的磷無法釋放出來，而采用消解的方法所測定的是藻體蓄積的磷以及作為藻細胞組成的有機磷，因此無法正確得出蓄積磷量。針對上述不足，進一步開發(fā)藍藻正磷酸鹽蓄積量的測定方法十分必要。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有的藍藻蓄積正磷酸鹽的測定方法不能廣泛用于測定野外藍藻水華或類似具有較厚膠鞘的藻體實際蓄積正磷酸鹽量的不足，本發(fā)明提供一種測定藍藻蓄積正磷酸鹽的方法，測定方法簡單，適應(yīng)范圍廣。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:采集所需測定藻液，離心后，加入適量水混勻，水浴，加入三氯乙酸抽提，取上清液，測定正磷酸鹽濃度。具體通過以下步驟實現(xiàn):
第一步，采集所需測定的藻液適量，12 000 r X mirT1,10°C離心15min,棄去上清液，得濃縮藻液。
[0007]第二步，將濃縮藻液加入5mL去離子水混勻后，于控溫精確的水浴鍋中30°C水浴2h，使得藻細胞與外在膠被分離，得均勻藻液。
[0008]第三步，將上述均勻藻液，加入ImL 10%三氯乙酸抽提10 min后，12 000r XmirT1，10°C離心15 min,取上清液，加入一滴酚酞，加NaOH直到溶液呈粉紅色，然后加一滴H2SO4使溶液呈無色，得呈中性的待測溶液。
[0009]第四步，將待測溶液加去離子水稀釋到10 mL，加入0.2 mL抗壞血酸溶液后加入0.4 mL鑰酸鹽顯色劑,顯色15 min,于分光光度計700 nm處測定吸光度值。對比磷標準曲線，換算成磷濃度。
[0010]本方法的優(yōu)點:
本發(fā)明提供了一種測定藍藻蓄積正磷酸鹽的方法，同現(xiàn)有的測定方法相比，具有以下優(yōu)點:
1、本方法可以快速的測定具有厚膠被的藍藻如群體微囊藻和藍藻水華樣品所蓄積的正磷酸鹽含量；
2、本方法可以只測定正磷酸鹽的蓄積量，避免了藻體中有機磷和聚磷顆粒對測定正磷酸鹽量的影響。
【具體實施方式】
[0011]下面通過幾個具體的實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0012]實施例1:采用MIII培養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)單細胞銅綠微囊藻(FACHB905)，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)12天后，分別采用消解法、傳統(tǒng)三氯乙酸抽提法和本方法測定蓄積的正磷酸鹽含量。具體步驟為，取3份2 mL單細胞銅綠微囊藻藻液,12 000 rXmirT1離心15 min,棄上清液,得3份沉淀物。一份用5 mL蒸餾水取出，加入ImL 5%過硫酸鉀，121°C消化30min，得待測液A。一份加I mL 10%三氯乙酸抽提，12 000 rXmirT1離心15 min,取上清液后加入酹酞一滴,力口NaOH直到溶液呈粉紅色，然后加一滴H2SO4使溶液呈無色，得呈中性的待測溶液B。一份加去離子水5 mL，30°C水浴2h后，加Iml 10%三氯乙酸抽提，12 000 rXmirT1離心15分鐘，取上清液后加入酚酞一滴，加NaOH直到溶液呈粉紅色，然后加一滴H2SO4使溶液呈無色，得呈中性的待測溶液C。將待測溶液A、B和C放入10 mL比色管，加水至10 mL，加入0.25 mL10%抗壞血酸和0.4 mL鑰酸鹽溶液后，顯色15 min，在可見光700 nm處，用721分光光度計比色測定溶液正磷酸鹽含量。實驗平行三次，根據(jù)藻體積換算成藻液中磷濃度。
[0013]測定結(jié)果如表I所示，單細胞銅綠微囊藻蓄積正磷酸鹽采用本方法與傳統(tǒng)三氯乙酸抽提法無顯著性差異(ρ>0.05)，而消解法測得值與本方法和傳統(tǒng)三氯乙酸抽提法之間存在顯著性差異(/7〈0.01)。
[0014]表1、三種方法測定單細胞銅綠微囊藻蓄積磷量比較
實施例2:采用MIII培養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)群體微囊藻(FACHB 1178)，分別采用消解法、傳統(tǒng)三氯乙酸抽提法和本方法測定蓄積的正磷酸鹽含量。具體步驟為，取3份2 mL單細胞銅綠微囊藻藻液，12 000 rXmirT1離心15 min,棄上清液,得3份沉淀物。一份用5 mL蒸懼水取出，加入ImL 5%過硫酸鉀，121°C消化30min，得待測液A’。一份加I mL 10%三氯乙酸抽提，12 000 rXmirT1離心15 min，取上清液后加入酚酞一滴，加NaOH直到溶液呈粉紅色，然后加一滴H2SO4使溶液呈無色，得呈中性的待測溶液B’。一份加去離子水5 mL, 30°C水浴2h后，加Iml 10%三氯乙酸抽提，12 000 r XmirT1離心15分鐘，取上清液后加入酚酞一滴，加NaOH直到溶液呈粉紅色，然后加一滴H2SO4使溶液呈無色，得呈中性的待測溶液C’。將待測溶液A’、B’和C，放入10 mL比色管，加水至10 mL，加入0.25 mL 10%抗壞血酸和0.4 mL鑰酸鹽溶液后，顯色15 min，在可見光700 nm處，用721分光光度計比色測定溶液正磷酸鹽含量。實驗平行三次，根據(jù)藻體積換算成藻液中磷濃度。
[0015]測定結(jié)果如表2所示，消解法、傳統(tǒng)三氯乙酸抽提法和本方法所測蓄積磷量之間皆有顯著性差異(/7〈0.01)。群體銅綠微囊藻蓄積正磷酸鹽采用傳統(tǒng)三氯乙酸抽提法無法破壞膠被，很難提取出蓄積的正磷酸鹽，而本方法可以通過剝離群體微囊藻細胞外膠被后再用三氯乙酸抽提出所蓄積的正磷酸鹽。消解法因為同時包含了藻體所含有機磷和聚磷顆粒，因而測得值與本方法之間存在顯著性差異(ρ<0.01)。
[0016]表2、三種方法測定單細胞銅綠微囊藻蓄積磷量比較
【權(quán)利要求】
1.一種測定藍藻蓄積無機正磷酸鹽的方法，其特征在于含有以下步驟: 第一步，采集所需測定的藻液適量，12000 r X mirT1,10°C離心15min,棄去上清液,得濃縮藻液； 第二步，將濃縮藻液加入5mL去離子水混勻后，水浴，使得藻細胞與外在膠被分離，得均勻藻液； 第三步，將上述均勻藻液，加入ImL 10%三氯乙酸抽提10 min后，12 000 r X mirT1，10°C離心15 min,取上清液，加入一滴酚酞，加NaOH直到溶液呈粉紅色，然后加一滴比304使溶液呈無色，得呈中性的待測溶液； 第四步，將待測溶液加去離子水稀釋到10 mL，加入0.2 mL抗壞血酸溶液后加入0.4 mL鑰酸鹽顯色劑，顯色15 min，于分光光度計700 nm處測定吸光度值； 對比磷標準曲線，換算成磷濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的一種測定藍藻蓄積無機正磷酸鹽的方法，其特征在于第二步，待測藻液水浴條件為置于精確控溫30°C下水浴2h，得到藻細胞與外在膠被分離的均勻溶液。
【文檔編號】G01N21/31GK103969205SQ201410230844
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】張勝花, 張賽男, 趙靜 申請人:云南大學