一種pgi和pgii聯(lián)合檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種PGI和PGII聯(lián)合檢測試劑盒，屬于體外診斷試劑領(lǐng)域。本發(fā)明試劑盒主要由以下部分組成：包被有抗PGI抗體的微孔板、包被有抗PGII抗體的微孔板、酶標(biāo)抗體、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液。運(yùn)用酶聯(lián)免疫一步法快速檢測技術(shù)，量程寬、樣本需求量少、靈敏度高達(dá)0.1μg/L；并且使用高特異性的抗體和抗原使PGI和PGII的檢測試劑實(shí)現(xiàn)整合通用，使試劑盒的整個(gè)檢測時(shí)間比同類別的檢測試劑縮短45-60分鐘；最終實(shí)現(xiàn)操作簡單和快速檢測，便于臨床使用。
【專利說明】—種PGI和PGM聯(lián)合檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種PGI和PGII聯(lián)合檢測試劑盒，尤其是通過酶聯(lián)免疫一步法聯(lián)合檢測PGI和PGII的試劑盒，屬于體外診斷試劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]胃癌是全球高危死亡率的第二大疾病，嚴(yán)重威脅著人類健康。胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,死亡率局各種惡性腫瘤前列，全球每年934，000新發(fā)胃癌病例，42% (近40萬)的新發(fā)病例數(shù)在我國，胃癌在我國的患病率和死亡率均是世界水平的2倍多。其早期診斷、早期治療是提高患者生存質(zhì)量、降低死亡率的唯一途徑，改善胃癌患者預(yù)后的關(guān)鍵是作好二級(jí)預(yù)防，血清胃蛋白酶原(PG)檢測可以作為胃癌篩查“二步法”中的初篩方法。聯(lián)合測定P G I和P G II的水平及其比值可起到胃黏膜“血清學(xué)活檢”的作用，有利于胃癌的預(yù)防干預(yù)、早期診斷以及術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測。近年來，血清PG含量的變化與胃癌及其他胃部疾病的關(guān)系及其作為初篩手段在胃癌篩查中的應(yīng)用已引起越來越多研究者的關(guān)注。
[0003]PG是一種門冬氨酸蛋白酶前體，是分子質(zhì)量為42KDa的單鏈多肽。人類PG依其電泳遷移率可以分為7個(gè)組分，1-5組分的免疫原性相同，成為PGI，主要由胃腺的主細(xì)胞和黏液頸細(xì)胞分泌；組分6-7被稱為PGII，除由胃體和胃底黏膜的泌酸腺的主細(xì)胞分泌外，泌酸腺的黏液頸細(xì)胞、賁門腺和胃竇的幽門腺的黏液細(xì)胞以及十二指腸上段的Brunner腺也能產(chǎn)生PGII。由于胃幾乎是PG的唯一來源，并且在分泌階段的分泌量會(huì)發(fā)生變化，因此，血清PGI和PGII不僅反映了胃黏膜腺體和細(xì)胞的數(shù)量，也間接反映了胃黏膜不同部位的分泌功倉泛。
[0004]通常情況下約有I %的PG通過胃黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)入血液循環(huán)的PG在血液中非常穩(wěn)定。血清PG水平是反映胃黏膜形態(tài)和功能的良好指標(biāo)。大部分酶原進(jìn)入胃腔，經(jīng)酸解成具有活性的胃蛋白酶發(fā)揮其消化蛋白質(zhì)的作用。但也有少量透過胃黏膜毛細(xì)血管進(jìn)入血液，可從血清中檢測。當(dāng)胃粘膜發(fā)生病變時(shí)，血清中PG的含量也隨之發(fā)生改變。血清PG含量的變化與胃癌及其他胃部疾病的關(guān)系及其作為初篩手段在胃癌篩查中的應(yīng)用已引起越來越多研究者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)體檢中大約有15%左右的人的血清PG水平異常，而進(jìn)一步進(jìn)行胃鏡檢查，其中90%以上的患者有不同程度的淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、萎縮性胃炎、胃癌等胃部疾病。近年來，血清PG含量的變化與胃癌及其他胃部疾病的關(guān)系及其作為初篩手段在胃癌篩查中的應(yīng)用已引起越來越多研究者的關(guān)注。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種PGI和PGII聯(lián)合檢測試劑盒。所述試劑盒利用抗原抗體特異性反應(yīng)來檢測血清中PGI和PGII的含量，主要由以下部分組成:包被有PGI抗體的微孔板、包被有PGII抗體的微孔板、酶標(biāo)抗體、校準(zhǔn)品、底物液、終止液、濃縮洗滌液。[0006]所述試劑盒還包括質(zhì)控品、封板膜和說明書。
[0007]所述PGI抗體和PGII抗體是利用PGI和PGII抗原蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體得到，或直接購買商業(yè)化PGI抗體和PGII抗體產(chǎn)品。所述PGI和PGII抗原蛋白是通過基因工程克隆表達(dá)得到的蛋白。
[0008]所述分別包被有PGI抗體、PGII抗體的微孔板的制備:
[0009](I)包被:用包被機(jī)或移液器將包被液按100 μ I/孔加入微孔板，封板膜封閉微孔板，放置于4°C冰箱過夜,用洗板機(jī)、稀釋至0.025M的濃縮洗漆液洗板5次；所述包被液包括PGI包被液和PGII包被液，PGI包被液是將PGI抗體用包被緩沖液配制成0.5 μ g/ml濃度，攪拌混勻；PGII包被液是將PGII抗體用包被緩沖液配制成0.5 μ g/ml濃度，攪拌混勻；所述微孔板是96孔板；
[0010](2)封閉:用包被機(jī)或移液器將封閉液按300 μ I/孔加入微孔板；封板膜封閉微孔板，放置于37°C封閉I小時(shí)；用洗板機(jī)、稀釋至0.025M的濃縮洗漆液洗板5次；
[0011](3)真空包裝:將經(jīng)上述處理后的微孔板放置于37°C烘箱干燥0.5小時(shí)；立即用真空封裝機(jī)進(jìn)行真空包裝。
[0012]所述酶標(biāo)抗體為PGI和PGII抗體標(biāo)記的辣根過氧化物酶，使用酶標(biāo)抗體效價(jià)為100IU/ml,酶標(biāo)抗體稀釋液是含有0.5% (m/v)酪蛋白、1% (m/v)鹿糖、0.01% (m/v)疊氮鈉的0.1M的磷酸鹽緩沖液，pH7.4。
[0013]所述校準(zhǔn)品為用校準(zhǔn)品稀釋液配制的不同濃度PGI和PGII抗原蛋白溶液，校準(zhǔn)品濃度范圍:PGI為0-180 μ g/L，PGII為0_50 μ g/L ;所述校準(zhǔn)品稀釋液是含有I μ g/ml牛乳糖、3% (m/v)甘露醇、I % (m/v)鹿糖、I %麥芽糖(m/v)、I % 山梨醇(m/v)、0.01 % (m/v)疊氮鈉的0.0lM的磷酸鹽緩沖液，pH7.4。
[0014]所述質(zhì)控品是用質(zhì)控品稀釋液配制的PGI:60.0 μ g/L, PGI1: 16.0 μ g/L，所述質(zhì)控品稀釋液是含有I μ g/ml牛乳糖、3% (m/v)甘露醇、1% (m/v)蔗糖、1% (m/v)麥芽糖、1% (m/v)山梨醇、0.01% (m/v)疊氮鈉的0.0lM的磷酸鹽緩沖液，pH7.4。
[0015]所述底物液的組成為:0.2mg/ml過氧化脲，0.1M檸檬酸緩沖液，0.5mg/ml3, 3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，0.01% (v/v) 二甲基亞砜(DMSO)，ρΗ5.5。
[0016]所述終止液為2Μ的硫酸。
[0017]所述濃縮洗滌液的組成為:0.5Μ磷酸鹽緩沖液，2.0% (m/v)十二烷基硫酸鈉，ρΗ7.4。
[0018]應(yīng)用所述試劑盒檢測血清PGI和PGII濃度的方法為:將檢測樣本和酶標(biāo)抗體在微孔板中進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)，然后用洗滌液洗板，再向微孔板中加入底物液(顯色劑)顯色反應(yīng)，最后加入終止液測定450nm吸光值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較、計(jì)算得到血清PGI和PGII含量。
[0019]所述應(yīng)用方法優(yōu)選以下步驟:(I)首先在微孔板反應(yīng)孔中依次加入10 μ I樣本和90 μ I酶標(biāo)抗體，混勻；(2)37°C孵育45分鐘；(3)用稀釋至0.025M的濃縮洗滌液洗板5次，扣干；⑷加入底物液100 μ 1，蓋上封板膜，37°c溫育避光顯色15分鐘；(5)加入終止液50 μ 1，然后立即用酶標(biāo)儀測定450nm吸光值；(6)以PGI和PGII校準(zhǔn)品檢測吸光度值為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)濃度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行二次方程擬合，分別得到PGI和PGII標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將樣本檢測PGI和PGII吸光度值分別代入PGI和PGII標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本PGI和PGII濃度值；(7)檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為:PGI正常值范圍40?158 μ g/L，PGII正常值范圍O?16 μ g/L0
[0020]本發(fā)明提供的PGI和PGII聯(lián)合檢測試劑盒，運(yùn)用酶聯(lián)免疫一步法快速檢測技術(shù)，運(yùn)用特殊包被液制備的微孔板和加速抗原抗體反應(yīng)的酶標(biāo)抗體稀釋液，量程寬，能不稀釋血清樣本直接檢測；樣本需求量少，一次上樣只需要50 μ 1，比目前市場上同類產(chǎn)品上樣量減少一倍；靈敏度高達(dá)0.1 μ g/L ;并且實(shí)現(xiàn)了 PGI和PGII的檢測試劑整合通用，使試劑盒的整個(gè)檢測時(shí)間比同類別的檢測試劑縮短45-60分鐘，克服了 PGI和PGII抗體之間交叉反應(yīng)的問題；此外，本發(fā)明試劑盒的96微孔板能同時(shí)檢測96個(gè)樣品，適合大批量檢測。本發(fā)明試劑盒操作簡單、檢測快速，成本低，便實(shí)用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1:PGI/II聯(lián)合檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫一步法)的組成示意圖；1，校準(zhǔn)品1-校準(zhǔn)品5 ;2，質(zhì)控品；3，酶標(biāo)抗體；4，終止液；5，底物液；6，濃縮洗滌液；7，胃蛋白酶原I微孔板；8，胃蛋白酶原II微孔板。
[0022]圖2:PGI/II聯(lián)合檢測試劑盒胃蛋白酶原I標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0023]圖3:PGI/II聯(lián)合檢測試劑盒胃蛋白酶原II標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1試劑盒的制備
[0025]1.溶液配制
[0026]a)包被緩沖液:0.1M碳酸鹽緩沖液(ρΗ9.6)；
[0027]b)封閉液:0.1M磷酸鹽緩沖液，1.0% (m/v)牛血清白蛋白(BSA)，0.5% (m/v)酪蛋白，PH7.4 ;
[0028]c)濃縮洗滌液:0.5M磷酸鹽緩沖液，2.0% (m/v)十二烷基硫酸鈉，pH7.4 ；
[0029]d)酶標(biāo)抗體稀釋液:0.1M Tris鹽酸緩沖液，pH8.5 ；
[0030]e)底物液:0.2mg/ml過氧化脲，0.1M檸檬酸緩沖液，0.5mg/ml3, 3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，0.01% (v/v) 二甲基亞砜(DMSO)，ρΗ5.5 ；
[0031]f)終止液:2Μ硫酸；
[0032]g)校準(zhǔn)品稀釋液:0.1M PBS, pH7.4。
[0033]2.微孔板制備
[0034]2.1包被液配制
[0035](I) PGI包被液:PGI抗體用包被緩沖液配制成0.5 μ g/ml濃度，攪拌混勻。
[0036](2)PGII包被液:PGII抗體用包被緩沖液配制成0.5 μ g/ml濃度，攪拌混勻。
[0037]2.2 包被
[0038](I)將PG1、PGII包被液按100 μ I/孔加入微孔板；
[0039](2)封板膜封閉微孔板,放置于4°C冰箱過夜(16-18小時(shí));
[0040](3)用20倍稀釋的濃縮洗滌液洗板5次。
[0041]2.3 封閉
[0042](I)用包被機(jī)或移液器將封閉液按300 μ I/孔加入微孔板；
[0043](2)封板膜封閉微孔板,放置于37°C封閉I小時(shí)；[0044](3)用20倍稀釋的濃縮洗滌液洗板5次。
[0045]2.4真空包裝
[0046](I)將上述處理后的微孔板放置于37°C烘箱干燥0.5小時(shí)；
[0047](2)立即用真空封裝機(jī)進(jìn)行真空包裝。
[0048]3.分裝
[0049](I)酶標(biāo)抗體分裝:用自動(dòng)灌裝機(jī)按照20.0ml/瓶，灌裝于30ml白色塑料瓶中，并隨灌裝進(jìn)行及時(shí)旋上瓶蓋；[0050](2)底物液分裝:用自動(dòng)灌裝機(jī)按照20.0ml/瓶，灌裝于30ml棕色塑料瓶中，并隨灌裝進(jìn)行及時(shí)旋上瓶蓋；
[0051](3)濃縮洗滌液分裝:用自動(dòng)灌裝機(jī)按照50.0ml/瓶，灌裝于50ml白色塑料瓶中，并隨灌裝進(jìn)行及時(shí)旋上瓶蓋；
[0052](4)終止液分裝:用自動(dòng)灌裝機(jī)按照12.0ml/瓶，灌裝于15ml白色塑料瓶中，并隨灌裝進(jìn)行及時(shí)旋上瓶蓋；
[0053](5)校準(zhǔn)品分裝:取大小適用的5個(gè)容器，配制濃度點(diǎn)依次為0.0、30.0、70.0、120.0、180.0 μ g/L的校準(zhǔn)品，用自動(dòng)灌裝機(jī)按照0.6ml/瓶，灌裝于1.8ml白色塑料瓶中，并隨灌裝進(jìn)行及時(shí)旋上瓶蓋；
[0054](6)質(zhì)控品分裝:配制PGI:60.0 μ g/L, PGI1:16.0 μ g/L的質(zhì)控品，用自動(dòng)灌裝機(jī)按照0.6ml/瓶，灌裝于1.8ml白色塑料瓶中，并隨灌裝進(jìn)行及時(shí)旋上瓶蓋；
[0055]4.試劑盒組裝
[0056]將各組按照下表的進(jìn)行組合，即為PGI/II聯(lián)合檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫一步法)。
[0057]表1PGI/II聯(lián)合檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫一步法)組成成分
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種PGI和PGII聯(lián)合檢測試劑盒，其特征在于，主要由以下部分組成:包被有PGI抗體的微孔板、包被有PGII抗體的微孔板、酶標(biāo)抗體、校準(zhǔn)品、底物液、終止液、濃縮洗滌液；所述酶標(biāo)抗體為PGI和PGII抗體標(biāo)記的辣根過氧化物酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括質(zhì)控品、封板膜和說明書。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述PGI抗體和PGII抗體是利用PGI和PGII抗原蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體得到，或直接購買商業(yè)化PGI抗體和PGII抗體產(chǎn)品；所述PGI和PGII抗原蛋白是通過基因工程克隆表達(dá)得到的蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述分別包被有PGI抗體、PGII抗體的微孔板的制備步驟如下: (1)包被:將包被液按100μ I/孔加入微孔板，封板膜封閉微孔板，放置于4°c冰箱過夜，用稀釋至0.025M的濃縮洗滌液洗板5次；所述包被液包括PGI包被液和PGII包被液，PGI包被液是將PGI抗體用包被緩沖液配制成0.5 μ g/ml濃度，攪拌混勻；PGII包被液是將PGII抗體用包被緩沖液配制成0.5 μ g/ml濃度，攪拌混勻； (2)封閉:將封閉液按300μ I/孔加入微孔板；封板膜封閉微孔板，放置于37°C封閉I小時(shí)；用稀釋至0.025M的濃縮洗滌液洗板5次； (3)真空包裝:將經(jīng)上述處理后的微孔板放置于37°C烘箱干燥0.5小時(shí)；立即用真空封裝機(jī)進(jìn)行真空包裝。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)抗體效價(jià)為100IU/ml，酶標(biāo)抗體稀釋液是含有0.5% (m/v)酪蛋白、1% (m/v)鹿糖、0.01% (m/v)疊氮鈉的0.1M的磷酸鹽緩沖液，PH7.4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述校準(zhǔn)品為用校準(zhǔn)品稀釋液配制的不同濃度PGI和PGII抗原蛋白溶液，校準(zhǔn)品濃度范圍:PGI為0-180 μ g/L，PGII為0_50 μ g/L ;所述校準(zhǔn)品稀釋液是含有I μ g/ml牛乳糖、3% (m/v)甘露醇、I % (m/v)蔗糖、I %麥芽糖(m/v)、l%山梨醇(m/v) >0.01% (m/v)疊氮鈉的0.0lM的磷酸鹽緩沖液，pH7.4。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述底物液的組成為:0.2mg/ml過氧化脲、0.1M檸檬酸緩沖液、0.5mg/ml3, 3’，5，5’ _四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、0.01% (v/v) 二甲基亞諷，pH5.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述終止液為2M的硫酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液的組成為:0.5M磷酸鹽緩沖液，2.0% (m/v)十二烷基硫酸鈉，pH7.4。
10.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述試劑盒檢測血清PGI和PGII含量的方法，其特征在于，是將檢測樣本和酶標(biāo)抗體在微孔板中進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)，然后用洗滌液洗板，再向微孔板中加入底物液反應(yīng)，最后加入終止液測定450nm吸光值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較、計(jì)算得到血清PGI和PGII含量。
【文檔編號(hào)】G01N33/535GK103995127SQ201410191707
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】楊雷, 劉揚(yáng), 劉琴, 代麗 申請人:無錫宜偌維盛生物技術(shù)有限公司