篩選體外血漿中h7n9生物標記物的方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種篩選體外血漿中H7N9生物標記物的方法及其應用。1）制備多例H7N9患者的血漿樣本，2）檢測血漿樣本的細胞因子及趨化因子，獲得細胞因子及趨化因子的數(shù)據(jù)，3）比較H1N1患者、健康對照血漿中的細胞因子及趨化因子，分析處理數(shù)據(jù)，獲得H7N9生物標記物，4）從步驟3）所述的H7N9生物標記物中確定死亡風險的生物標記物。本發(fā)明從免疫分子角度對H7N9患者的細胞因子及趨化因子進行檢測分析，從而建立有效的H7N9免疫分子圖譜，并將其用于體外評估H7N9患者死亡風險。該方法的靈敏度及特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測方法。
【專利說明】篩選體外血漿中H7N9生物標記物的方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測【技術領域】，尤其涉及新的免疫標志物-H7N9患者血漿細胞因子及趨化因子，可在體外檢測H7N9患者死亡的風險。
【背景技術】
[0002]人禽流感病毒依據(jù)禽甲型流感病毒外膜血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前已發(fā)現(xiàn)并確定為17個H亞型(H1?H17)和10個N亞型(NI?N10)。上述H亞型和N亞型相互組合形成了上百種不同HxNx亞型的禽甲型流感病毒，禽類特別是水禽一般是這些流感病毒的自然宿主，且主要在禽類中存在和傳播流行。
[0003]2013年以前H7N9亞型流感病毒僅在禽類中發(fā)現(xiàn)，在荷蘭、日本及美國等地曾發(fā)生過禽間暴發(fā)疫情，但未發(fā)現(xiàn)過人感染情況。2013年3月底，新型的H7N9亞型禽流感病毒在上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)。從2013年4月至2014年3月7日，全國人感染H7N9禽流感確診病例總計384例，其中死亡100例。之前報道的111例患者中，76.6%的患者收住ICU治療，其中有70%的患者發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征?；颊咂骄挲g為61歲，65歲以上患者比例達42.3%，31.5%患者為女性。盡管進行了綜合的治療，患者死亡率仍高達27%。
[0004]H7N9感染者外周血中存在高細胞因子血癥。據(jù)報道H5N1感染患者的血中也存在高細胞因子血癥。然而，尚無預測疾病嚴重程度及預后的生物標志物報道。重癥H7N9感染者死亡率高，盡管迫切需要預測潛在致命禽流感感染的疾病進展及預后的生物標志物，但是目前尚無公開的報道。
[0005]液相芯片，也稱為微球體懸浮芯片，是基于xMAP技術的生物芯片技術平臺，它是在不同熒光編碼的微球上進行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結合反應及核酸雜交反應，通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達到定性和定量的目的，一個反應孔內可以完成多達100種不同的生物學反應，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測技術平臺。

【發(fā)明內容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供篩選體外血漿中H7N9生物標記物的方法及其應用。本發(fā)明建立了一套有效的方法，用于在分離的血漿中體外檢測H7N9患者細胞因子及趨化因子水平用以評估H7N9患者死亡的風險，即通過測定H7N9患者、HlNl患者及健康對照組的細胞因子及趨化因子，進行差異分析，尋找新的免疫標志物，從而對H7N9患者進行更全面的早期篩查和檢測。
[0007]本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案如下所述。
[0008]一種篩選體外血漿中H7N9生物標記物的方法，包括下列步驟:
O制備多例H7N9患者的血漿樣本，
2)檢測血漿樣本的細胞因子及趨化因子，獲得細胞因子及趨化因子的數(shù)據(jù)，
3)比較HlNl患者、健康對照血漿中的細胞因子及趨化因子，分析處理數(shù)據(jù)，獲得H7N9生物標記物，
4)從步驟3)所述的H7N9生物標記物中確定死亡風險的生物標記物 步驟2)所述的檢測采用液相芯片技術。
[0009]步驟3)所述的分析處理數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行處理。
[0010]步驟3)所述的H7N9生物標記物為至少包括以下生物標記物中多種的組合，所述的生物標記物選自 MIF、SCF、MCP-U HGF, SCGF-beta、IL-18、IP-1O 及 IFN- Y。
[0011]一種H7N9疾病的嚴重程度的評估方法、監(jiān)測疾病進展或評價治療的方法，通過定量或定性比較患者與正常對照的H7N9生物標記物得知疾病嚴重程度，或者監(jiān)測疾病進展，或者評價治療。
[0012]所述的H7N9生物標記物為至少包括以下生物標記物中多種的組合，所述的生物標記物選自 MIF、SCF、MCP-1、HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-10 及 IFN-Y。
[0013]一種評估H7N9疾病嚴重程度的試劑盒，主要在于定量檢測H7N9生物標記物。
[0014]所述的H7N9生物標記物為至少包括以下生物標記物中多種的組合，所述的生物標記物選自 MIF、SCF、MCP-1、HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-10 及 IFN-Y。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:由于本發(fā)明應用液相芯片技術，從免疫分子角度對H7N9患者的細胞因子及趨化因子進行檢測分析，從而建立有效的H7N9免疫分子圖譜，并將其用于體外評估H7N9患者死亡風險。該方法的靈敏度及特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0017]圖1 (A)是比較6例健康對照組、21例HlNl患者細胞因子/趨化因子水平；
圖1 (B)是比較6例健康對照組、21例HlNl患者與46例H7N9患者細胞因子/趨化因子水平；
其中，圖1 (A)和圖1 (B)中，
a:對照組與HlNl患者發(fā)病第I周組比較，
b:對照組與HlNl患者發(fā)病第2周組比較，
c:對照組與HlNl患者發(fā)病15天后組比較，
d: HlNl患者發(fā)病第I周組與發(fā)病第2周組比較，
e: HlNl患者發(fā)病第I周組與發(fā)病15天后組比較，
f: HlNl患者發(fā)病第2周組與發(fā)病15天后組比較，
g:對照組與H7N9患者發(fā)病第I周組比較，
h:對照組與H7N9患者發(fā)病第2周組比較，
i:對照組與H7N9患者發(fā)病15天后組比較，
j: H7N9患者發(fā)病第I周組與發(fā)病第2周組比較比較，
k: H7N9患者發(fā)病第I周組與發(fā)病15天后組比較，
I: H7N9患者發(fā)病第2周組與發(fā)病15天后組比較， m: HlNl患者發(fā)病第I周組與H7N9患者發(fā)病第I周組比較， n: HlNl患者發(fā)病第2周組與Η7Ν9患者發(fā)病第2周組比較，
O: HlNl患者發(fā)病15天后組與Η7Ν9患者發(fā)病15天后組比較；圖2是與H7N9感染者CT值高度相關的細胞因子/趨化因子；
圖3是與H7N9感染者APACHE II評分高度相關的細胞因子/趨化因子；
圖4是與H7N9患者預后相關的細胞因子/趨化因子；
圖5是H7N9患者發(fā)病第二周血漿MIF的ROC曲線；
圖6是H7N9患者發(fā)病第二周血漿SCF的ROC曲線；
圖7是H7N9患者發(fā)病第二周血漿MCP-1的ROC曲線表；
圖8是H7N9患者發(fā)病第二 周血漿HGF的ROC曲線表；
圖9是H7N9患者發(fā)病第二周血漿SCGF-beta的ROC曲線表；
圖10是H7N9患者發(fā)病第二周血漿IP-10的ROC曲線表；
圖11是H7N9患者發(fā)病第二周血漿IL-18的ROC曲線表；
圖12是H7N9患者發(fā)病第二周血漿IFN-gamma的ROC曲線表；
圖13是H7N9患者發(fā)病第二周CRP的ROC曲線表；
圖14是H7N9患者發(fā)病第二周Pa02/Fi02的ROC曲線。
【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明的具體方案由以下實施例給出:
H7N9患者血漿免疫因子的測定
(一)實驗樣本
1、H7N9患者46例，發(fā)病2周內的患者35例，血漿樣本80份。平均年齡61歲，其中男性22人。
[0019]2，HlNl患者21例，平均年齡53.9歲，其中男性14人。
[0020]3、對照樣本6人，均取自健康志愿者。
[0021](二)實驗材料
I，試劑 Bio-Plex Pro Human Cytokine Array 27-Plex Group 1、21_Plex GroupII，濾紙，Iml排槍，200ul排槍，Iml無菌槍頭，200ul無菌槍頭，IOul無菌槍頭2，儀器Luminex200，水平震蕩儀，磁力架，1.5mlEP管，2mlEP管。
[0022](三)實驗步驟
1、病例的米集
H7N9患者的確診根據(jù)流行病學接觸史、臨床表現(xiàn)及實驗室檢查結果，可作出人感染H7N9禽流感的診斷。在流行病學史不詳?shù)那闆r下，根據(jù)臨床表現(xiàn)、輔助檢查和實驗室檢測結果，特別是從患者呼吸道分泌物標本中分離出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸檢測陽性，或動態(tài)檢測雙份血清H7N9禽流感病毒特異性抗體水平呈4倍或以上升高，可作出人感染H7N9禽流感的診斷
HlNl患者確診:出現(xiàn)流感樣臨床表現(xiàn)，同時有以下一種或幾種實驗室檢測結果:(I)甲型HlNl流感病毒核酸檢測陽性(可采用real-time RT-PCR和RT-PCR方法)；(2)分離到甲型HlNl流感病毒；(3)雙份血清甲型HlNl流感病毒的特異性抗體水平4倍或4倍以上升高。
[0023]2、血漿的制備:
患者及對照組于清晨空腹取外周血3ml置于EDTA抗凝的一次性玻璃采血管內，4° C3000轉離心lOmin，分離得到的血漿_80°C冰箱保存。
[0024]3、液相芯片處理
值得指出的是，本發(fā)明以液相芯片為例對細胞因子及趨化因子進行檢測，對于本領域技術人員來說其它高通量的方法也足于勝任檢測分析任務。
[0025]根據(jù)說明書配置標準品、coupledbeads、detection antibodies 以及Streptavidin-PEo detection antibodies 用前 15 分鐘配置，Streptavidin-PE 用前 10 分
鐘配置。
[0026]I)每孔加入IOOul wash buffer潤板,棄上清,板底用濾紙吸干。
[0027]2)每孔加入 50ul coupled beads,洗板 2 次。
[0028]3)加入標準品、樣本。封口避光后將孔板置于振蕩器上室溫下孵育30分鐘。
[0029]4)用 wash buffer 洗板 3 次。每孔加入 25ul detection antibody,封口避光后將孔板置于振蕩器上室溫下孵育30分鐘。
[0030]5)將孔板置于磁力架上,棄去上清,板底用濾紙吸干,用wash buffer洗板3次。每孔加入50ul str印tavidin-PE，封口避光后將孔板置于振蕩器上室溫下孵育10分鐘。
[0031]6)將孔板置于磁力架上,棄去上清,板底用濾紙吸干,用wash buffer洗板3次。每孔加入125 μ I assay buffer,封口避光，1，100 rpm振蕩器震蕩30秒。Luminex上機檢測及其數(shù)據(jù)分析。
[0032]4、芯片檢測及數(shù)據(jù)的采集
利用χΡΟΝΕΝΤ 3.1 software進行初始數(shù)據(jù)分析。利用SPSS16.0進行統(tǒng)計分析。
[0033]5、數(shù)據(jù)分析
1)H7N9患者相關免疫因子模型的建立
根據(jù)距離發(fā)病時間的不同將46份H7N9患者血漿樣本、21份HlNl患者血漿樣本分為發(fā)病第一周樣本(H1N1樣本10份，H7N9樣本24份)，發(fā)病第二周樣本(H1N1樣本7份，H7N9樣本11份)，發(fā)病15天以后的血漿樣本(H1N1樣本4份，H7N9樣本11份)。健康對照血漿6例。建立免疫因子的H7N9患者血漿差異模型。利用Mann-Whitney U檢驗檢測不同組的細胞因子及趨化因子間差異的顯著性。Spearman’s rank correlation coefficientanalysis用于免疫因子與病毒載量及疾病嚴重程度的相關性分析。Benjamini & Hochbergmethod用于控制多重檢驗的假陽性率。ROC曲線用于預測分析。設定雙側檢驗顯著性水平為 Ρ〈0.05
2)Η7Ν9患者相關免疫因子預測致命預后模型的建立
收集患者采血當天的CRP及APACHE II，計算CRP及APACHE II對Η7Ν9患者疾病嚴重程度及死亡預測的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值，評價該模型的有效性。
[0034]6、實驗結果
I)Η7Ν9患者相關免疫因子模型的數(shù)據(jù)分析:采用SPSS16.0對46例Η7Ν9患者、21例HlNl患者及6例健康志愿者免疫因子進行比較和統(tǒng)計學分析，結果顯示所檢測的Η7Ν9禽流感患者外周血48種細胞因子及趨化因子中有34種在發(fā)病I周組較健康對照組表達有顯著差異(Ρ〈0.05)，水平顯著升高。Η7Ν9禽流感患者發(fā)病第I周組有28種細胞因子及趨化因子水平顯著高于發(fā)病同期的HlNl患者。以上升高的細胞因子包括Thl型細胞因子(如IP-10、IL-2、IFN-Y、TNF-a 和 IL-1 β 等)、Th2 型細胞因子(IL-4、IL-6、IL-10 和 IL-13)及TH17型細胞因子(IL-17)，H7N9禽流感患者發(fā)病第2周組有類似的變化趨勢。這些均表明H7N9禽流感患者存在顯著的細胞因子風暴。如圖1 (A)、l (B)所示。
[0035]2) H7N9患者相關免疫因子與患者病毒載量的相關性分析:采用SPSS16.0進行 Spearman’s rank correlation coefficient analysis,石開究發(fā)現(xiàn) IP-10, MIG, MIF,HGF及IL-18在患者發(fā)病第一周、第二周與患者的病毒載量正相關；SCF，beta_NGF及SCGF-beta在患者發(fā)病第二周與患者的病毒載量正相關。研究結果表明H7N9病毒誘導了高細胞因子血癥，如圖2所示。
[0036]3)H7N9患者相關免疫因子與患者疾病嚴重程度的相關性分析:采用SPSS16.0進行 Spearman’s rank correlation coefficient analysis,石開究發(fā)現(xiàn) SCF、HGF、MIF、IL-18、IP-10及MIG在患者發(fā)病第一周、第二周與患者的APACHE II評分正相關，SCGF-beta在患者發(fā)病第二周與患者的APACHE II評分正相關。研究結果表明H7N9病毒誘導的高細胞因子血癥與疾病的嚴重程度正相關，如圖3所不。
[0037]4) H7N9患者相關免疫因子與患者致命預后的相關性分析:根據(jù)患者的死亡與否，將患者分為好轉組及死亡組，通過Mann-Whitney U檢驗發(fā)現(xiàn)死亡患者發(fā)病第二周相關免疫因子HGF, SCF, IL-18, IP-10, MIF及SCGF-beta水平較好轉組發(fā)病第二周顯著升高，如圖4所示。
[0038]5) H7N9患者相關免疫因子預測患者致命的預后:采用SPSS16.0計算所有顯著升高的相關免疫因子以及Pa02/Fi02 ratios及CRP的ROC曲線的曲線下面積。研究發(fā)現(xiàn)MIF，SCF, MCP-1, HGF, SCGF-beta, IP-10, IL-18 及 IFN-Y 較其他免疫因子 ROC 的曲線下面積更高，且 MIF、SCF、MCP-1、HGF 及 SCGF-beta 較 Pa02/Fi02 ratios 及 CRP 的曲線下面積更高，更能預測患者致命的預后，如圖5-圖14所示。
【權利要求】
1.一種篩選體外血漿中H7N9生物標記物的方法，其特征在于，包括下列步驟: O制備多例H7N9患者的血漿樣本， 2)檢測血漿樣本的細胞因子及趨化因子，獲得細胞因子及趨化因子的數(shù)據(jù)， 3)比較HlNl患者、健康對照血漿中的細胞因子及趨化因子，分析處理數(shù)據(jù)，獲得H7N9生物標記物， 4)從步驟3)所述的H7N9生物標記物中確定死亡風險的生物標記物。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的檢測采用液相芯片技術。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的分析處理數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行處理。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的H7N9生物標記物為至少包括以下生物標記物中多種的組合，所述的生物標記物選自MIF、SCF, MCP-U HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-1O 及 IFN- Y。
5.—種H7N9疾病的嚴重程度的評估方法、監(jiān)測疾病進展或評價治療的方法，其特征在于，通過定量或定性比較患者與正常對照的H7N9生物標記物得知疾病嚴重程度，或者監(jiān)測疾病進展，或者評價治療。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的H7N9生物標記物為至少包括以下生物標記物中多種的組合，所述的生物標記物選自MIF、SCF、MCP-1、HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-1O 及 IFN- Y。
7.一種評估H7N9疾病嚴重程度的試劑盒，其特征在于，主要在于定量檢測H7N9生物標記物。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的H7N9生物標記物為至少包括以下生物標記物中多種的組合，所述的生物標記物選自MIF、SCF、MCP-1、HGF、SCGF-beta、IL-18、IP-1O 及 IFN- Y。
【文檔編號】G01N33/53GK103954748SQ201410127951
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月1日 優(yōu)先權日:2014年4月1日
【發(fā)明者】李蘭娟, 郭靜, 陳瑜 申請人:浙江大學