檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的eⅲ-間接elisa抗體檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的EⅢ-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒包括如下組成：以純化的JEV-EⅢ蛋白作為包被抗原的酶標(biāo)板、洗滌液、血清稀釋液、兔抗豬酶標(biāo)二抗、底物顯色液、終止液、JEV陽(yáng)性血清、JEV陰性血清。本發(fā)明使用的包被抗原易于穩(wěn)定、大量獲得，純化方法簡(jiǎn)單易于實(shí)現(xiàn)，重組蛋白的濃度易于測(cè)定和控制，有利于工業(yè)化大量生產(chǎn)。本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)豬乙型腦炎病毒抗體，與現(xiàn)有技術(shù)中ELISA試劑盒的檢測(cè)符合率為90%。本發(fā)明試劑盒便于操作，靈敏度高，特異性好，使用成本低，重復(fù)性好，適合推廣應(yīng)用，為臨床上快速檢測(cè)JEV抗體提供了可靠手段。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的E II1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的EII1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)屬于黃病毒科黃病毒屬，其所導(dǎo)致的日本乙型腦炎是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)性人畜共患的急性傳染病。據(jù)估計(jì)，每年全球大約有50000人感染JEV，大約有15000例死亡，死亡率30%左右；同時(shí)JEV是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，極大的限制肉產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯。2008年我國(guó)農(nóng)業(yè)部將豬日本乙型腦炎病歸于二類動(dòng)物疫病。
[0003]該病于19世紀(jì)70年代在日本首次報(bào)道，并于1924年首次分離到日本乙型腦炎病毒。中國(guó)是在1938?1940年間采用血清學(xué)和病毒分離的方法確診了日本乙型腦炎病例，于1949年在北京首次分離到該病毒。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，該病的流行區(qū)域有所擴(kuò)大，目前該病的分布區(qū)北起俄羅斯西伯利亞、日本北海道，南到澳大利亞，東到美國(guó)關(guān)島，西到印度西海岸。亞洲是JE發(fā)病人數(shù)最多的地區(qū)，我國(guó)又占了其中的大多數(shù)。
[0004]目前常用于檢測(cè)乙腦病毒的方法包括病原的分離鑒定、RT-PCR和血清學(xué)方法。病原的分離鑒定是最傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但其影響因素多，實(shí)際操作起來(lái)相當(dāng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此在臨床應(yīng)用中有一定的局限性；RT_PCR技術(shù)需要特殊的儀器設(shè)備(如PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)等)和專業(yè)人員進(jìn)行相關(guān)的操作；酶免疫分析法是血清學(xué)方法中最常用的方法之一，而酶免疫分析法將酶催化反應(yīng)的放大作用和抗原抗體親和反應(yīng)的高度專一性、特異性相結(jié)合，以酶標(biāo)記的抗原或抗體作為主要試劑進(jìn)行免疫測(cè)試，具有很高的靈敏度和特異性，但是，免疫分析法的靈敏度、特異性取決于抗原的選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的E II1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒。該試劑盒具有高靈敏度、高特異性、操作方法簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供所述的檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的E II1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的E II1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒,具體包括如下組成:
[0008]以純化的JEV-E III蛋白作為包被抗原的酶標(biāo)板、洗滌液、血清稀釋液、兔抗豬酶標(biāo)二抗、底物顯色液、終止液、JEV陽(yáng)性血清、JEV陰性血清。
[0009]所述的純化的JEV-E III蛋白通過(guò)以下步驟制備得到:
[0010](I)從豬乙型腦炎病毒GZ0409-31株中抽提RNA，42°C反轉(zhuǎn)錄Ih后，獲得cDNA，以獲得的cDNA為模板，通過(guò)引物Pl和P2進(jìn)行PCR ;將得到的PCR產(chǎn)物和載體pET_32a分別通過(guò)BamH I和HindIII進(jìn)行雙酶切；再將雙酶切后的PCR產(chǎn)物和pET_32a連接，得到重組質(zhì)粒 pET-32a-JEV-EIII ；
[0011]Pl:5’-CGCGGATCCAAAAATCCGGCGGACACTG-3’ ；
[0012]P2:5’-CCCAAGCTTTTACAAAGTTGTTGAAAAGGCCTTG-3’ ；
[0013]其中，CGC或CCC為保護(hù)堿某,GGATCC為BamH I酶切位點(diǎn)，AAGCTT為Hind III酶切位點(diǎn)，TTA是終止密碼子TAA的反向互補(bǔ)序列；
[0014](2)將重組質(zhì)粒pET-32a_JEV-EIII轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，將檢測(cè)為陽(yáng)性的重組菌株，通過(guò)IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；
[0015](3)收集表達(dá)后的菌液，使用His-TRAP? FF Crude柱進(jìn)行純化，得到純化的JEV-E III 蛋白；
[0016]步驟(1)中所述的反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為:總1?嫩12 4 1^、(1見(jiàn)1^2 4 1^隨機(jī)引物14 1^RRI2 μ L、AMVl μ L,加 ddH20 至總體積為 20 μ L ；
[0017]步驟(1)中所述的PCR的反應(yīng)體系為:10\8肛€6技41^，濃度為21111的(1見(jiàn)138541^濃度為 25mM 的 MgS044y L，引物 Pl 1.5 μ L，引物 P21.5 μ L, cDNA2 μ L，KOD 酶 I μ L，加 ddH20至 50 μ L ;
[0018]步驟(1)中所述的PCR的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2min ;94°C熱變性15s、55°C 30s,68°C lmin，共 30 個(gè)循環(huán)；68°C 8min 終延伸；
[0019]所述的以純化的JEV-E III蛋白作為包被抗原的酶標(biāo)板，通過(guò)如下步驟制備得到:將純化的JEV-E III蛋白用包被緩沖液稀釋到4.7 μ g/mL, 100 μ L每孔加到酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；取過(guò)夜包被好的酶標(biāo)板，200 μ L/孔洗滌液洗板3~5次，每次3~5min ；200 μ L/孔封閉液，37°C溫育2.5h，取封閉好的酶標(biāo)板，200 μ L/孔洗滌液洗板3~5次，每次3~5min ；得到以純化的JEV-E III蛋白作為包被抗原的酶標(biāo)板；
[0020]所述的包被緩沖液優(yōu)選為pH9.6,0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；
[0021]所述的PH9.6,0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液優(yōu)選通過(guò)如下步驟制備得到:將碳酸鈉
1.5g和碳酸氫鈉2.93g溶解于600mL ddH20,調(diào)pH值至9.6，ddH20定容至1000mL,即得包被緩沖液；
[0022]所述的封閉液優(yōu)選為用洗滌液配制的質(zhì)量體積比(g/mL) 0.5%的大豆卵磷脂溶液；
[0023]所述的酶標(biāo)板優(yōu)選為JET公司產(chǎn)品；
[0024]所述的洗滌液通過(guò)如下步驟制備得到:將3.579g Na2HPO4.12H20、1.56gNaH2P04 *2H20,NaC129.215g 和 600mL ddH20 充分溶解，加入 0.5mL 吐溫-20，用 IOmol/L HCl溶液調(diào)pH值至7.4，ddH20定容至1000mL ；
[0025]所述的血清稀釋液優(yōu)選為用洗滌液配制的質(zhì)量體積比(g/mL) 0.5%的大豆卵磷脂溶液；
[0026]所述的兔抗豬酶標(biāo)二抗優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-兔抗豬IgG 二抗；
[0027]所述的底物顯色液優(yōu)選為TMB顯色液；
[0028]所述的終止液為2M硫酸；
[0029]所述的檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的E II1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，包含以下步驟:
[0030](I)將待檢樣品用血清稀釋液稀釋，然后按100 μ L/孔的量加到以純化的JEV-EIII蛋白作為包被抗原的酶標(biāo)板中，同時(shí)也將JEV陽(yáng)性血清和JEV陰性血清分別按100 μ L/孔的量加到以純化的JEV-E III蛋白作為包被抗原的酶標(biāo)板中作為對(duì)照，37°C溫育40min ；
[0031](2)用洗滌液進(jìn)行洗板3次，200 μ L/孔，每次3min ；
[0032](3)將兔抗豬酶標(biāo)二抗用洗滌液稀釋，每個(gè)反應(yīng)孔加100 μ L，37°C溫育55min ；
[0033](4)用洗滌液進(jìn)行洗板4次，200 μ L/孔，每次3min ；
[0034](5)避光條件下每個(gè)反應(yīng)孔加100 μ L底物顯色液，室溫避光顯色20min ；
[0035](6)每個(gè)反應(yīng)孔加50 μ L終止液終止反應(yīng)；
[0036](7 )在450nm單波長(zhǎng)下測(cè)OD值；
[0037](8)結(jié)果判讀:0D450nm(樣本)≥0.255判為陽(yáng)性；0D450nm介于0.231~0.255(0D450nm(樣本)+2SD)判為可疑，0D450nm(樣本)< 0.231判為陰性。
[0038]步驟(1)中所述的將待檢樣品用血清稀釋液稀釋優(yōu)選為將待檢樣品用血清稀釋液按體積比1:160倍稀釋；
[0039]步驟(3)中所述的將兔抗豬酶標(biāo)二抗用洗滌液稀釋優(yōu)選為將兔抗豬酶標(biāo)二抗用洗滌液按體積比1:5000倍稀釋。
[0040]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0041](I)本發(fā)明選用的包被抗原是豬乙型腦炎病毒E III蛋白，E蛋白是JEV重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，屬糖蛋白，具有血細(xì)胞凝集素活性，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的粘附和膜融合，是重要的毒力因子；而且E蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體，逃避宿主免疫監(jiān)督系統(tǒng)的攻擊。E蛋白的外功能區(qū)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，3個(gè)結(jié)構(gòu)域間相互聯(lián)系，行使著E蛋白的各種功能。其中E蛋白結(jié)構(gòu)域III呈穩(wěn)定的免疫球蛋白樣的折疊，具有與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合的作用，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的粘附，是豬流行性乙型腦炎病毒的抗原活性中心，其上含有JEV特異性的抗原表位，其主要的中和表位位于結(jié)構(gòu)域III外表面的殘基上，該區(qū)域是受體結(jié)合的區(qū)域，相比直接選用E蛋白特異性更強(qiáng)，避免了非抗原物質(zhì)與血清中其他抗體的結(jié)合。抗體與E蛋白結(jié)構(gòu)域III結(jié)合后能最有效地阻斷病毒與細(xì)胞的聯(lián)系。
[0042](2)本發(fā)明試劑盒應(yīng)用的豬流行性乙型腦炎病毒E III蛋白，在選擇材料上具有新意，豬在受到JEV感染時(shí)最先產(chǎn)生的是針對(duì)E蛋白的抗體，而EIII蛋白是豬流行性乙型腦炎病毒E蛋白的抗原活性中心，保證了本試劑盒具有高度的特異性。
[0043](3)目前在檢測(cè)豬流行性乙型腦炎病毒抗體方面，主要有用E蛋白包被的ELISA試劑盒、全病毒包被的間接血凝與血凝抑制實(shí)驗(yàn)和乳膠凝集實(shí)驗(yàn)。由于病毒需要由細(xì)胞培養(yǎng)物中大量增殖，而真正意義上的純化病毒很難獲得。本發(fā)明使用的包被抗原為豬流行性乙型腦炎病毒E III基因的原核表達(dá)產(chǎn)物，其優(yōu)點(diǎn)在于重組E III蛋白易于穩(wěn)定、大量獲得，純化方法簡(jiǎn)單易于實(shí)現(xiàn)(應(yīng)用His-bind親和層析柱進(jìn)行純化)，重組蛋白的濃度易于測(cè)定和控制，有利于工業(yè)化大量生產(chǎn)。雖然E蛋白也是通過(guò)原核表達(dá)的方法獲得，但是E蛋白是全蛋白攜帶有許多非抗原本身的物質(zhì)，增加了檢出非特異性抗體的幾率。
[0044](4)本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)豬乙型腦炎病毒抗體，檢測(cè)方法經(jīng)特異性、敏感性、重復(fù)性等指標(biāo)的檢驗(yàn)后，將其用于血清樣品的檢驗(yàn)，與現(xiàn)有技術(shù)中ELISA試劑盒的檢測(cè)符合率為90%。本發(fā)明試劑盒便于操作， 靈敏度高，特異性好，使用成本低，重復(fù)性好，適合推廣應(yīng)用，為臨床上快速檢測(cè)JEV抗體提供了可靠的手段。
[0045](5)本試劑盒所使用抗原蛋白包被量較少,所用蛋白濃度僅為4.7 μ g/mL,而靈敏
度較高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0046]圖1為JEV-EIII基因擴(kuò)增片段的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道M為DNA MarkerDL2000,泳道I和2分別為以P1、P2為引物的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0047]圖2為pET-32a_JEV-EIII重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道Ml為DNA Marker DL2000，泳道 I 和 2 為分別重組質(zhì)粒 pET_32a-JEV_E III用 BamH I 和 Hind III進(jìn)行雙酶切后的產(chǎn)物，泳道M2為DNA Marker DL10000。
[0048]圖3為重組pET-32a_JEV-EIII載體在大腸桿菌表達(dá)菌液中的菌體經(jīng)過(guò)裂解得到的產(chǎn)物的SDS-PAGE圖；泳道M為蛋白Markerll6KDa，泳道I為未誘導(dǎo)的pET_32a空載體，泳道2為誘導(dǎo)的pET-32a空載體，泳道3為未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pET_32a_JEV-E III，泳道4為誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pET-32a-JEV-E III。
[0049]圖4為重組pET-32a_JEV-EIII載體在不同誘導(dǎo)時(shí)間得到的菌液中的菌體經(jīng)過(guò)裂解得到的產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果圖；泳道M為蛋白Markerll6KDa，泳道I?7為依次誘導(dǎo)Oh、lh、2h、3h、4h、5h 和 6h。
[0050]圖5為重組質(zhì)粒不同IPTG濃度誘導(dǎo)的SDS-PAGE結(jié)果圖；泳道M為蛋白Markerl 16KDa，泳道 I ?7 是 IPTG 濃度依次為 0mM、0.5mM、lmM、2mM、3mM、4mM 和 5mM。
[0051]圖6為重組蛋白的SDS-PAGE圖和Western Blotting的結(jié)果圖；其中，圖A為重組蛋白的SDS-PAGE圖，圖B為與圖A對(duì)應(yīng)的Western Blotting的結(jié)果圖；泳道M為蛋白Markerl16KDa，泳道I和2分別為重組蛋白。
[0052]圖7為蛋白純化條件咪唑結(jié)合緩沖液濃度優(yōu)化的SDS-PAGE結(jié)果圖；泳道M為蛋白Markerl 16KDa,泳道 I 為 30mM，泳道 2 為 40mM，泳道 3 為 50mM。
[0053]圖8為蛋白純化條件用30mmol/L咪唑結(jié)合緩沖液結(jié)合后，咪唑洗脫緩沖液濃度優(yōu)化的SDS-PAGE結(jié)果圖；泳道M為蛋白Markerll6KDa，泳道I為200mM，泳道2為IOOmM,泳道 3 為 500mM。
[0054]圖9為蛋白純化條件用30mmol/L咪唑結(jié)合緩沖液結(jié)合后，IOOmM咪唑洗脫緩沖液洗脫體積優(yōu)化的SDS-PAGE結(jié)果圖；泳道M為蛋白Markerll6KDa，泳道I?9分別為5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、llmL、12mL、13mL。
[0055]圖10為純化后重組蛋白的SDS-PAGE圖和Western Blotting的結(jié)果圖；泳道M為蛋白Markerll6KDa ;其中，圖A為純化后重組蛋白的SDS-PAGE圖，圖B為與圖A對(duì)應(yīng)的Western Blotting的結(jié)果圖；泳道M為蛋Markerll6KDa,泳道I和2分別為純化后重組蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0056]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0057]實(shí)施例1[0058]1、材料
[0059]以下實(shí)施例中所用KOD酶為Τ0Υ0Β0公司產(chǎn)品；
[0060]JEV-E III蛋白是在BL21 (DE3)大腸桿菌中表達(dá)純化的濃度為4.7 μ g/mL的蛋白；[0061 ] 酶標(biāo)板為JET公司產(chǎn)品；
[0062]洗滌液通過(guò)如下步驟制備得到:將3.579g Na2HPO4.12H20、L 56gNaH2P04.2H20、29.215g NaCl 和 600mL ddH20 充分溶解，加入 0.5mL 吐溫-20，用 IOmoI/L HCl 溶液調(diào) pH 值至 7.4，ddH20 定容至 IOOOmL ；
[0063]包被緩沖液(pH9.60.05mol/L的碳酸鹽緩沖液):碳酸鈉1.5g、碳酸氫鈉2.93g溶解于 600mL ddH20,調(diào) pH 值至 9.6，ddH20 定容至 IOOOmL ；
[0064]血清稀釋液為質(zhì)量體積比(g/mL) 0.5%的大豆卵磷脂溶液，溶劑為洗滌液；
[0065]封閉液為質(zhì)量體積比(g/mL) 0.5%的大豆卵磷脂溶液，溶劑為洗滌液；
[0066]辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-兔抗豬IgG 二抗為廣州威佳公司產(chǎn)品；
[0067]TMB顯色液為廣州UCANDO生物公司產(chǎn)品；
[0068]終止液為2M硫酸；
[0069]JEV陽(yáng)性血清、JEV陰性血清參照IDEXX公司ELISA試劑盒中的JEV陰性血清和JEV陽(yáng)性豬血清；
[0070]限制性內(nèi)切酶BamH 1、Hind II1、T4DNA 連接酶、DNA Marker、蛋白 Marker、大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞等均購(gòu)于TaKaRa公司；
[0071]原核表達(dá)載體pET_32a購(gòu)于Novagen公司；
[0072]RNA抽提試劑盒、PCR回收試劑盒均購(gòu)于OMEGA公司。
[0073]以下生物材料已在文獻(xiàn)“豬乙型腦炎病毒3種滅活疫苗的制備及免疫效果比較，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32 (02):85-88”公開(kāi):豬乙型腦炎病毒GZ0409-31株。
[0074]II具體制備過(guò)程
[0075]一、純化的JEV-E III蛋白的制備，包含以下步驟:
[0076](I)引物設(shè)計(jì)和合成:根據(jù)GenBank中豬乙型腦炎病毒(GZ0409-31株)(KF297916.1)的基因序列設(shè)計(jì)引物，分別在上游和下游引入BamH I和Hind III限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。上述引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。
[0077]Pl:5’-CGCGGATCCAAAAATCCGGCGGACACTG-3’ ；
[0078]P2:5’-CCCAAGCTTTTACAAAGTTGTTGAAAAGGCCTTG-3’ ；
[0079]其中，CGC或CCC為保護(hù)堿某,GGATCC為BamH I酶切位點(diǎn)，AAGCTT為Hind III酶切位點(diǎn)，TTA是終止密碼子TAA的反向互補(bǔ)序列；
[0080](2)目標(biāo)片段基因擴(kuò)增:參照RNA抽提試劑盒(購(gòu)自O(shè)MEGA公司)從豬乙型腦炎病毒GZ0409-31株中抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為:總RNA12yL，dNTPs2 μ L，隨機(jī)引物I μ L，RRI2 μ L，AMVl μ L，加ddH20至總體積為20 μ L ;42°C反轉(zhuǎn)錄Ih后，獲得cDNA,以獲得的cDNA為模板，應(yīng)用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50yL):10XBuffer5 μ L, dNTPs(2mM) 5μ L, MgSO4 (25mM) 4 μ L，引物 Ρ11.5 μ L，引物 Ρ21.5 μ L，cDNA2 μ L, KOD 酶 1μ L，加ddH20 至 50yL。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 2min ; (94°C 15s，55°C 30s, 68°C lmin) X 30 個(gè)循環(huán)；68°C，8min，4°C保存。PCR結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ L在質(zhì)量體積比1%的瓊脂糖凝膠上電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)掃描進(jìn)行初步鑒定。電泳結(jié)果如圖1所示。[0081](3)重組表達(dá)載體的構(gòu)建:用BamH I和Hind III限制性內(nèi)切酶分別對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-32a (Novagen公司)進(jìn)行雙酶切，雙酶切的反應(yīng)體系為=BamH I和Hind III各I μ L，IOXK buffer2 μ L, PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物或質(zhì)粒 pET_32al μ g，加 ddH20 M 20 μ L0 用質(zhì)量體積比1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，參照PCR回收試劑盒(購(gòu)自O(shè)MEGA公司)，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行回收雙酶切產(chǎn)物，二者回收產(chǎn)物以摩爾比10:1比例用T4DNA連接酶(Takara，按說(shuō)明書操作)于16°C連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司)中，并接種于含100mg/L Amp+的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿(胰蛋白胨2.0g、酵母提取物1.0g、氯化鈉
2.0g、瓊脂粉3.0g，溶解于200mL ddH20中，pH值調(diào)至7.4，121°C高壓滅菌15min，培養(yǎng)基溫度降50°C左右時(shí)添加Amp+母液使其終濃度為100mg/L，混勻后傾倒于玻璃平皿，4°C保存?zhèn)溆谩?中，37°C恒溫倒置培養(yǎng)12?16h，隨機(jī)挑選單克隆菌落，把用引物Pl和P2經(jīng)菌落PCR鑒定正確的陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒，用BamH I和Hind III雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示，酶切后獲得的片段與目的片段大小相同；挑取酶切檢測(cè)為陽(yáng)性的克隆于含100mg/L Amp+的LB肉湯培養(yǎng)基(胰蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、氯化鈉1.0g，溶解于IOOmL ddH20中，pH值調(diào)至7.4，121°C高壓滅菌15min，培養(yǎng)基溫度降至常溫后加入Amp+母液使其終濃度為IOOmg/L，4°C保存?zhèn)溆谩?中進(jìn)行增菌，吸取菌液委托上海立菲公司進(jìn)行測(cè)序，得到的序列與目的基因序列完全一致，以明確目標(biāo)基因以正確的讀碼框插入表達(dá)載體。獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，將其命名為 pET-32a-JEV-E III。
[0082](4)重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)以及條件優(yōu)化
[0083]重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá):將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a_JEV-E III轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司)，挑取陽(yáng)性重組載體菌落，接種于新鮮的LB肉湯(Amp+終濃度為100mg/L)培養(yǎng)基中，于37°C、200r/min培養(yǎng)過(guò)夜，得到活化的菌液；次日，將活化的菌液按照體積比1:50接種于新鮮的LB肉湯(Amp+終濃度為100mg/L)培養(yǎng)基中，當(dāng)0D600=0.4?0.6時(shí)加入終濃度為0.5mM的IPTG，于37°C誘導(dǎo)表達(dá)3h收集菌液，取ImL菌液離心收集菌體，加入100 μ LddH20重懸和同體積的2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，在水中煮沸裂解lOmin，進(jìn)行SDS-PAGE (使用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，分離膠的濃度是12%，濃縮膠為3%，其中先進(jìn)行80V30min，后用120V35min的電壓條件)試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)立空載體pET_32a轉(zhuǎn)化菌和重組質(zhì)粒pET-32a-JEV-E III未誘導(dǎo)菌為對(duì)照。結(jié)果如圖3所示。
[0084]不同誘導(dǎo)時(shí)間重組蛋白表達(dá)情況按照上述方法接種活化的菌液，誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為0.5mM，誘導(dǎo)時(shí)間分別為Oh、Ih、2h、3h、4h、5h、6h。收集不同時(shí)間段的菌液，進(jìn)行SDS-PAGE(使用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，分離膠的濃度是12%，濃縮膠為3%，其中先進(jìn)行80V30min，后用120V40min的電壓條件)分析，結(jié)果如圖4所示，結(jié)果顯示最佳誘導(dǎo)時(shí)間為3h。
[0085]不同誘導(dǎo)劑IPTG濃度重組蛋白表達(dá)情況按照上述方法接種活化的菌液，誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為0.5mM、lmM、2mM、3mM、4mM和5mM，37°C誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為上述優(yōu)化的最佳時(shí)間。分別收集菌液，進(jìn)行SDS-PAGE (使用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，分離膠的濃度是12%，濃縮膠為3%，其中先進(jìn)行80V30min，后用120V40min的電壓條件)分析，結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示最佳誘導(dǎo)IPTG濃度為2mM。
[0086]重組蛋白大量表達(dá):挑重組表達(dá)菌株BL21-pET32a-JEV-ElII陽(yáng)性菌落，接種于IL LB (Amp +終濃度為100mg/L)培養(yǎng)基中，按上述優(yōu)化的誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，按每IOOmL菌液離心后收集的菌體加入5mL鈉鹽緩沖液(Na2HPO4.12H201.7895g，NaH2PO4.2Η200.78g, NaCl 14.6075g，定容至 500mL，調(diào)節(jié) pH 至 7.4。)，重懸菌體沉淀，超聲破碎離心，分為上清和沉淀(包涵體)。包涵體用5mL8M尿素鈉鹽緩沖液(尿素與上述鈉鹽緩沖液混合得到的尿素鈉鹽緩沖液)進(jìn)行溶解，4°C過(guò)夜溶解。溶解后4°C、8000r/min離心15min，取上清；再將上清進(jìn)行梯度透析復(fù)性；作為過(guò)柱純化的預(yù)處理樣品。
[0087]采用上述預(yù)處理樣品，Western Blotting檢測(cè)重組蛋白的抗原性(如圖6所示)。結(jié)果顯示重組蛋白具有抗原性。
[0088](5)重組蛋白的純化以及鑒定
[0089]純化條件的優(yōu)化:按照His-TRAP? FF Crude(購(gòu)于GE Healthcare公司)說(shuō)明書的操作步驟進(jìn)行純化，分別采用30mM、40mM、50mM咪唑結(jié)合緩沖液各5mL體積平衡純化柱；平衡之后，加入ImL預(yù)處理樣品，吸附完預(yù)處理樣品后，分別用IOmL同上濃度的咪唑結(jié)合緩沖液沖洗純化柱，流速lmL/min，采用1.5mL EP管收集每次沖洗下的液體；再分別采用100mM、200mM、500mM咪唑洗脫緩沖液各5mL進(jìn)行梯度洗脫，流速lmL/min，1.5mL EP管收集各濃度咪唑洗脫緩沖液。用SDS-PAGE (使用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，分離膠的濃度是12%，濃縮膠為3%，其中先進(jìn)行80V30min，后用120V40min的電壓條件)對(duì)收集樣品檢測(cè)，確定最適的咪唑結(jié)合緩沖液濃度(如圖7所示)、最適的咪唑洗脫緩沖液濃度(如圖8所示)、最適的咪唑洗脫緩沖液體積(如圖9所示)。結(jié)果顯示ImL樣品用5mL30mM咪唑結(jié)合緩沖液結(jié)合,7mL100mM的咪唑洗脫緩沖液洗脫純化效果最好。
[0090]將純化后的重組蛋白樣品處理后，進(jìn)行SDS_PAGE(使用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，分離膠的濃度是12%，濃縮膠為3%，其中先進(jìn)行80V30min，后用120V40min的電壓條件)檢測(cè)，觀察電泳效果(見(jiàn)圖1OA所示)以及純化蛋白的Westernbloting檢測(cè)(見(jiàn)圖1OB所示),結(jié)果顯示純化的JEV-E III蛋白具有抗原性。
[0091]二、重組蛋白包被板的制備
[0092]( I)抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的的選擇
[0093]通過(guò)方陣滴定方法確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度，結(jié)果如表I ;從表I可以看出，用包被緩沖液進(jìn)行稀釋抗原，用血清稀釋液進(jìn)行稀釋血清，隨著抗原濃度的減少和血清稀釋度的增大，P/N值不斷降低。當(dāng)重組蛋白1:80稀釋，即重組抗原最佳包被濃度為
4.Yyg/mL，對(duì)照血清1:160稀釋時(shí)，P/N最大。其中，包被緩沖液為pH9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，血清稀釋液為用洗滌液配制的質(zhì)量體積比(g/mL)0.5%的大豆卵磷脂溶液。
[0094]表I
[0095]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的E II1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括如下組成: 以純化的JEV-E III蛋白作為包被抗原的酶標(biāo)板、洗滌液、血清稀釋液、兔抗豬酶標(biāo)二抗、底物顯色液、終止液、JEV陽(yáng)性血清、JEV陰性血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的EII1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于: 所述的純化的JEV-E III蛋白通過(guò)以下步驟制備得到: (1)從豬乙型腦炎病毒GZ0409-31株中抽提RNA，42°C反轉(zhuǎn)錄Ih后，獲得cDNA，以獲得的cDNA為模板，通過(guò)引物Pl和P2進(jìn)行PCR ;將得到的PCR產(chǎn)物和載體pET_32a分別通過(guò)BamH I和HindIII進(jìn)行雙酶切；再將雙酶切后的PCR產(chǎn)物和pET_32a連接，得到重組質(zhì)粒pET-32a-JEV-EIII ；
Pl:5，-CGCGGATCCAAAAATCCGGCGGACACTG-3’ ；
P2:5’-CCCAAGCTTTTACAAAGTTGTTGAAAAGGCCTTG-3’ ； (2)將重組質(zhì)粒pET-32a-JEV-EIII轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，將檢測(cè)為陽(yáng)性的重組菌株，通過(guò)IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)； (3)收集表達(dá)后的菌液，使用His-TRAP?FF Crude柱進(jìn)行純化，得到純化的JEV-E III蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的EII1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于:步驟(1)中所述的反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為:總RNA12yL、dNTPs2yL、隨機(jī)引物I μ L、RRI2 μ L、AMVl μ L,加 ddH20 至總體積為 20 μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的EII1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于:步驟(1)中所述的PCR的反應(yīng)體系為:10XBuffer5yL，濃度為2mM的dNTPs5 μ L,濃度為 25mM 的 MgS044 μ L,引物 PlL 5 μ L，引物 P21.5μ L, cDNA2 μ L, KOD 酶I μ L，加 ddH20 至 50 μ L ; 步驟(1)中所述的PCR的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2min ;94°C熱變性15s、55°C 30s、68°C lmin，共30個(gè)循環(huán)；68°C 8min終延伸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的EII1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于: 所述的以純化的JEV-E III蛋白作為包被抗原的酶標(biāo)板，通過(guò)如下步驟制備得到:將純化的JEV-E III蛋白用包被緩沖液稀釋到4.7 μ g/mL, 100 μ L每孔加到酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；取過(guò)夜包被好的酶標(biāo)板，200 μ L/孔洗滌液洗板3~5次，每次3~5min ；200 μ L/孔封閉液，37°C溫育2.5h，取封閉好的酶標(biāo)板，200 μ L/孔洗滌液洗板3~5次，每次3~5min ;得到以純化的JEV-E III蛋白作為包被抗原的酶標(biāo)板。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的EII1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于: 所述的封閉液為用洗滌液配制的質(zhì)量體積比0.5%的大豆卵磷脂溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的EII1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于: 所述的包被緩沖液為pH9.6,0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的EII1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述的血清稀釋液為用洗滌液配制的質(zhì)量體積比0.5%的大豆卵磷脂溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的EII1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述的酶標(biāo)板為JET公司產(chǎn)品； 所述的洗滌液通過(guò)如下步驟制備得到:將3.579g Na2HPO4.12H20、1.56gNaH2P04.2H20、NaC129.215g 和 600mL ddH20 充分溶解，加入 0.5mL 吐溫-20，用 IOmoI/L HCl 溶液調(diào) pH 值至 7.4，ddH20 定容至 1000mL ；
所述的兔抗豬酶標(biāo)二抗為辣根過(guò)氧化物酶-兔抗豬IgG 二抗； 所述的底物顯色液為TMB顯色液； 所述的終止液為2M硫酸。
10.權(quán)利要求1~9任一項(xiàng)所述的檢測(cè)豬乙型腦炎病毒的EII1-間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，其特征在于包含以下步驟: (1)將待檢樣品用血清稀釋液稀釋，然后按100μ L/孔的量加到以純化的JEV-EIII蛋白作為包被抗原的酶標(biāo)板中，同時(shí)也將JEV陽(yáng)性血清和JEV陰性血清分別按100 μ L/孔的量加到以純化的JEV-E III蛋白作為包被抗原的酶標(biāo)板中作為對(duì)照，37°C溫育40min ； (2)用洗滌液進(jìn)行洗板3次，200μ L/孔，每次3min ； (3)將兔抗豬酶標(biāo)二抗用洗滌液稀釋，每個(gè)反應(yīng)孔加IOOyL，37°C溫育55min ； (4)用洗漆液進(jìn)行洗板4次,200μ L/孔,每次3min ； (5)避光條件下每個(gè)反應(yīng)孔加100μ L底物顯色液，室溫避光顯色20min ； (6)每個(gè)反應(yīng)孔加50μ L終止液終止反應(yīng)； (7)在450nm單波長(zhǎng)下測(cè)OD值； (8)結(jié)果判讀:0D450nm≥0.255判為陽(yáng)性；0D450nm介于0.231~0.255判為可疑，0D450nm < 0.231 判為陰性。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK103616509SQ201310627844
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】陳金頂, 姚俊庸, 鄭仲華, 鄧潔汝, 劉翠翠, 勾紅潮, 裴晶晶 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)