一種呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，包括濃縮洗液、陰性對照品、陽性對照品、化學(xué)發(fā)光液、呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體和已包被呋喃妥因的發(fā)光板；所述的辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體為，辣根過氧化物酶標(biāo)記的以呋喃妥因-BSA為免疫原免疫新西蘭大白兔所得抗呋喃妥因多克隆抗體；用過碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體；本發(fā)明檢測呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒靈敏度高、檢測范圍寬、操作簡便快速且無毒無污染；采用呋喃妥因的代謝物與載體偶聯(lián)制備包被抗原，更為經(jīng)濟(jì)；辣根過氧化物酶標(biāo)記物的制備，采用一步法，方法簡單步驟更為簡單，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體的說是一種呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]目前檢測飼料中抗生素的技術(shù)主要有以下幾種方法:
(I)理化檢測法
20世紀(jì)90年代以后，絕大多數(shù)測定呋喃妥因的理化檢測法主要依靠液相色譜技術(shù)進(jìn)行分離，其次是色/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，氣相色譜法、高效薄層色譜法等檢測法，因其各自特有的性能，在抗生素殘留檢測方面稍有應(yīng)用。色譜法檢測飼料中的藥物殘留要經(jīng)過樣品處理(包括樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟)、藥物的分離和藥物的檢測。理化檢測法利用抗生素分子中的基團(tuán)所具有的特殊反應(yīng)或性質(zhì)來測定其含量，能進(jìn)行定性、定量分析和藥物鑒定，可作為飼料抗生素檢測的確證方法。該法檢測敏感性較高，但儀器及檢測費(fèi)用高、檢測程序復(fù)雜、較耗時(shí)間等。
[0003](2)免疫學(xué)分析法
免疫學(xué)分析法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法，目前藥物殘留免疫分析技術(shù)主要分三大類:相對獨(dú)立的分析方法、免疫分析技術(shù)與常規(guī)理化分析技術(shù)聯(lián)用的方法、免疫受體法。1973年荷蘭van weeman、schurrs及瑞典Engval1、Perlmann分別提出酶聯(lián)免疫吸附法，30多年來國內(nèi)外學(xué)者對免疫學(xué)方法檢測食品中抗生素進(jìn)行了大量研究。但由于抗生素是半抗原，抗原構(gòu)建技術(shù)難度大、免疫特異性強(qiáng)、檢測成本高，目前IDEXX等公司在免分析法方面的研究較為成熟，國內(nèi)該技術(shù)仍處于研究發(fā)展中。當(dāng)前主要是用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射性免疫發(fā)光法、熒光免疫法、化學(xué)發(fā)光法等；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射性免疫發(fā)光法、熒光免疫法等方法與發(fā)光相化學(xué)發(fā)光法比較，其酶免靈敏度較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，提供一種呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，其具有靈敏度高、檢測范圍寬、操作簡便快速等優(yōu)點(diǎn)。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，包括濃縮洗液、陰性對照品、陽性對照品、化學(xué)發(fā)光液、呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體和已包被呋喃妥因的發(fā)光板；
所述的濃縮洗液為:含有Tween-20和氯化鈉的磷酸鹽緩沖液；
所述的陰性對照品為:5份以上單獨(dú)存放的除菌過濾后的呋喃妥因檢測為陰性的豬尿混合物；
所述的陽性對照品為:5份以上單獨(dú)存放的除菌過濾后的呋喃妥因檢測為陽性的豬尿混合物；
所述的化學(xué)發(fā)光液，包括A液和B液；A液配制方法為:首先配置0.2 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液，在此緩沖液中加入魯米諾和四苯硼鈉，混合均勻即可得到A液；B液配制方法為:首先配置0.2 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液，在此緩沖液中按重量比加入0.1%H2O2混合均勻即可得到B液；
所述的呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品為濃度分別為0ng/ml、0.lng/ml、0.3 ng/ml、0.9 ng/ml、2.7ng/ml、8.lng/ml呋喃妥因的稀釋液；
所述的辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體為，辣根過氧化物酶標(biāo)記的以呋喃妥因-BSA為免疫原免疫新西蘭大白兔所得抗呋喃妥因多克隆抗體；用過碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體，反應(yīng)體系為:先用Iml濃度5mg/ml的辣根過氧化物酶溶液與0.15ml濃度0.1 mol/L的NaIO4溶液混勻后，置于4°C避光0.5小時(shí)，然后加入0.25ml的乙二醇搖勻室溫避光I小時(shí),然后置于4°C透析過夜,之后用0.2ml濃度0.2 !1101/1，？!1值為9.6的碳酸鹽包被溶液將透析后得到的醛化辣根過氧化物酶溶液調(diào)pH值為9.2-9.5，將5mg抗呋喃妥因多克隆抗體溶于1.0ml濃度0.01 mol/L, pH9.6的包被液后立即加入上述醛化后的辣根過氧化物酶溶液中于37°C反應(yīng)I小時(shí)，然后加入0.1ml濃度
3.5mg/ml的NaBH4溶液,混勻于4°C放置2小時(shí),用凝膠過濾層析進(jìn)行純化后,選擇效價(jià)> I:1000的無色或帶棕色澄清液體，即為辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體；
所述的呋喃妥因-BSA免疫原的制備方法為:
步驟一、免疫原制備:
步驟一、稱IOmg對氨基苯甲酸溶入1.1mL 0.2 mol/L HCl中，置于0-4°C攪拌至完全溶解，得到對氨基苯甲酸溶液；然后稱取6mg的NaNO2溶在0.35mL的蒸餾水中，置于0_4°C攪拌至完全溶解，得到NaNO2溶液；將NaNO2溶液逐滴加入到對氨基苯甲酸溶液中，避光反應(yīng)I小時(shí)，得混合溶液A ;
步驟二、稱取0.3-1.2mg的呋喃妥因溶在IOmL含NaCl的硼砂緩沖液中，置于0_4°C下攪拌至完全溶解，得到混合溶液B ;將上述步驟所得混合溶液A解逐滴加入到混合溶液B中，避光反應(yīng)2小時(shí)，得到桔黃色溶液C ；
所述含NaCl的硼砂緩沖液中，硼砂的濃度為0.05mol/L, pH值為8.5，并含有濃度為
0.15mol/L 的 NaCl ；
步驟三、在桔黃色溶液C中添加H3BO3晶體調(diào)節(jié)其pH值至7.4，然后加入94mg牛血清白蛋白、SOmg碳二亞胺和4mg N-羥基琥珀酰亞胺，然后置于室溫?cái)嚢?小時(shí)，得桔黃色溶液D ；
步驟四、將上述步驟所得桔黃色溶液D轉(zhuǎn)移到透析袋中，用0.01mol/L，pH為7.4的PBS緩沖液，在0-4°C下透析五天，每12小時(shí)更換一次PBS緩沖液；將透析后的溶液凍干，得到淡黃色固體粉末即為免疫原呋喃妥因-BSA，將其置于_20°C保存，備用。
[0006]所述的已包被呋喃妥因的發(fā)光板的制備方法為:
步驟一、將呋喃妥因與卵清蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原:
(1)稱取9mg的NaNO2溶于0.3mL的蒸餾水中，得到NaNO2溶液；稱取IOmg呋喃妥因溶在1.6mL 0.2mol/L的鹽酸中，0_4°C攪拌至完全溶解，得到呋喃妥因溶液；然后將所得NaNO2溶液逐滴加入所得呋喃妥因溶液中，避光反應(yīng)0.5小時(shí)；
(2)反應(yīng)結(jié)束后， 加入25mg硫酸胺直至無氮?dú)夥懦?，即得到重氮化的呋喃妥因溶液?br> (3)稱70mg卵清蛋白溶解在4mL的0.lmol/L，pH值為7.5的PBS磷酸緩沖溶液中，得到卵清蛋白溶液；然后將上述步驟所述的重氮化的呋喃妥因溶液逐滴加入到卵清蛋白溶液中，得到混合溶液E ;接著用lmol/L的氫氧化鈉將混合溶液E的pH至調(diào)至7.5，然后置于0-4°C下，避光反應(yīng)18小時(shí)；
(4)將上述步驟避光反應(yīng)后的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到透析袋中，用0.0lmol/L，pH值為7.4的PBS緩沖液，在0-4°C下透析五天，每12小時(shí)更換一次PBS緩沖液；然后將透析液3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，凍干上清液，得到淡黃色固體粉末即為包被抗原呋喃妥因-0VA，將其置于_20°C保存，備用；
步驟二、包被:
(1)用0.05 mol/L，pH值為9.6的碳酸鹽包被溶液將包被抗原配成1.5 μ g/mL的溶液，并向每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加IOOyL,之后4°C下過夜，次日棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次5分鐘；
(2)用封閉溶液封閉上述已包被的聚苯乙烯板，250μ L/孔，37°C孵育I小時(shí)后洗滌，得到已包被呋喃妥因的發(fā)光板。
[0007]—種呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的檢測方法，其具體檢測步驟為:
步驟一、加樣:將各濃度的呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，以50 μ L/孔的加入量加入到已包被呋喃妥因的發(fā)光板的反應(yīng)孔中，然后每孔加入IOOyL采用包被液以1:7000比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體，然后37°C孵育0.5小時(shí)；
步驟二、洗滌:傾出已包被呋喃妥因的發(fā)光板的孔中液體，每孔加入洗滌溶液250μ L，洗滌3次，拍干；
步驟三、加發(fā)光底物液:將發(fā)光底物的A液和B液混合后得混合物，在已包被呋喃妥因的發(fā)光板中每孔加入100 μ L發(fā)光底物液混合物，
步驟四、檢測:用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定每孔的發(fā)光強(qiáng)度；
步驟五、結(jié)果判斷:取標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)做橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品檢測發(fā)光值對數(shù)做縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出來。
[0008]有益效果是:
1、本發(fā)明呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，靈敏度高、檢測范圍寬、操作簡便快速、無毒無污染、光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長且所用儀器簡單，經(jīng)濟(jì)的檢測呋喃妥因的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，同時(shí)提供了其制備方法，以及檢測樣品中呋喃妥因抗生素的方法?？股貧埩魴z測的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有靈敏度高、簡便快速、準(zhǔn)確、安全性好及使用期長的特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的比色ELISA法比較，分析方法簡便快速、靈敏度可以提高一個(gè)數(shù)量級。有望在飼料中呋喃妥因殘留檢測中發(fā)揮重要作用。
[0009]2、本發(fā)明呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒采用呋喃妥因的代謝物與載體偶聯(lián)制備包被抗原，更為經(jīng)濟(jì)，步驟更為簡單，利于工業(yè)化生產(chǎn)；辣根過氧化物酶標(biāo)記物的制備，采用一步法，方法簡單，更適合工業(yè)化生產(chǎn)，且經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證得到了很好的效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為本發(fā)明制備呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的工藝流程圖；
圖2為本發(fā)明的實(shí)施例檢測的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】[0011]一種呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，包括濃縮洗液、陰性對照品、陽性對照品、化學(xué)發(fā)光液、呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體和已包被呋喃妥因的發(fā)光板；具體制備過程如圖1中所示；
所述的濃縮洗液為:含有Tween-20和氯化鈉的磷酸鹽緩沖液；
所述的陰性對照品為:5份以上單獨(dú)存放的除菌過濾后的呋喃妥因檢測為陰性的豬尿混合物；
所述的陽性對照品為:5份以上單獨(dú)存放的除菌過濾后的呋喃妥因檢測為陽性的豬尿混合物；
所述的化學(xué)發(fā)光液，包括A液和B液；A液配制方法為:首先配置0.2 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液，在此緩沖液中加入魯米諾和四苯硼鈉，混合均勻即可得到A液；B液配制方法為:首先配置0.2 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液，在此緩沖液中按重量比加入0.1%H2O2混合均勻即可得到B液；
所述的呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品為濃度分別為0ng/ml、0.lng/ml、0.3 ng/ml、0.9 ng/ml、2.7ng/ml、8.lng/ml呋喃妥因的稀釋液；
所述的辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體的制備方法為:
步驟一、免疫原制備:
(1)稱IOmg對氨基苯甲酸溶入1.1mL 0.2 mol/L HCl中，置于0-4°C攪拌至完全溶解，得到對氨基苯甲酸溶液；然后稱取6mg的NaNO2溶在0.35mL的蒸懼水中，置于0_4°C攪拌至完全溶解，得到NaNO2溶液；將NaNO2溶液逐滴加入到對氨基苯甲酸溶液中，避光反應(yīng)I小時(shí)，得混合溶液A ;
(2)稱取0.3-1.2mg的呋喃妥因溶在IOmL含NaCl的硼砂緩沖液中，置于0_4°C下攪拌至完全溶解，得到混合溶液B ;將上述步驟所得混合溶液A解逐滴加入到混合溶液B中，避光反應(yīng)2小時(shí)，得到桔黃色溶液C ；
所述含NaCl的硼砂緩沖液中，硼砂的濃度為0.05mol/L, pH值為8.5，并含有濃度為0.15mol/L 的 NaCl；
(3)在桔黃色溶液C中添加H3BO3晶體調(diào)節(jié)其pH值至7.4，然后加入94mg牛血清白蛋白、SOmg碳二亞胺和4mg N-羥基琥珀酰亞胺，然后置于室溫?cái)嚢?小時(shí)，得桔黃色溶液D ;
(4)將上述步驟所得桔黃色溶液D轉(zhuǎn)移到透析袋中，用0.01mol/L, pH為7.4的PBS緩沖液，在0-4°C下透析五天，每12小時(shí)更換一次透析液；將透析后的溶液凍干，得到淡黃色固體粉末即為免疫原呋喃妥因-BSA，將其置于_20°C保存，備用。
[0012]步驟二、采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以呋喃妥因-BSA為免疫原，首次免疫劑量為IOOyg/只兔子，首次免疫時(shí)將免疫原溶于入等體積的生理鹽水和弗氏完全佐劑制成乳化劑，頸背部多點(diǎn)注射，加強(qiáng)免疫劑量減半于等體積的生理鹽水和弗氏不完全佐劑混合乳化，首次免疫與二次免疫間隔14天，以后每隔2周免疫一次共免疫五次，最后一次不加佐劑；最后一次免疫7天以后心臟采血，離心得到抗呋喃妥因多克隆抗體。
[0013]步驟三、辣根過氧化物酶標(biāo)記物的制備
用過碘酸鈉法制備酶標(biāo)記呋喃妥因抗體,反應(yīng)體系為:先用Iml濃度5mg/ml的辣根過氧化物酶溶液與0.15ml濃度0.1 mol/L的NaIO4溶液混勻后，置于4°C避光0.5小時(shí)，然后加入0.25ml的乙二醇搖勻室溫避光I小時(shí),然后置于4°C透析過夜,之后用0.2ml濃度0.2 !1101/1，？!1值為9.6的碳酸鹽包被溶液將透析后得到的醛化辣根過氧化物酶溶液調(diào)pH值為9.2-9.5，將5mg抗呋喃妥因多克隆抗體溶于1.0ml濃度0.01 mol/L, pH9.6的包被液后立即加入上述醛化后的辣根過氧化物酶溶液中于37°C反應(yīng)I小時(shí)，然后加入0.1ml濃度
3.5mg/ml的NaBH4溶液,混勻于4°C放置2小時(shí),用凝膠過濾層析進(jìn)行純化后,選擇效價(jià)> I:1000的無色或帶棕色澄清液體，即為辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體；
所述的已包被呋喃妥因的發(fā)光板的制備方法為:
步驟一、將呋喃妥因與卵清蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原: (1)稱取9mg的NaNO2溶于0.3mL的蒸餾水中，得到NaNO2溶液；稱取IOmg呋喃妥因溶在1.6mL 0.2mol/L的鹽酸中，0_4°C攪拌至完全溶解，得到呋喃妥因溶液；然后將所得NaNO2溶液逐滴加入所得呋喃妥因溶液中，避光反應(yīng)0.5小時(shí)；
(2)反應(yīng)結(jié)束后，加入25mg硫酸胺直至無氮?dú)夥懦?，即得到重氮化的呋喃妥因溶液?br> (3)稱70mg卵清蛋白溶解在4mL的0.lmol/L，pH值為7.5的PBS磷酸緩沖溶液中，得到卵清蛋白溶液；然后將上述步驟所述的重氮化的呋喃妥因溶液逐滴加入到卵清蛋白溶液中，得到混合溶液E ;接著用lmol/L的氫氧化鈉將混合溶液E的pH至調(diào)至7.5，然后置于0-4°C下，避光反應(yīng)18小時(shí)；
(4)將上述步驟避光反應(yīng)后的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到透析袋中，用0.01mol/L，pH值為7.4的PBS緩沖液，在0-4°C下透析五天，每12小時(shí)更換一次PBS緩沖液；然后將透析液3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，凍干上清液，得到淡黃色固體粉末即為包被抗原呋喃妥因-0VA，將其置于_20°C保存，備用；
步驟二、包被:
(1)用0.05 mol/L, pH值為9.6的碳酸鹽包被溶液將包被抗原配成1.5 μ g/mL的溶液，并向每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加IOOyL,之后4°C下過夜，次日棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次5分鐘；
(2)用封閉溶液封閉上述已包被的聚苯乙烯板，250μ L/孔，37°C孵育I小時(shí)后洗滌，得到已包被呋喃妥因的發(fā)光板。
[0014]一種呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的檢測方法，其具體檢測步驟為:
步驟一、加樣:將各濃度的呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品溶液以50 μ L/孔的加入量加入到已包被呋喃妥因的發(fā)光板的反應(yīng)孔中，然后每孔加入IOOyL采用包被液以1:7000比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體，然后37°C孵育0.5小時(shí)；
步驟二、洗滌:傾出已包被呋喃妥因的發(fā)光板的孔中液體，每孔加入洗滌溶液250 μ L，洗滌3次，拍干；
步驟三、加發(fā)光底物液:將發(fā)光底物的A液和B液混合后得混合物，在已包被呋喃妥因的發(fā)光板中每孔加入100 μ L發(fā)光底物液混合物，
步驟四、檢測:用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定每孔的發(fā)光強(qiáng)度；
步驟五、結(jié)果判斷:取標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)做橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品檢測發(fā)光值對數(shù)做縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出來。
實(shí)施例
[0015]一種呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，包括濃縮洗液、陰性對照品、陽性對照品、化學(xué)發(fā)光液、呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體和已包被呋喃妥因的發(fā)光板；
所述的濃縮洗液為:含有Tween-20和氯化鈉的磷酸鹽緩沖液；
所述的陰性對照品為:5份以上單獨(dú)存放的除菌過濾后的呋喃妥因檢測為陰性的豬尿混合物；
所述的陽性對照品為:5份以上單獨(dú)存放的除菌過濾后的呋喃妥因檢測為陽性的豬尿混合物；
所述的化學(xué)發(fā)光液，包括A液和B液；A液配制方法為:首先配置0.2 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液，在此緩沖液中加入魯米諾和四苯硼鈉，混合均勻即可得到A液；B液配制方法為:首先配置0.2 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液，在此緩沖液中按重量比加入0.1%H2O2混合均勻即可得到B液；
所述的呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品為濃度分別為0ng/ml、0.lng/ml、0.3 ng/ml、0.9 ng/ml、2.7ng/ml、8.lng/ml呋喃妥因的稀釋液；
所述的辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體的制備方法為:
步驟一、免疫原制備:
(1)稱IOmg對氨基苯甲酸溶入1.1mL 0.2 mol/L HCl中，置于0-4°C攪拌至完全溶解，得到對氨基苯甲酸溶液；然后稱取6mg的NaNO2溶在0.35mL的蒸懼水中，置于0_4°C攪拌至完全溶解，得到NaNO2溶液； 將NaNO2溶液逐滴加入到對氨基苯甲酸溶液中，避光反應(yīng)I小時(shí)，得混合溶液A ;
(2)稱取0.3-1.2mg的呋喃妥因溶在IOmL含NaCl的硼砂緩沖液中，置于0_4°C下攪拌至完全溶解，得到混合溶液B ;將上述步驟所得混合溶液A解逐滴加入到混合溶液B中，避光反應(yīng)2小時(shí)，得到桔黃色溶液C ；
所述含NaCl的硼砂緩沖液中，硼砂的濃度為0.05mol/L, pH值為8.5，并含有濃度為0.15mol/L 的 NaCl ；
(3)在桔黃色溶液C中添加H3BO3晶體調(diào)節(jié)其pH值至7.4，然后加入94mg牛血清白蛋白、SOmg碳二亞胺和4mg N-羥基琥珀酰亞胺，然后置于室溫?cái)嚢?小時(shí)，得桔黃色溶液D ;
(4)將上述步驟所得桔黃色溶液D轉(zhuǎn)移到透析袋中，用0.01mol/L, pH為7.4的PBS緩沖液，在0-4°C下透析五天，每12小時(shí)更換一次透析液；將透析后的溶液凍干，得到淡黃色固體粉末即為免疫原呋喃妥因-BSA，將其置于_20°C保存，備用。
[0016]步驟二、采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以呋喃妥因-BSA為免疫原，首次免疫劑量為IOOyg/只兔子，首次免疫時(shí)將免疫原溶于入等體積的生理鹽水和弗氏完全佐劑制成乳化劑，頸背部多點(diǎn)注射，加強(qiáng)免疫劑量減半于等體積的生理鹽水和弗氏不完全佐劑混合乳化，首次免疫與二次免疫間隔14天，以后每隔2周免疫一次共免疫五次，最后一次不加佐劑；最后一次免疫7天以后心臟采血，離心得到抗呋喃妥因多克隆抗體。
[0017]步驟三、辣根過氧化物酶標(biāo)記物的制備
用過碘酸鈉法制備酶標(biāo)記呋喃妥因抗體,反應(yīng)體系為:先用Iml濃度5mg/ml的辣根過氧化物酶溶液與0.15ml濃度0.1 mol/L的NaIO4溶液混勻后，置于4°C避光0.5小時(shí)，然后加入0.25ml的乙二醇搖勻室溫避光I小時(shí),然后置于4°C透析過夜,之后用0.2ml濃度
0.2 !1101/1，？!1值為9.6的碳酸鹽包被溶液將透析后得到的醛化辣根過氧化物酶溶液調(diào)pH值為9.2-9.5，將5mg抗呋喃妥因多克隆抗體溶于1.0ml濃度0.01 mol/L, pH9.6的包被液后立即加入上述醛化后的辣根過氧化物酶溶液中于37°C反應(yīng)I小時(shí)，然后加入0.1ml濃度
3.5mg/ml的NaBH4溶液,混勻于4°C放置2小時(shí),用凝膠過濾層析進(jìn)行純化后,選擇效價(jià)> I:1000的無色或帶棕色澄清液體，即為辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體；
所述的已包被呋喃妥因的發(fā)光板的制備方法為:
步驟一、將呋喃妥因與卵清蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原:
(1)稱取9mg的NaNO2溶于0.3mL的蒸餾水中，得到NaNO2溶液；稱取IOmg呋喃妥因溶在1.6mL 0.2mol/L的鹽酸中，0_4°C攪拌至完全溶解，得到呋喃妥因溶液；然后將所得NaNO2溶液逐滴加入所得呋喃妥因溶液中，避光反應(yīng)0.5小時(shí)；
(2)反應(yīng)結(jié)束后，加入25mg硫酸胺直至無氮?dú)夥懦?，即得到重氮化的呋喃妥因溶液?br> (3)稱70mg卵清蛋白溶解在4mL的0.lmol/L，pH值為7.5的PBS磷酸緩沖溶液中，得到卵清蛋白溶液；然后將上述步驟所述的重氮化的呋喃妥因溶液逐滴加入到卵清蛋白溶液中，得到混合溶液E ;接著用lmol/L的氫氧化鈉將混合溶液E的pH至調(diào)至7.5，然后置于0-4°C下，避光反應(yīng)18小時(shí)；
(4)將上述步驟避光反應(yīng)后的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到透析袋中，用0.01mol/L，pH值為7.4的PBS緩沖液，在0-4°C下透析五天，每12小時(shí)更換一次PBS緩沖液；然后將透析液3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，凍干上清液，得到淡黃色固體粉末即為包被抗原呋喃妥因-0VA，將其置于_20°C保存，備用；
步驟二、包被:
(1)用0.05 mol/L, pH值為9.6的碳酸鹽包被溶液將包被抗原配成1.5 μ g/mL的溶液，并向每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加IOOyL,之后4°C下過夜，次日棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次5分鐘；
(2)用封閉溶液封閉上述已包被的聚苯乙烯板，250μ L/孔，37°C孵育I小時(shí)后洗滌，得到已包被呋喃妥因的發(fā)光板。
[0018]一種呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的具體檢測步驟:
步驟一、樣品前處理
飼料前處理方法:稱取1.0±0.05g飼料樣本；加入5ml去離子水，充分振蕩至溶解；取出50ul上清用做分析。
[0019]步驟二、檢測步驟
(1)加樣:向發(fā)光板中加入50UL/孔的呋喃妥因代謝物系列標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液及樣品溶液，然后加入呋喃妥因代謝物抗體工作液50uL/孔，加入新鮮稀釋辣根過氧化酶-呋喃妥因抗體(I:7000) 100 μ L/ 孔，370C 0.5 小時(shí);
(2)洗滌:傾出孔中液體，向發(fā)光板中加入300uL/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復(fù)三次；
(3)加發(fā)光液:每孔加入發(fā)光液IOOuL;
(4)結(jié)果判斷:取標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)做橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品檢測發(fā)光值對數(shù)做縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2，圖中標(biāo)準(zhǔn)曲線y=_l.0354x+4.7213，R2=0.9983 ；每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出來，結(jié)果如表I。
[0020]表1:呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品(ng/ml) 發(fā)光值
0.1550000~
0.3183000~
0.960000 —
2.721000 一
8.15500 —
24.3|l8QQ —
【權(quán)利要求】
1.一種呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于:包括濃縮洗液、陰性對照品、陽性對照品、化學(xué)發(fā)光液、呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體和已包被呋喃妥因的發(fā)光板； 所述的濃縮洗液為:含有Tween-20和氯化鈉的磷酸鹽緩沖液； 所述的陰性對照品為:5份以上單獨(dú)存放的除菌過濾后的呋喃妥因檢測為陰性的豬尿混合物； 所述的陽性對照品為:5份以上單獨(dú)存放的除菌過濾后的呋喃妥因檢測為陽性的豬尿混合物； 所述的化學(xué)發(fā)光液，包括A液和B液；A液配制方法為:首先配置0.2 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液 ，在此緩沖液中加入魯米諾和四苯硼鈉，混合均勻即可得到A液；B液配制方法為:首先配置0.2 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液，在此緩沖液中按重量比加入0.1%H2O2混合均勻即可得到B液； 所述的呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品為濃度分別為0ng/ml、0.lng/ml、0.3 ng/ml、0.9 ng/ml、2.7ng/ml、8.lng/ml呋喃妥因的稀釋液； 所述的辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體為，辣根過氧化物酶標(biāo)記的以呋喃妥因-BSA為免疫原免疫新西蘭大白兔所得抗呋喃妥因多克隆抗體；用過碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體，反應(yīng)體系為:先用Iml濃度5mg/ml的辣根過氧化物酶溶液與0.15ml濃度0.1 mol/L的NaIO4溶液混勻后，置于4°C避光0.5小時(shí)，然后加入0.25ml的乙二醇搖勻室溫避光I小時(shí),然后置于4°C透析過夜,之后用0.2ml濃度.0.2 !1101/1，？!1值為9.6的碳酸鹽包被溶液將透析后得到的醛化辣根過氧化物酶溶液調(diào)pH值為9.2-9.5，將5mg抗呋喃妥因多克隆抗體溶于1.0ml濃度0.01 mol/L, pH9.6的包被液后立即加入上述醛化后的辣根過氧化物酶溶液中于37°C反應(yīng)I小時(shí)，然后加入0.1ml濃度.3.5mg/ml的NaBH4溶液,混勻于4°C放置2小時(shí),用凝膠過濾層析進(jìn)行純化后,選擇效價(jià)> I:.1000的無色或帶棕色澄清液體，即為辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體； 所述的呋喃妥因-BSA免疫原的制備方法為: 步驟一、免疫原制備: 步驟一、稱IOmg對氨基苯甲酸溶入1.1mL 0.2 mol/L HCl中，置于0-4°C攪拌至完全溶解，得到對氨基苯甲酸溶液；然后稱取6mg的NaNO2溶在0.35mL的蒸餾水中，置于0_4°C攪拌至完全溶解，得到NaNO2溶液；將NaNO2溶液逐滴加入到對氨基苯甲酸溶液中，避光反應(yīng)I小時(shí)，得混合溶液A ; 步驟二、稱取0.3-1.2mg的呋喃妥因溶在IOmL含NaCl的硼砂緩沖液中，置于0_4°C下攪拌至完全溶解，得到混合溶液B ;將上述步驟所得混合溶液A解逐滴加入到混合溶液B中，避光反應(yīng)2小時(shí)，得到桔黃色溶液C ； 所述含NaCl的硼砂緩沖液中，硼砂的濃度為0.05mol/L, pH值為8.5，并含有濃度為.0.15mol/L 的 NaCl ； 步驟三、在桔黃色溶液C中添加H3BO3晶體調(diào)節(jié)其pH值至7.4，然后加入94mg牛血清白蛋白、SOmg碳二亞胺和4mg N-羥基琥珀酰亞胺，然后置于室溫?cái)嚢?小時(shí)，得桔黃色溶液D ； 步驟四、將上述步驟所得桔黃色溶液D轉(zhuǎn)移到透析袋中，用0.01mol/L，pH為7.4的PBS緩沖液，在0-4°C下透析五天，每12小時(shí)更換一次PBS緩沖液；將透析后的溶液凍干，得到淡黃色固體粉末即為免疫原呋喃妥因-BSA，將其置于-20°C保存，備用； 所述的已包被呋喃妥因的發(fā)光板的制備方法為: 步驟一、將呋喃妥因與卵清蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原: (1)稱取9mg的NaNO2溶于0.3mL的蒸餾水中，得到NaNO2溶液；稱取IOmg呋喃妥因溶在1.6mL 0.2mol/L的鹽酸中，0_4°C攪拌至完全溶解，得到呋喃妥因溶液；然后將所得NaNO2溶液逐滴加入所得呋喃妥因溶液中，避光反應(yīng)0.5小時(shí)； (2)反應(yīng)結(jié)束后，加入25mg硫酸胺直至無氮?dú)夥懦?，即得到重氮化的呋喃妥因溶液? (3)稱70mg卵清蛋白溶解在4mL的0.lmol/L，pH值為7.5的PBS磷酸緩沖溶液中，得到卵清蛋白溶液；然后將上述步驟所述的重氮化的呋喃妥因溶液逐滴加入到卵清蛋白溶液中，得到混合溶液E ;接著用lmol/L的氫氧化鈉將混合溶液E的pH至調(diào)至7.5，然后置于0-4°C下，避光反應(yīng)18小時(shí)； (4)將上述步驟避光反應(yīng)后的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到透析袋中，用0.01mol/L，pH值為7.4的PBS緩沖液，在0-4°C下透析五天，每12小時(shí)更換一次PBS緩沖液；然后將透析液3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，凍干上清液，得到淡黃色固體粉末即為包被抗原呋喃妥因-0VA，將其置于_20°C保存，備用； 步驟二、包被: (1)用0.05 mol/L, pH值為9.6的碳酸鹽包被溶液將包被抗原配成1.5 μ g/mL的溶液，并向每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加IOOyL,之后4°C下過夜，次日棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次5分鐘； (2)用封閉溶液封閉上述已包被的聚苯乙烯板，250μ L/孔，37°C孵育I小時(shí)后洗滌，得到已包被呋喃妥因的發(fā)光板。
2.利用權(quán)利要求1所述的呋喃妥因化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測呋喃妥因殘留的方法，其特征在于:其具體檢測步驟為: 步驟一、加樣:將各濃度的呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，以50 μ L/孔的加入量加入到已包被呋喃妥因的發(fā)光板的反應(yīng)孔中，然后每孔加入IOOyL采用包被液以1:7000比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的呋喃妥因特異性抗體，然后37°C孵育0.5小時(shí)； 步驟二、洗滌:傾出已包被呋喃妥因的發(fā)光板的孔中液體，每孔加入洗滌溶液250μ L，洗滌3次，拍干； 步驟三、加發(fā)光底物液:將發(fā)光底物的A液和B液混合后得混合物，在已包被呋喃妥因的發(fā)光板中每孔加入100 μ L發(fā)光底物液混合物， 步驟四、檢測:用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定每孔的發(fā)光強(qiáng)度； 步驟五、結(jié)果判斷:取標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)做橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品檢測發(fā)光值對數(shù)做縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出來。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK103645310SQ201310578405
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】王善普, 劉姍姍, 王會(huì)會(huì), 王宇東, 吳庭才 申請人:洛陽萊普生信息科技有限公司