一種基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準方法和裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準方法，適用于具有脈沖激發(fā)光和連續(xù)損耗光的STED超分辨顯微系統(tǒng)，首先對樣品進行橫向二維掃描，根據(jù)得到熒光壽命分布和熒光光斑進行橫向?qū)剩缓髮晤w熒光顆粒進行軸向掃描成像，分析帶有熒光強度與壽命分布的軸向二維圖像，調(diào)節(jié)連續(xù)損耗光的發(fā)散度，完成光斑的軸向?qū)省１景l(fā)明還公開了一種基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準裝置。本發(fā)明裝置結(jié)構(gòu)簡潔，方便快速高精度調(diào)整，無需因采用納米金顆粒而添加額外探測光路；調(diào)節(jié)精度高，光斑對準精度可達納米量級。
【專利說明】一種基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準方法和裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于光學(xué)超分辨顯微領(lǐng)域，特別涉及一種受激發(fā)射損耗顯微術(shù)中基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準方法和裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]共聚焦熒光顯微術(shù)具有非侵入性、高特異性和高靈敏度等優(yōu)點，一直是生命科學(xué)領(lǐng)域中的重要研究方法。但是由于光波的衍射效應(yīng)，其成像分辨率被局限于半個波長左右，無法滿足當(dāng)前生命科學(xué)的研究需求。
[0003]為了打破光波衍射極限的限制，進一步探索生命的本質(zhì)和疾病的機理，科學(xué)家們致力于超分辨光學(xué)顯微術(shù)的研究，自20世紀90年代起，已提出了多種光學(xué)超分辨顯微方法:受激發(fā)射損耗顯微術(shù)(Stimulated emission depletion microscopy, STED),光激活定位顯微術(shù)(photoactivated localization microscopy, PALM),隨機光學(xué)重建顯微術(shù)(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM),飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)(saturated structured illumination microscopy, SSIM),等等。在這些方法之中，STED超分辨顯微術(shù)目前具有最快的記錄速度和最具前途的應(yīng)用前景。
[0004]STED超分辨顯微術(shù)首先是由S.ff.Hell于1994年提出的。在一個標準的STED超分辨顯微系統(tǒng)中，一束相位編碼的紅移損耗光被引入共焦系統(tǒng)，通過高數(shù)值孔徑顯微物鏡的聚焦在焦平面產(chǎn)生一個環(huán)形中空光斑(donut spot)。損耗光通過受激輻射作用消耗掉激發(fā)光實心聚焦光斑外圍的激發(fā)電子，抑制光斑外圍的自發(fā)熒光效應(yīng)進而獲得更小的有效點擴散函數(shù)(Point Spread Function, PSF)。因此,最佳的STED成像效果需要激發(fā)光的實心聚焦光斑中心和損耗光的環(huán)形中空聚焦光斑中心精確重合。傳統(tǒng)的方法中，兩聚焦光斑中心對準是通過兩束光分別掃描納米金顆粒進行成像，然后通過對比兩幅像調(diào)整兩束光聚焦光斑的相對位置，多次重復(fù)直至光斑中心重合。這種對準方法存在以下幾個缺點:①需要額外添加散射光成像光路:因為STED顯微系統(tǒng)本身針對熒光波長，收集部分裝有濾除激發(fā)光和損耗光的濾光片，而納米金顆粒則是利用激發(fā)光和損耗光的散射光來成像，因此若要采用納米金顆粒對準需要添加額外光路；②激發(fā)光和損耗光需要單獨掃描成像，其間的樣品漂移會產(chǎn)生誤差需要校正:常見的采集系統(tǒng)多采用雪崩二極管(APD)來記錄掃描強度，但是APD無法分辨收集信號的波長，因此激發(fā)光和損耗光需要單獨掃描成像，對比兩次掃描結(jié)果，勢必會引入樣品漂移誤差。2013年，有國外課題組提出了采用熒光顆粒對STED中兩束光的聚焦光斑中心進行對準(Auto-aligning stimulated emission depletion microscopeusing adaptive optics.0ptics letters, 2013),但是其方法并沒有克服分時掃描引入樣品漂移誤差等問題，另外該方法是通過熒光強度分布來確定聚焦光斑中心的，熒光強度分布依賴于激發(fā)光和損耗光的強度比。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準方法和裝置，通過探測STED顯微術(shù)中由于損耗光引起的熒光光斑橫向和縱向熒光壽命分布變化，調(diào)整壽命點擴散函數(shù)中心與對應(yīng)熒光聚焦光斑中心的相對位置，從而對兩聚焦光斑的中心進行三維對準。本發(fā)明結(jié)構(gòu)簡單，無需采用納米金顆粒，無需添加額外光路，無需分時掃描成像，對準精度在納米量級，特別適用于激發(fā)光為脈沖光、損耗光為連續(xù)光的STED超分辨顯微系統(tǒng)。
[0006]一種基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準方法，適用于具有脈沖激發(fā)光和連續(xù)損耗光的STED超分辨顯微系統(tǒng)，包括以下幾個步驟:
[0007]I)同時啟用脈沖激發(fā)光和連續(xù)損耗光，所述的脈沖激發(fā)光和連續(xù)損耗光轉(zhuǎn)換為圓偏光后經(jīng)顯微物鏡聚焦到熒光樣品表面，收集熒光顆粒發(fā)出的熒光，得到聚焦點的熒光強度和熒光壽命；
[0008]2)橫向移動所述的熒光樣品，重復(fù)步驟1)，獲得對應(yīng)掃描區(qū)域內(nèi)各掃描點的熒光強度信息和突光壽命信息；
[0009]3)對步驟2)獲得的熒光強度信息和熒光壽命信息進行分析，選擇單顆熒光顆粒的突光強度光斑、擬合光斑中心并記錄光斑中心坐標，同時提取所述突光強度光斑對應(yīng)的壽命分布，擬合壽命的最長點并記錄最長點坐標，計算得到光斑中心與壽命最長點的距離；
[0010]4)根據(jù)步驟3)算得的距離，改變所述連續(xù)損耗光入射顯微物鏡的角度，使光斑中心與壽命最長點完全重合，完成光斑的橫向?qū)剩?br> [0011]5)對步驟3)中選擇的單顆熒光顆粒，重復(fù)步驟I)中的操作，選取穿過顆粒中心的軸向切面進行掃描，并移動所述的突光樣品完成軸向二維掃描，獲得對應(yīng)各點的突光強度信息和熒光壽命信息；
[0012]6)根據(jù)步驟5)中單顆熒光顆粒的橢圓熒光光斑及所述熒光光斑對應(yīng)的壽命分布，調(diào)節(jié)所述連續(xù)損耗光的發(fā)散度，使得長壽命區(qū)域貫穿熒光光斑的中間區(qū)域且沿橢圓熒光光斑長軸和短軸呈軸對稱分布，完成光斑的軸向?qū)省?br> [0013]以熒光樣品的顆粒稀疏區(qū)域作為所述步驟2)中的掃描區(qū)域，所述顆粒稀疏區(qū)域確定方法為:單獨使用脈沖激發(fā)光，并將脈沖激發(fā)光調(diào)制為圓偏光，然后由顯微物鏡聚焦到樣品表面，對樣品表面進行二維掃描，收集熒光顆粒發(fā)出的熒光，得到相應(yīng)的掃描圖像，根據(jù)所述掃描圖像上熒光顆粒的分布，選取所述的顆粒稀疏區(qū)域。
[0014]其中，脈沖激發(fā)光在經(jīng)過脈沖激發(fā)光快門之前已調(diào)制為平行光；連續(xù)損耗光在經(jīng)過連續(xù)損耗光快門之前已調(diào)制為平行光，且已經(jīng)過了相位調(diào)制，相位調(diào)制的作用是為了在之后在顯微物鏡的聚焦作用下聚焦光斑成中空面包圈形光斑。
[0015]其中，脈沖激發(fā)光經(jīng)顯微物鏡的聚焦光斑與最終收集信號的多模光纖端面在系統(tǒng)中互為共軛點。
[0016]其中，所述的熒光樣品為100納米熒光顆粒，因為100納米熒光顆粒有較好的抗漂白能力，也可以采用40納米?80納米尺寸的熒光顆粒。
[0017]在步驟2)中，還可以采用振鏡掃描系統(tǒng)來實現(xiàn)樣品的橫向掃描。
[0018]本發(fā)明還提供了一種基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準裝置，包括:
[0019]沿脈沖激發(fā)光光路依次布置的脈沖激發(fā)光生成裝置和脈沖激發(fā)光快門；
[0020]沿連續(xù)損耗光光路依次布置的連續(xù)損耗光生成裝置、連續(xù)損耗光快門和二色鏡；
[0021]四分之一波片，用于將所述的脈沖激發(fā)光和連續(xù)損耗光調(diào)制為圓偏光；
[0022]顯微物鏡，用于將所述圓偏光聚焦至熒光樣品并收集熒光；[0023]信息采集裝置，用于采集所述顯微物鏡收集熒光的強度信息和壽命信息；
[0024]以及與所述信息采集裝置連接的計算機。
[0025]其中，所述的脈沖激發(fā)光生成裝置包括沿光路依次布置的脈沖激光器、第一單模保偏光纖、第一準直透鏡、第一起偏器、第一四分之一波片和第一二分之一波片。
[0026]其中，所述的連續(xù)損耗光生成裝置包括沿光路依次布置的連續(xù)激光器、第二單模保偏光纖、第二準直透鏡、第二起偏器、第二四分之一波片、第二二分之一波片和O?2 π渦旋位相板。
[0027]其中，所述的信息采集裝置包括沿收集熒光的光路依次布置的濾光片、透鏡、多模光纖、雪崩二極管和時間相關(guān)單光子計數(shù)系統(tǒng)，且時間相關(guān)單光子計數(shù)系統(tǒng)分別與所述的計算機和脈沖激發(fā)光生成裝置連接。
[0028]濾光片用于濾除除自發(fā)輻射熒光波長外其他任何波長的光，透鏡用于將收集到的突光聚焦于多模光纖端面，多模光纖與雪崩二極管(APD)相連,雪崩二極管(APD)時間相關(guān)單光子計數(shù)(TCSPC)系統(tǒng)相連，時間相關(guān)單光子技術(shù)系統(tǒng)與計算機相連，時間相關(guān)單光子計數(shù)系統(tǒng)負責(zé)將雪崩二極管記錄的光子數(shù)和光子壽命信息提供給計算機。
[0029]本發(fā)明的工作原理如下:
[0030]經(jīng)相位調(diào)制的脈沖激發(fā)光和連續(xù)損耗光在顯微物鏡的聚焦作用下在橫向分別形成實心圓形聚焦光斑和環(huán)形中空聚焦光斑，在軸向分別形成實心橢圓形聚焦光斑(橢圓長軸沿光軸方向)和瓶頸形中空光斑。
[0031]熒光壽命是指熒光分子在激發(fā)態(tài)的分子數(shù)目衰減到原來的Ι/e所經(jīng)歷的時間，即熒光分子在上能級上的“平均停留時間”。若只開啟激發(fā)光，則激發(fā)光聚焦光斑范圍內(nèi)熒光分子都將被激發(fā)至上能級并自發(fā)輻射躍遷發(fā)射熒光，則不考慮其他環(huán)境因素下整個激發(fā)光斑范圍內(nèi)任意一點突光壽命的表達式可以寫成
[0032]τ (r)=l/kf
[0033]其中，kf是熒光分子自發(fā)輻射躍遷發(fā)射熒光的速率，對于給定的熒光分子種類來說kf值是確定的，則若只開啟激發(fā)光，則最后單顆熒光顆粒對應(yīng)的熒光壽命是均一的，如圖3所示。
[0034]若同時開啟激發(fā)光和損耗光，則激發(fā)光聚焦光斑范圍內(nèi)突光分子都將被激發(fā)至上能級，與只開啟激發(fā)光不同，激發(fā)光斑范圍內(nèi)突光壽命的表達式需要修訂為
[0035]τ (r)=l/(kf+o Isted (r))
[0036]其中，kf是熒光分子自發(fā)輻射躍遷發(fā)射熒光的速率，對于給定的熒光分子種類來說卜值是確定的，O是熒光分子受激輻射的吸收截面，ISTED(r)是聚焦光斑內(nèi)r處的損耗光強度，即存在損耗光的區(qū)域熒光壽命縮短，且縮短程度與損耗光的強度有關(guān)，則若環(huán)形中空損耗光聚焦光斑與實心激發(fā)光聚焦圓斑重合時，重合光斑中心壽命最長，如圖4所不。
[0037]根據(jù)100納米熒光顆粒對應(yīng)重合光斑熒光壽命分布進行納米精度對準，如下表所示:
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準方法，適用于具有脈沖激發(fā)光和連續(xù)損耗光的STED超分辨顯微系統(tǒng)，其特征在于，包括以下幾個步驟: O同時啟用脈沖激發(fā)光和連續(xù)損耗光，所述的脈沖激發(fā)光和連續(xù)損耗光轉(zhuǎn)換為圓偏光后經(jīng)顯微物鏡聚焦到熒光樣品表面，收集熒光顆粒發(fā)出的熒光，得到聚焦點的熒光強度和熒光壽命； 2)橫向移動所述的熒光樣品，重復(fù)步驟1)，獲得對應(yīng)掃描區(qū)域內(nèi)各掃描點的熒光強度信息和熒光壽命信息； 3)對步驟2)獲得的熒光強度信息和熒光壽命信息進行分析，選擇單顆熒光顆粒的熒光強度光斑、擬合光斑中心并記錄光斑中心坐標，同時提取所述突光強度光斑對應(yīng)的壽命分布，擬合壽命的最長點并記錄最長點坐標，計算得到光斑中心與壽命最長點的距離； 4)根據(jù)步驟3)算得的距離，改變所述連續(xù)損耗光入射顯微物鏡的角度，使光斑中心與壽命最長點完全重合，完成光斑的橫向?qū)剩? 5)對步驟3)中選擇的單顆熒光顆粒，重復(fù)步驟I)中的操作，選取穿過顆粒中心的軸向切面進行掃描，并移動所述的突光樣品完成軸向二維掃描，獲得對應(yīng)各點的突光強度信息和熒光壽命信息； 6)根據(jù)步驟5)中單顆熒光顆粒的橢圓熒光光斑及熒光光斑對應(yīng)的壽命分布，調(diào)節(jié)所述連續(xù)損耗光的發(fā)散度，使得長壽命區(qū)域貫穿熒光光斑的中間區(qū)域且沿橢圓熒光光斑長軸和短軸呈軸對稱分布，完成光斑的軸向?qū)省?br> 2.如權(quán)利要求1所述的基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準方法，其特征在于，以熒光樣品的顆粒稀疏區(qū)域作為 所述步驟2)中的掃描區(qū)域。
3.如權(quán)利要求2所述的基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準方法，其特征在于，所述顆粒稀疏區(qū)域確定方法為: 單獨使用脈沖激發(fā)光，并將脈沖激發(fā)光調(diào)制為圓偏光，然后由顯微物鏡聚焦到樣品表面，對樣品表面進行二維掃描，收集熒光顆粒發(fā)出的熒光，得到相應(yīng)的掃描圖像，根據(jù)所述掃描圖像上熒光顆粒的分布，選取所述的顆粒稀疏區(qū)域。
4.如權(quán)利要求1所述的基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準方法，其特征在于，所述的脈沖激發(fā)光和連續(xù)損耗光轉(zhuǎn)換為經(jīng)相位調(diào)制后的平行光。
5.一種基于突光壽命分布的納米精度光斑對準裝置，其特征在于，包括: 沿脈沖激發(fā)光光路依次布置的脈沖激發(fā)光生成裝置和脈沖激發(fā)光快門； 沿連續(xù)損耗光光路依次布置的連續(xù)損耗光生成裝置、連續(xù)損耗光快門和二色鏡； 四分之一波片，用于將所述的脈沖激發(fā)光和連續(xù)損耗光調(diào)制為圓偏光； 顯微物鏡，用于將所述圓偏光聚焦至熒光樣品并收集熒光； 信息采集裝置，用于采集所述顯微物鏡收集熒光的強度信息和壽命信息； 以及與所述信息采集裝置連接的計算機。
6.如權(quán)利要求5所述的基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準裝置，其特征在于，所述的脈沖激發(fā)光生成裝置包括沿光路依次布置的脈沖激光器、第一單模保偏光纖、第一準直透鏡、第一起偏器、第一四分之一波片和第一二分之一波片。
7.如權(quán)利要求5所述的基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準裝置，其特征在于，所述的連續(xù)損耗光生成裝置包括沿光路依次布置的連續(xù)激光器、第二單模保偏光纖、第二準直透鏡、第二起偏器、第二四分之一波片、第二二分之一波片和O~2 π渦旋位相板。
8.如權(quán)利要求5所述的基于熒光壽命分布的納米精度光斑對準裝置，其特征在于，所述的信息采集裝置包括沿收集熒光的光路依次布置的濾光片、透鏡、多模光纖、雪崩二極管和時間相關(guān)單光子計數(shù)系統(tǒng)，且時間相關(guān)單光子計數(shù)系統(tǒng)分別與所述的計算機和脈沖激發(fā)光生成裝置 連接。
【文檔編號】G01N21/64GK103543135SQ201310493645
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】匡翠方, 王軼凡, 劉旭, 修鵬, 方月 申請人:浙江大學(xué)