生物組織樣品中2,3-吲哚醌的濃度的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物組織樣品中2,3-吲哚醌的濃度的測(cè)定方法,包括：生物組織樣品前處理步驟：在0～4℃下，按質(zhì)量比1：（3～5）混合動(dòng)物給予2,3-吲哚醌后采集的生物組織樣品和生理鹽水制得生物組織勻漿樣品，然后按體積比為1：4混合所述生物組織勻漿樣品和內(nèi)標(biāo)物甲醇溶液，渦旋30～90秒后離心取上清液；以及通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分離經(jīng)前處理的生物組織樣品中的2,3-吲哚醌、并測(cè)定生物組織樣品中2,3-吲哚醌的濃度的檢測(cè)步驟。
【專利說(shuō)明】生物組織樣品中2, 3-吲哚醌的濃度的測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種內(nèi)源性活性化合物2,3_吲哚醌的生物 體內(nèi)組織器官樣品（生物組織樣品）中的濃度的測(cè)定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]2, 3-卩引哚醌（2, 3-Indolinedione，Isatin，ISA)，又名靛紅，是近年發(fā)現(xiàn)存在于人 和動(dòng)物體內(nèi)的一種內(nèi)源性活性因子，具有多種生物活性。
[0003]液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS)，尤其是其中的液相色譜-大氣壓電離質(zhì)譜聯(lián) 用技術(shù)（LC-API-MS)，是目前分析生物樣品中痕量物質(zhì)的首選。它兼具了液相色譜與質(zhì)譜兩 種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有高靈敏度和專一性，，并大大縮短分析時(shí)間。
[0004] 目前，已有報(bào)道的2, 3-吲哚醌測(cè)定方法有ECL、GC-MS、LC-MS以及HPLC等方法，這 些方法大多樣品前處理復(fù)雜，有些需要對(duì)生物樣品進(jìn)行多步純化處理，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程比較 繁瑣，而且樣品分析時(shí)間較長(zhǎng)，被用于2, 3-吲哚醌的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究中大批生物樣品 的分析測(cè)試方法還很少，且存在以上問(wèn)題，因此在處理藥代動(dòng)力學(xué)研究中所產(chǎn)生的大量樣 品就需要開發(fā)高通量的快速分析方法，特別是樣品前處理簡(jiǎn)便、檢測(cè)手段靈敏的快速分析 方法。例如中國(guó)專利CN102735764A公開一種血漿中利巴韋林含量的測(cè)定方法，該方法使用 較為簡(jiǎn)便的血漿預(yù)處理方法，并使用LC-MS法檢測(cè)，靈敏度較高。但是目前關(guān)于生物組織樣 品中2, 3-吲哚醌濃度的快速簡(jiǎn)便靈敏的測(cè)定方法還鮮有報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于2, 3-吲哚醌的臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究中存在的生物樣品濃度分析方法中的 問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種高通量快速檢測(cè)生物組織樣品中2, 3-吲哚醌濃度的一 種液質(zhì)聯(lián)用分析方法。
[0006] 在此，本發(fā)明提供一種生物組織樣品中2, 3-吲哚醌的濃度的測(cè)定方法，包括： 生物組織樣品前處理步驟：在〇?4°C下，按質(zhì)量比1 : (3?5)混合動(dòng)物給予2, 3-吲 哚醌后采集的生物組織樣品和生理鹽水制得生物組織勻漿樣品，然后按體積比為1 :4混合 所述生物組織勻漿樣品和內(nèi)標(biāo)物甲醇溶液，渦旋30?90秒后離心取上清液；以及 通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分離經(jīng)前處理的生物組織樣品中的2, 3-吲哚醌、并測(cè)定生物 組織樣品中2, 3-吲哚醌的濃度的檢測(cè)步驟； 其中，液相色譜條件包括：色譜柱為XBridgeC18, 5iim，2.IX50mm;色譜流動(dòng)相A為濃 度為〇. 1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為濃度為0. 1%甲酸甲醇，以流動(dòng)相A先減少后增加且流 動(dòng)相B先增加后減少的雙梯度進(jìn)行洗脫； 質(zhì)譜條件包括：質(zhì)譜掃描類型為正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子源為電噴霧離子源；霧化氣 壓力為40psi;氣體流速為8L/min;毛細(xì)管電壓為5500V;離子源溫度為550°C，內(nèi)標(biāo)法定 量。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)甲醇蛋白沉淀法處理生物組織樣品，用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器分析生 物組織樣品中2, 3-吲哚醌的濃度。因此，本發(fā)明的方法具有前處理簡(jiǎn)便、檢測(cè)手段靈敏專 一、檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的方法的準(zhǔn)確度、精密度及檢測(cè)限符合生物樣品分析方法學(xué) 驗(yàn)證要求，能夠滿足2, 3-吲哚醌的藥代動(dòng)力學(xué)研究中生物組織樣品的濃度測(cè)定需要。
[0008] 本發(fā)明中，生物組織樣品可為脾臟、心臟、胃、腎臟、肺、肌肉、睪丸、胰腺和/或脂 肪,此時(shí)生物組織樣品和生理鹽水的質(zhì)量比可為1 :3。
[0009] 本發(fā)明中，生物組織樣品還可為肝、腦樣、卵巢、子宮、前列腺、大腸、小腸、皮膚 和/或膀胱，此時(shí)生物組織樣品和生理鹽水的質(zhì)量比可為1 :5。
[0010] 在所述生物組織樣品前處理步驟中，所述內(nèi)標(biāo)物甲醇溶液優(yōu)選為50ng/mL的奎 硫平甲醇溶液。
[0011] 在所述檢測(cè)步驟中，所述液相色譜條件還包括：柱溫為為40°c、自動(dòng)進(jìn)樣器溫度 為4°C、流速為500iiL/min、進(jìn)樣量為liiL。
[0012] 又，在所述檢測(cè)步驟中，液相色譜的洗脫梯度可為：

【權(quán)利要求】
1. 一種生物組織樣品中2,3_吲哚醌的濃度的測(cè)定方法，其特征在于，所述測(cè)定方法包 括：生物組織樣品前處理步驟：在O?4°C下，按質(zhì)量比1 : (3?5)混合動(dòng)物給予2, 3-吲 哚醌后采集的生物組織樣品和生理鹽水制得生物組織勻漿樣品，然后按體積比為1 : 4混 合所述生物組織勻漿樣品和內(nèi)標(biāo)物甲醇溶液，渦旋30?90秒后離心取上清液；以及通過(guò) 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分離經(jīng)前處理的生物組織樣品中的2, 3-吲哚醌、并測(cè)定生物組織樣品 中2, 3-吲哚醌的濃度的檢測(cè)步驟；其中，液相色譜條件包括：色譜柱為XBridge C18, 5 ii m， 2. I X 50mm;色譜流動(dòng)相A為濃度為0. I %甲酸水溶液，流動(dòng)相B為濃度為0. I %甲酸甲醇， 以流動(dòng)相A先減少后增加且流動(dòng)相B先增加后減少的雙梯度進(jìn)行洗脫； 質(zhì)譜條件包括：質(zhì)譜掃描類型為正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子源為電噴霧離子源；霧化氣 壓力為40psi ;氣體流速為8L/min ;毛細(xì)管電壓為5500V ;離子源溫度為550°C，內(nèi)標(biāo)法定 量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述生物組織樣品為脾臟、心臟、胃、 腎臟、肺、肌肉、睪丸、胰腺和/或脂肪，所述質(zhì)量比為1 : 3。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述生物組織樣品為肝、腦樣、卵巢、 子宮、前列腺、大腸、小腸、皮膚和/或膀胱，所述質(zhì)量比為1 : 5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，在所述生物組織樣品前 處理步驟中，所述內(nèi)標(biāo)物甲醇溶液為50ng/mL的奎硫平甲醇溶液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，液相色譜條件還包括： 柱溫為40°C、自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4°C、流速為500ii L/min、進(jìn)樣量為I ii L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，液相色譜的洗脫梯度 為：
〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述質(zhì)譜條件還包括： 用于定量分析的離子對(duì)為：2, 3-吲哚醌：148 - 65. 1 ;奎硫平：384. 1 - 253. 1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述測(cè)定方法的最低檢 測(cè)限為10ng/mL。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1?8中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述測(cè)定方法的相對(duì)誤 差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在15 %以內(nèi)。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK104345097SQ201310333153
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月2日
【發(fā)明者】陳春麟, 呂文旭, 陳昊, 史卉妍, 汪俊 申請(qǐng)人:上海美迪西生物醫(yī)藥有限公司