專利名稱：黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法及其特征指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥指紋圖譜分析方法，特別是黃芪顆粒HPLC特征指紋圖譜的測(cè)定方法以及由此方法所得到的黃芪顆粒的特征指紋圖譜。
背景技術(shù)：
我國(guó)傳統(tǒng)的中藥及其制劑大多缺乏嚴(yán)密的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)的檢測(cè)手段，難以有效的控制其內(nèi)在質(zhì)量，不能保證用藥的安全、有效，也不符合國(guó)際醫(yī)藥市場(chǎng)的要求，嚴(yán)重制約了我國(guó)中藥行業(yè)的發(fā)展。加強(qiáng)中藥材質(zhì)量控制研究是中藥規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵問題。只有對(duì)中藥材進(jìn)行科學(xué)的質(zhì)量控制，才能保證中藥質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)中藥的“安全、有效、穩(wěn)定、可控”。黃芪顆粒收載于《中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)》，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào):WS3-B-2224_96，是黃芪藥材全成分提取物，為棕黃色顆粒，該藥療效確切，臨床應(yīng)用廣泛，對(duì)慢性腎病、心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、腫瘤化療放療以及手術(shù)后、慢性鼻炎、骨質(zhì)疏松等疾病具有較好的臨床效果。該標(biāo)準(zhǔn)中主要以薄層色譜定性鑒別方法控制制劑質(zhì)量，目前市場(chǎng)上生產(chǎn)黃芪顆粒的廠家較多，臨床需求量巨大，現(xiàn)行的質(zhì)量控制技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)不能滿足黃芪顆粒應(yīng)用發(fā)展之需要。近年來，關(guān)于黃芪顆粒質(zhì)量控制已有一定研究報(bào)道，有學(xué)者采用分光光度法建立黃芪顆粒中總黃酮的含量測(cè)定方法，四川大學(xué)華西藥學(xué)院對(duì)黃芪顆粒中黃芪甲苷和總皂苷含量測(cè)定進(jìn)行了研究，這些研究為黃芪顆粒的質(zhì)量控制提供了一定參考，具有一定價(jià)值。目前，也有一些采用HPLC建立黃芪顆粒的特征指紋圖譜分析方法，比如:公開號(hào)為“CN102353729A”、名稱為“一種黃芪藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法”的專利文獻(xiàn)中，采用乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相系統(tǒng)，但得到的指紋圖譜中只有7個(gè)共有色譜峰；并且其針對(duì)的是黃芪藥材，而不是黃芪顆粒制劑。公告號(hào)為“CN101327246B”、名稱為“黃芪藥材、中間體及其制劑的指紋圖譜檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜”的專利文件中，采用80%-95%的甲醇作為提取溶劑，乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相系統(tǒng)，其得到的指紋圖譜分離度不是很好，只有19個(gè)特征色譜峰。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于:提供一種黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法及其特征指紋圖譜。本發(fā)明通過對(duì)黃芪顆粒HPLC指紋圖譜的研究，提供了一種快速評(píng)價(jià)黃芪顆粒質(zhì)量的方法，彌補(bǔ)了現(xiàn)有質(zhì)量控制技術(shù)的不足，使黃芪顆粒的質(zhì)量控制技術(shù)更為完善、科學(xué)。本發(fā)明的技術(shù)方案:黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法包括以下步驟:( I)供試品溶液的制備:取黃芪顆粒粉碎，過篩，稱取粉末，加甲醇溶液溶解，超聲提取I 2次，每次5 30min，然后冷卻，補(bǔ)足損失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；(2)對(duì)照品溶液的制備:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對(duì)照品，分別加入甲醇制成對(duì)照品溶液；(3)測(cè)定:分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖；供試品溶液注入高效液相色譜儀后，以甲醇-0.5%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；(4)用指紋圖譜軟件對(duì)所得的圖譜進(jìn)行處理，即得到黃芪顆粒特征指紋圖譜。前述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法中，高效液相色譜測(cè)定時(shí)的色譜條件為:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.5%甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ;流速 ImL.mirT1 ;柱溫 30 °C ;檢測(cè)波長(zhǎng) 254nm。前述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法中，供試品溶液的制備過程為:取黃芪顆粒粉碎，過60目篩，精密稱取粉末1.0g,加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超聲提取5min，然后冷卻，補(bǔ)足損失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μ m微孔濾膜，即得供試品溶液。前述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法中，對(duì)照品溶液的制備為:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對(duì)照品，分別加入甲醇，制成每ImL分別含0.562mg毛蕊異黃酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊異黃酮、0.274mg芒柄花素的對(duì)照品溶液。前述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法中，步驟(3)中分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5-20 μ L，優(yōu)選為10 μ L0前述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法中，流動(dòng)相梯度洗脫過程中，洗脫液的A、B相變化為:0 lOmin，A相 2%-2% ；10 15min，A相 2%-3% ；15 20min，A相 3%-10% ;20_25min，A 相 10%-15% ；25-40min, A 相 15%-20% ；40-45min, A 相 20%-30% ；45-50min, A 相 30%-40% ；50-60min, A 相 40%-56% ；60-72min, A 相 56%-70% ；72-80min, A 相 70%-90% ；80-90min, A 相90%-90%。前述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法中，配制好的對(duì)照品溶液儲(chǔ)存在4V的冰箱中備用。如前所述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法得到的黃芪顆粒特征指紋圖譜；所述圖譜中的共有峰為23個(gè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):1.本發(fā)明采用高效液相色譜法，建立黃芪顆粒的特征指紋圖譜分析方法，除了應(yīng)用常用的相似度分析外，還采用Simca-Pll.5軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)，同時(shí)結(jié)合SPSS聚類分析對(duì)多個(gè)批次樣品進(jìn)行系統(tǒng)分析，能更加全面、客觀、科學(xué)評(píng)價(jià)黃芪顆粒的質(zhì)量，為黃芪顆粒的合理用藥及進(jìn)一步藥效研究提供依據(jù)與參考。2.本發(fā)明建立了黃芪顆粒HPLC特征指紋圖譜共有模式，標(biāo)定了 23個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中4個(gè)共有峰，比現(xiàn)有技術(shù)指認(rèn)的色譜峰多，表明其建立的指紋圖譜技術(shù)含量高。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同生產(chǎn)時(shí)間30批次黃芪顆粒被分為兩大類，兩類樣品的色譜峰共有模式具有一定差異，這與黃芪顆粒原料黃芪藥材有兩個(gè)法定來源相吻合。因而本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可用于黃芪顆粒樣品的質(zhì)量控制。3.由于指紋圖譜不是為了測(cè)定某個(gè)成分的精確含量，而是要充分反映化學(xué)成分的信息。因此，本發(fā)明選擇在254nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，其出峰較多，反映的信息較完全；各個(gè)峰吸收值良好，基線平穩(wěn)，也避免了近紫外雜質(zhì)峰較大吸收情況。4.本發(fā)明方法所得黃芪顆粒指紋圖譜的峰多，峰形好，易于鑒別，相似性高，準(zhǔn)確可靠。
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。


圖1是30批次黃芪顆粒指紋圖譜疊加圖；圖2是黃芪顆粒樣品的共有模式圖譜；圖3是不同批次黃芪顆粒樣品主成分分析結(jié)果圖；圖4是不同批次黃芪顆粒樣品聚類分析結(jié)果圖；圖5是黃芪顆粒樣品的共有模式差異性比較圖；圖6是選用不同提取溶劑的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖7是選取不同提取溶劑用量的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖8是選取不同超聲提取時(shí)間的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖9是以甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖10是以乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖11是以甲醇-0.5%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖12是以甲醇-0.1%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖13是以甲醇-0.1%乙酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖14是用色譜柱Diamonsil C18 (4.6mm*150mm, 25 μ m)測(cè)得的黃苗顆粒HPLC指紋圖譜；圖15是用色譜柱Hypersil ODS (4.0*250mm，5 μ m)測(cè)得的黃芪顆粒HPLC指紋圖
-1'Tfe1曰；圖16 是用色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18C4.6*250mm, 5 μ m)測(cè)得的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖17 是用色譜柱 Agilent ZORBAX SB-C18C4.6*150mm, 5 μ m)測(cè)得的黃芪顆粒 HPLC指紋圖譜；圖18是用色譜柱Phecda C18 (4.6*250mm, 5 μ m)測(cè)得的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖 19 是在 210nm、230nm、254nm、270nm、290nm、300nm、330nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖20是柱溫為25°C、30°C、35°C時(shí)測(cè)得的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例1:黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法包括以下步驟:(I)供試品溶液的制備:取黃芪顆粒粉碎，過60目篩，精密稱取粉末l.0g，加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超聲提取5min，然后冷卻，補(bǔ)足損失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μ m微孔濾膜，即得供試品溶液；(2)對(duì)照品溶液的制備:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對(duì)照品，分別加入甲醇，制成每ImL分別含0.562mg毛蕊異黃酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊異黃酮、0.274mg芒柄花素的對(duì)照品溶液(儲(chǔ)存在4°C的冰箱中備用)；(3)測(cè)定:色譜條件:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(5 μ mX4.6X 250mm);流動(dòng)相 A 為甲醇，流動(dòng)相 B 為 0.5% 甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ；流速ImL.miiT1 ;柱溫30°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm ;分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μ L，注入高效液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖；供試品溶液注入高效液相色譜儀后，以甲醇-0.5%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；梯度洗脫過程中，洗脫液的Α、B相變化為:
O lOmin，A 相 2%_2% ;10 15min，A 相 2%_3% ;15 20min，A 相 3%_10% ；20-25min, A相 10%-15% ；25-40min, A 相 15%-20% ；40-45min, A 相 20%-30% ；45-50min, A 相 30%-40% ；50-60min, A 相 40%-56% ；60-72min, A 相 56%-70% ；72-80min, A 相 70%-90% ；80-90min, A 相90%-90% ；(4)用指紋圖譜軟件對(duì)所得的圖譜進(jìn)行處理，即得到黃芪顆粒特征指紋圖譜。本發(fā)明的實(shí)施例2:黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法包括以下步驟:(I)供試品溶液的制備:取黃芪顆粒粉碎，過60目篩，精密稱取粉末l.0g，加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超聲提取lOmin，然后冷卻，補(bǔ)足損失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過
0.45 μ m微孔濾膜，即得供試品溶液；(2)對(duì)照品溶液的制備:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對(duì)照品，分別加入甲醇，制成每ImL分別含0.562mg毛蕊異黃酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊異黃酮、0.274mg芒柄花素的對(duì)照品溶液(儲(chǔ)存在4°C的冰箱中備用)；(3)測(cè)定:色譜條件:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(5 μ mX4.6X 250mm);流動(dòng)相 A 為甲醇，流動(dòng)相 B 為 0.5% 甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ；流速ImL.miiT1 ;柱溫30°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm ;分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各
5μ L，注入高效液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖；供試品溶液注入高效液相色譜儀后，以甲醇-0.5%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；(4)用指紋圖譜軟件對(duì)所得的圖譜進(jìn)行處理，即得到黃芪顆粒特征指紋圖譜。本發(fā)明的實(shí)施例3:黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法包括以下步驟:(I)供試品溶液的制備:取黃芪顆粒粉碎，過60目篩，精密稱取粉末1.0g，加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超聲提取2次，每次30min，然后冷卻，補(bǔ)足損失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μ m微孔濾膜，即得供試品溶液；(2)對(duì)照品溶液的制備:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對(duì)照品，分別加入甲醇，制成每ImL分別含0.562mg毛蕊異黃酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊異黃酮、0.274mg芒柄花素的對(duì)照品溶液；(3)測(cè)定:色譜條件:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.5%甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ;流速ImL.mirT1 ;柱溫30°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm ;分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20 μ L，注入高效液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖；供試品溶液注入高效液相色譜儀后，以甲醇-0.5%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；(4)用指紋圖譜軟件對(duì)所得的圖譜進(jìn)行處理，即得到黃芪顆粒特征指紋圖譜。實(shí)驗(yàn)例:1.儀器與試藥1.1 儀器安捷倫1260高效液相色譜儀(Agilent G1315D-1260DAD檢測(cè)器);KQ_250B型超聲波清潔器(昆山市超聲儀器有限公司，功率250w);電子分析天平(A1205型，梅特勒-托利多儀器，上海有限公司)。
1.2 試藥甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；水為蒸餾水；其他試劑為分析純。毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素，其批號(hào)分別為:M-020-110119，M-021-101215, C-018-101228, M-013-101116，成都瑞芬思生物科技有限公司提供；黃芪顆粒，貴州漢方制藥有限公司提供的2010-2011年生產(chǎn)的30批次黃芪顆粒，其樣品信息見表
1表I不同批次樣品信息表
權(quán)利要求
1.一種黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)供試品溶液的制備:取黃芪顆粒粉碎，過篩，稱取粉末，加甲醇溶液溶解，超聲提取I 2次，每次5 30min，然后冷卻，補(bǔ)足損失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液； (2)對(duì)照品溶液的制備:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對(duì)照品，分別加入甲醇制成對(duì)照品溶液； (3)測(cè)定:分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖；供試品溶液注入高效液相色譜儀后，以甲醇-0.5%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫； (4)用指紋圖譜軟件對(duì)所得的圖譜進(jìn)行處理，即得到黃芪顆粒特征指紋圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法，其特征在于:高效液相色譜測(cè)定時(shí)的色譜條件為:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.5% 甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ;流速 ImL.mirT1 ;柱溫 30°C ;檢測(cè)波長(zhǎng) 254nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法，其特征在于:供試品溶液的制備過程為:取黃芪顆粒粉碎，過60目篩，精密稱取粉末1.0g，加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超聲提取5min，然后冷卻，補(bǔ)足損失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μ m微孔濾膜，即得供試品溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法，其特征在于:對(duì)照品溶液的制備為:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對(duì)照品，分別加入甲醇，制成每ImL分別含0.562mg毛蕊異黃酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊異黃酮、0.274mg芒柄花素的對(duì)照品溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法，其特征在于:步驟(3)中分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5-20 μ L0
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法，其特征在于:步驟(3)中分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μ L0
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法，其特征在于:流動(dòng)相梯度洗脫過程中，洗脫液的Α、B相變化為:0 lOmin，A相2%_2% ;10 15min，A相2%_3% ；15 20min，A 相 3%_10% ；20-25min, A 相 10%_15% ；25-40min, A 相 15%_20% ；40-45min, A相 20%-30% ；45-50min, A 相 30%-40% ；50-60min, A 相 40%-56% ；60-72min, A 相 56%-70% ；72-80min,A 相 70%-90% ；80-90min, A 相 90%_90%。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法，其特征在于:配制好的對(duì)照品溶液儲(chǔ)存在4°C的冰箱中備用。
9.如權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法得到的黃芪顆粒特征指紋圖譜。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的黃芪顆粒特征指紋圖譜，其特征在于:所述圖譜中的共有峰為23個(gè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃芪顆粒指紋圖譜的測(cè)定方法，包括以下步驟供試品溶液的制備、對(duì)照品溶液的制備、高效液相色譜儀測(cè)定及對(duì)數(shù)據(jù)和圖譜的處理，以及由該方法得到的黃芪顆粒特征指紋圖譜。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所得黃芪顆粒指紋圖譜的峰多，峰形好，峰分離效果好，峰面積較大，易于鑒別，相似性高，準(zhǔn)確可靠；本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可用于黃芪顆粒樣品的質(zhì)量控制，能更加全面、客觀、科學(xué)地評(píng)價(jià)黃芪顆粒的質(zhì)量，為黃芪顆粒的合理用藥及進(jìn)一步藥效研究提供了依據(jù)與參考。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103149300SQ201310068779
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者周欣, 陳華國(guó), 趙超, 龔小見, 趙楊, 鄧杰 申請(qǐng)人:貴州師范大學(xué)