專利名稱：一種用于檢測克倫特羅的電化學修飾電極及檢測裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及分析化學和檢測領(lǐng)域，更具體地，本實用新型涉及一種用于克倫特羅的電化學修飾電極及檢測裝置。
背景技術(shù)：
克倫特羅(CLB)于1964年在美國首次合成，是一種腎上腺激素受體激動藥，它的化學式為a-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽，是瘦肉精的主要成分，又名咳哮素、氨哮素?？藗愄亓_具有藥用價值，可用于治療哮喘病，臨床醫(yī)學上主要用于擴張支氣管、增加肺通氣量?？藗愄亓_也具有蛋白同化作用，在動物體內(nèi)能增強脂解和減慢蛋白質(zhì)分解代謝，可以減少脂肪的生成提高瘦肉率。因而，不法商戶將其加入到飼料或飲水中使禽畜肌肉比例提高，造成該藥在動物體內(nèi)蓄積，尤其是在肝臟組織中的濃度最高。殘留的克倫特羅通過食物鏈被人類食用后會出現(xiàn)頭暈、心悸等中毒癥狀，因此，濫用瘦肉精已成為重大的食品安全問題。·中國政府嚴禁在食品生產(chǎn)中使用克倫特羅，從2002年12月起，農(nóng)業(yè)部的第235號公告修訂了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》，規(guī)定克倫特羅在所有動物性食品中不得檢出。我國不斷加大打擊力度，但目前濫用情況仍非常嚴重。造成克倫特羅屢禁不止的原因一方面是利益驅(qū)使；另一方面是現(xiàn)在檢測克倫特羅的方法、儀器還不完善。為了避免此類事故的再次發(fā)生，食品中克倫特羅的快速、準確檢測成為當前高度重視和亟待解決的問題。檢測克倫特羅殘留常用的傳統(tǒng)方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、酶標記免疫吸附測定法(ELISA)、毛細管電泳法(CE)等。我國目前已將HPLC法作為檢測鹽酸克倫特羅的確證性方法，其具有靈敏度高，假陽性率低等特點。但是色譜法在實際應(yīng)用中受到一定的限制，主要是因為此法具有前處理過程煩瑣、檢測時間長，需貴重儀器等缺點。ELISA法是檢測鹽酸克倫特羅較高效的免疫分析法，但其假陽性率較高，CE法在分析樣品過程中同樣也存著一些亟待解決的問題，缺乏合適的檢測器和檢測時間較長是制約該法應(yīng)用的主要瓶頸。電化學免疫傳感器是利用抗原抗體結(jié)合的高度特異性，將免疫分析同電化學檢測技術(shù)融為一體的化學傳感器，由于其儀器設(shè)備簡單、制作方便且成本低廉等優(yōu)點而在食品安全、生命科學及臨床醫(yī)學等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但是在檢測靈敏度上還有待進一步提高。因此，本領(lǐng)域迫切需要一種新型的、高靈敏度、快速方便檢測克倫特羅的檢測電極及檢測裝置。
發(fā)明內(nèi)容為了快速靈敏地檢測克倫特羅，本實用新型提供了一種用于快速檢測克倫特羅的電化學修飾電極。本實用新型還提供了一種檢測克倫特羅的電化學檢測裝置。本實用新型提供了一種用于快速檢測克倫特羅的電化學修飾電極，所述電化學修飾電極包括基底電極；設(shè)置于基底電極外表面的多壁碳納米管(MWCNTs);設(shè)置于多壁碳納米管外表面的EDC-NHS交聯(lián)劑層；設(shè)置于EDC-NHS交聯(lián)劑外表面的克倫特羅單克隆抗體層(anti-CLB);以及設(shè)置于克倫特羅單克隆抗體外表面的BSA封閉劑層。本實用新型還提供了一種用于快速檢測克倫特羅的電化學檢測裝置，所述檢測裝置為電解池，所述電解池包括工作電極，對電極，參比電極，設(shè)置在電解池頂部的支架，所述支架用于放置所述對電極和參比電極；以及設(shè)置在電解池底部的電解液。所述工作電極即為所述電化學修飾電極，其包括了新型材料銀-氧化石墨烯-克倫特羅納米復(fù)合物材料(Ag-GO-CLB)，并采用了 anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極。所述電化 學修飾電極包括基底電極；設(shè)置于基底電極外表面的多壁碳納米管(MWCNTs);設(shè)置于多壁碳納米管外表面的EDC-NHS交聯(lián)劑層；設(shè)置于EDC-NHS交聯(lián)劑外表面的克倫特羅單克隆抗體層(anti-CLB);以及設(shè)置于克倫特羅單克隆抗體外表面的BSA封閉劑層。 在本實用新型中，所述的基底電極是玻碳電極。在本實用新型中，所述的對電極是鉬電極。在本實用新型中，所述的參比電極是Ag/AgCl參比電極。在本實用新型中，所述的電解液為I. 0 M KCl溶液。本實用新型的有益效果在于本實用新型利用anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極對克倫特羅進行直接電化學檢測時，在一定的濃度范圍內(nèi)，克倫特羅的濃度與銀納米粒子的氧化峰電流值的減小量具有線性相關(guān)性，檢測線性范圍為0. 01-10. 0 ng/mL，檢測限達到6.8 pg/mL。anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極制備簡單、響應(yīng)速度快。本實用新型anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極還具有良好的選擇性，當克倫特羅的濃度為0.1 mg mL時，相同濃度的萊克多巴胺、多巴酚丁胺、沙丁胺醇對克倫特羅的檢測基本無影響。本實用新型電極的制備和檢測操作簡單方便，使用儀器價格便宜，成本低廉。電極材料無污染，不會造成環(huán)境污染，符合人們對與環(huán)保的要求。

圖I是本實用新型電化學修飾電極的剖面結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本實用新型電化學修飾電極的構(gòu)成示意圖。圖3本實用新型電化學修飾電極所用的納米復(fù)合材料Ag-GO-CLB的制備過程。圖4是本實用新型檢測裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5表示anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極檢測克倫特羅的工作曲線，橫坐標為克倫特羅的對數(shù)濃度，縱坐標為電流響應(yīng)的減小值。內(nèi)插圖為anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極在不同克倫特羅濃度下的DPV響應(yīng)，橫坐標為電位，縱坐標為電流響應(yīng)大小。圖6是本實用新型anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極的特異性檢測結(jié)果柱狀圖，橫坐標為不同的分析底液，縱坐標為電流響應(yīng)大小。
具體實施方式
以下對本實用新型的各方面進行詳述。本發(fā)明的以下實施例并不是對本發(fā)明的限制。因此，在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以權(quán)利要求書為保護范圍。如圖I-圖2、圖4所示，I-基底電極(玻碳電極)，2_多壁碳納米管，3-EDC-NHS交聯(lián)劑層，4-克倫特羅單克隆抗體層，5 - BSA層，6-工作電極(電化學修飾電極)，7-對電極，8-Ag/AgCl參比電極，9-檢測池容器，10-電解液，11-電極支架。如圖I-圖2所示，在玻碳電極I表面修飾一層多壁碳納米管2，通過EDC-NHS雙功能團交聯(lián)試劑3將克倫特羅單克隆抗體4固定在基底電極I表面，形成穩(wěn)定的anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極6。利用循環(huán)伏 安、示差脈沖伏安、紫外吸收光譜、透射電鏡可以對修飾電極6的電化學行為及物理性狀等進行了表征。碳納米管能提高電極的有效表面積，并加速電子的傳遞。因此，本實用新型用多壁碳納米管2，選用多壁碳納米管2 (MWCNTs)滴涂于玻碳電極I表面進行修飾。本實用新型中，氧化石墨烯是一種單層化的二維碳材料，表面含有大量的含氧基團，這些基團使其表面帶負電荷，電荷之間的靜電斥力可以使其穩(wěn)定地分散在水相體系中，并且可利用雙功能團交聯(lián)試劑使其與帶氨基的有機小分子克倫特羅發(fā)生化學反應(yīng)。本實用新型首次公開了 Ag-GO-CLB納米復(fù)合材料的制備方法，如圖3所示。首先參照Hmnmers法通過氧化石墨粉合成氧化石墨烯。再利用硼氫化鈉原位還原硝酸銀合成了 Ag-GO納米材料，最后通過EDC-NHS的交聯(lián)作用制備了新型的Ag-GO-CLB納米復(fù)合材料。將此復(fù)合材料應(yīng)用于化學修飾電極，通過對銀納米粒子的電化學信號檢測，實現(xiàn)了對克倫特羅的快速檢測。Ag-GO-CLB納米復(fù)合材料用于和自由CLB與抗體發(fā)生競爭性免疫反應(yīng)。如圖2所示，本實用新型電化學修飾電極的制備過程如下 I)玻碳電極I的預(yù)處理對基體電極I (玻碳電極)依次用0. 3和0. 05 um Al2O3粉末、清潔干凈的麂皮上反復(fù)拋光至鏡面后，水下沖洗，依次經(jīng)0.2 mo I/L HCl溶液、0. 2 mo I/L NaOH溶液、乙醇、二次去離子水超聲洗滌5min，電極I晾干后備用。2)多壁碳納米管2 (MWCNTs)的修飾修飾前預(yù)先將碳納米管羧基化，取IOML羧基化的碳納米管DMF溶液，滴涂于處理后的GCE電極I表面，于室溫反應(yīng)lh，形成多壁碳納米管2，用二次去離子水沖洗后在紅外燈下烘干。3) anti-CLB 的修飾將上述修飾電極置于0.8 M EDC和0. IM NHS混合液中活化30min，用二次去離子水和PBS緩沖液沖洗后在紅外燈下烘干。取2 ML 0. 75 mg/mL anti-CLB滴涂于電極表面，于37° C反應(yīng)2 h，形成克倫特羅單克隆抗體層4。最后用1.0% BSA反應(yīng)0.5 h，以涂覆的BSA層5封閉非特異性結(jié)合位點。得到的電化學修飾電極6用二次去離子水沖洗后于4° C保存待用。本實用新型anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極的結(jié)構(gòu)，如圖I所示，基底電極為玻碳電極I，涂覆于玻碳電極I表面的是多壁碳納米管2，最外層是克倫特羅單克隆抗體層4。本實用新型中，將MWCNTs和antiCLB依次修飾到基底電極I的表面，提高了電極的有效表面積，并加速電子的傳遞。以本實用新型這種結(jié)構(gòu)的修飾電極作為工作電極檢測樣品中的克倫特羅，具有極其優(yōu)異的檢出效果。利用本實用新型電化學修飾電極檢測克倫特羅，是基于如下原理檢測是在0. lmol/L KCl溶液中進行的，溶液中的標記抗原Ag-GO-CLB和游離抗原競爭反應(yīng)固定濃度的抗體，溶液中的自由抗原由于其位阻較小，更容易與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，因此檢測到標記抗原上的峰電流就會減小。因此可以通過峰電流的減小量間接地檢測克倫特羅的含量。如圖4所示，用于檢測克倫特羅的檢測裝置包括工作電極6，即本實用新型用于檢測克倫特羅的電化學修飾電極；對電極7，和參比電極8，設(shè)置在電解池7頂部的電極支架11 ;以及設(shè)置在電解池9底部的電解液10。在電極支架11上分布有工作電極6、對電極7和參比電極9。在電解池9中還含有電解液10，成分為10 mL 1.0 mo I/L KCl溶液。各電極的下端侵入到電解液中，上端分別與CHI660C電化學工作站(由上海辰華儀器公司提供)相連。利用本實用新型，具體檢測方法為工作電極6為anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極，對電極7為鉬絲，參比電極8為Ag/AgCl電極(飽和KCl)。取2ML Ag-GO-CLB與一定濃度的自由CLB混合共10ML，滴涂于修飾電極anti-CLB/MWCNTs/GCE表面，于37° C反應(yīng)lh，將三電極置于10 mL 1.0 mo I/L KCl電解液中，實驗采用示差脈沖伏安法(DPV)，電位掃描·范圍從-0. 1-+0.3V，記錄氧化峰處的峰電流。根據(jù)克倫特羅濃度與氧化峰電流減小量之間的線性關(guān)系，可以對克倫特羅進行定量檢測。每次使用后，用二次蒸餾水將電極沖洗干凈?！z測結(jié)果在上述條件下，利用DPV對不同克倫特羅濃度下銀納米粒子的氧化峰電流進行了檢測，峰電流減小量(Ai)與克倫特羅的濃度對數(shù)值(Igc)成正比，圖5為所制備的anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極在不同克倫特羅濃度下的DPV響應(yīng)和工作曲線。從工作曲線可以得知，anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極對克倫特羅的檢測范圍為0. 01-10. 0 ng/mL，并且遵循以下方程式Ai = I. 1691gc+3. 39，線性相關(guān)系數(shù)為0. 9881，檢測限達到6. 8pg/mL (信噪比=3:1)。anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極的特異性檢測特異性檢測方法采用三電極體系，工作電極采用anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極，對電極為鉬絲，參比電極為Ag/AgCl電極(飽和KCl)，Ag-G0-CLB分別與0. I mg/ml CLB,
0.I mg/ml 萊克多巴胺(RAC),0. I mg/ml 多巴酹丁胺(D0B),0. I mg/ml 沙丁胺醇(SAL),以及混合液構(gòu)成測試底液。實驗采用差分脈沖伏安法(DPV)，電位掃描范圍從-0. 1-+0. 3v,記錄峰電流。每次使用后，用二次蒸餾水將電極沖洗干凈。特異性檢測結(jié)果anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極對克倫特羅具備特異性檢測特性，檢測結(jié)果如圖6所示。經(jīng)檢測，利用anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極，其結(jié)構(gòu)類似物及可能干擾物萊克多巴胺、多巴酚丁胺、沙丁胺醇對克倫特羅的檢測基本無影響。對實際樣品中克倫特羅進行檢測使用標準加入法在豬尿樣品中外加不同量的CLB標準品，分別使用本實用新型anti-CLB/MWCNTs/GCE修飾電極、ELISA和LC-MS法檢測其濃度。比較修飾電極和ELISA、LC-MS法檢測樣品的結(jié)果，結(jié)果見以下表I。
權(quán)利要求1.一種用于檢測克倫特羅的電化學修飾電極，其特征在于，所述電化學修飾電極包括 基底電極(I); 設(shè)置于基底電極(I)外表面的多壁碳納米管(2)； 設(shè)置于多壁碳納米管(2)外表面的EDC-NHS交聯(lián)劑層(3)； 設(shè)置于EDC-NHS交聯(lián)劑(3)外表面的克倫特羅單克隆抗體層(4)；以及 設(shè)置于克倫特羅單克隆抗體(4)外表面的BSA封閉劑層(5)。
2.一種用于檢測克倫特羅的檢測裝置，其特征在于，所述檢測裝置為電解池(9);所述 電解池(9)包括 工作電極(6)，所述工作電極(6)是如權(quán)利要求I所述的電化學修飾電極； 對電極(7)； 參比電極(8)； 設(shè)置在電解池(9)頂部的支架(11)，所述支架(11)用于放置所述對電極(7)和參比電極(8);以及 設(shè)置在電解池(9 )底部的電解液(10 )。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測裝置，其特征在于，所述工作電極(6)包括Ag-GO-CLB納米復(fù)合材料層。
4.如權(quán)利要求2所述的檢測裝置，其特征在于，所述對電極(7)是鉬電扱。
5.如權(quán)利要求2所述的檢測裝置，其特征在于，所述參比電極(8)是Ag/AgCl參比電扱。
專利摘要本實用新型公開了一種用于快速檢測克倫特羅的修飾電極，包括基底電極；設(shè)置于基底電極外表面的多壁碳納米管；設(shè)置于多壁碳納米管外表面的EDC-NHS交聯(lián)劑層；設(shè)置于EDC-NHS交聯(lián)劑外表面的克倫特羅單克隆抗體層；以及設(shè)置于克倫特羅單克隆抗體外表面的BSA封閉劑層。本實用新型還公開了以所述修飾電極作為工作電極的檢測裝置。本實用新型修飾電極靈敏度高，選擇性好，可用于檢測克倫特羅，且采用環(huán)保材料，不會造成污染。
文檔編號G01N27/26GK202649164SQ201220170238
公開日2013年1月2日 申請日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者白靜, 賴彥君, 肖飛, 張苧丹, 鮮躍仲, 金利通 申請人:華東師范大學