專利名稱：檢測急性b淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞表型確認(rèn)過程中的專用試劑盒，具體涉及一種檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著治療策略的改進(jìn)和新的化療藥物不斷出現(xiàn)，急性淋巴細(xì)胞白血病(Acut elymphoblastic leukemia, ALL)的緩解率和生存率有了很大的提高,但是仍有一部分患者預(yù)后較差，最終死于復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)后即使采用強(qiáng)化療、甚至造血干細(xì)胞移植，仍然難以挽回患者的生命，給社會和家庭都造成了極其沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究證明，治療后微量殘留病(MRD)的水平是復(fù)發(fā)的根源。 多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是MRD檢測的常用方法之一,該方法是根據(jù)患者發(fā)病時(shí)的免疫標(biāo)志，確定該患者白血病細(xì)胞的特異性標(biāo)志，亦稱為白血病相關(guān)免疫表型(LAIP)，通過對LAIP的識別來檢測MRD。目前，國內(nèi)外的文獻(xiàn)主要采用三色或四色的抗體組合來檢測LAIP，不同的研究機(jī)構(gòu)采用不同的抗體組合，抗體選擇多樣化、分析時(shí)設(shè)門的方法也不一致。例如，歐洲主要報(bào)道了 5組三色的抗體組合，共應(yīng)用15個(gè)抗體；美國St. jude兒童研究醫(yī)院則利用多組四色抗體組合。為了提高檢測的靈敏度，三色FCM或四色FCM常常需要多組抗體組合，每組抗體組合中均有相同的抗體，這樣一方面增加了抗體總數(shù)目，進(jìn)而增加了試驗(yàn)成本和患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；另一方面多組抗體組合需要在多管中分別檢測，影響了對檢測抗體的多參數(shù)分析在分析LAIP時(shí)，有時(shí)需要多個(gè)標(biāo)志設(shè)門來限定一群細(xì)胞，例如第一管抗體組合中發(fā)現(xiàn)一群可疑LAIP陽性細(xì)胞，表型為⑶45+⑶19+⑶10+CD3C，但此群細(xì)胞數(shù)較低(< 1(Γ4)，此時(shí)往往需要觀察此群細(xì)胞中其他抗原是否表達(dá)異常，以確定是否存在LAIP ;但四色組合無法同時(shí)檢測第4種以外的抗體，從而影響了檢測的準(zhǔn)確性；若要觀察此群細(xì)胞的第五種或其他的抗原表達(dá)是否有異常，利用四色FCM則無法完成。為了提高LAIP檢測的靈敏度，需要能夠同時(shí)檢測多個(gè)熒光參數(shù)的FCM、以及設(shè)計(jì)合適的更多熒光參數(shù)的抗體組合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒及其應(yīng)用，所述試劑盒采用七種熒光標(biāo)記的抗體組合，利用該劑盒、并借助七色流式細(xì)胞儀的輔助，可快速準(zhǔn)確地分析LAIP的種類、性質(zhì)及判斷LAIP陽性細(xì)胞水平，對預(yù)后判斷和臨床治療方案的制定具有重要的指導(dǎo)意義。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒，與七色流式細(xì)胞儀組成白血病相關(guān)免疫表型分類裝備，該試劑盒中配置了下述單克隆抗體試劑組合⑶58、⑶10、⑶34、CD123、CD38、CD19 和 CD45。優(yōu)選的，所述單克隆抗體試劑組合⑶58、⑶10、⑶34、⑶123、⑶38、⑶19和⑶45依前后排列順序依次進(jìn)行特異性熒光素標(biāo)記為FITC、PE、Percp-CY5.5、PE-CY7、APC、APC-Cy7和 Pacific Blue。本發(fā)明還提供了上述試劑盒在制備檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的產(chǎn)品中的應(yīng)用。借助于上述的試劑盒和七色流式細(xì)胞儀對急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型進(jìn)行分析的方法，包括下述步驟
步驟一、試劑配制1.1、配制pH為7. 2 7. 4的10XPBS緩沖液，并稀釋10倍成為IXPBS緩沖液，1. 2、取溶紅細(xì)胞液，并用IXPBS緩沖液稀釋10倍，
1.3、取小牛血清加入至I XPBS緩沖液中，制備含O. 5wt. 9T2wt. %血清的PBS ； 步驟二、對骨髓標(biāo)本進(jìn)行熒光標(biāo)記，制備測試標(biāo)本
2.1在同一專用試管中，依次分別加入熒光標(biāo)記的單克隆抗體如下3μΙΧ058-ΡΙΤ(、10 μ LCD10-PEU μ L CD34-PerCP-CY5. 5、I μ LCD123_PE_CY7、2 μ L CD38_APC、5 μ LCD19-APC-Cy7和1. 3μ L CD45_Pacific Blue，然后再加入100 μ L骨髓標(biāo)本，混勻，室溫避光放置15分鐘孵育，
2.2、加入步驟1. 2中稀釋后的溶紅細(xì)胞液2mL，混勻后避光，室溫放置8分鐘，溶解紅細(xì)胞，
2.3、1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清液，加入步驟1. 3中2mL含O. 5wt. %"2wt. %血清的PBS，混勻，
2.4、1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清液，加入步驟1.1中O. 3mLl X PBS緩沖液，混勻，制成待測標(biāo)本；
步驟三、按照七色流式細(xì)胞儀的操作要求對待測標(biāo)本進(jìn)行處理后檢測，獲得特異性熒光標(biāo)記的骨髓細(xì)胞數(shù)據(jù)，用MACSQuant分析軟件、在SSC/⑶19和⑶45/⑶19雙參數(shù)點(diǎn)圖中對⑶19+細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)兩次設(shè)門，并進(jìn)一步在⑶19+細(xì)胞中對⑶19+⑶38 +的漿細(xì)胞設(shè)門以去除漿細(xì)胞，最終的CD19+B細(xì)胞為待測的細(xì)胞，并與正常骨髓細(xì)胞CD19+B祖細(xì)胞表型進(jìn)行比較。采用上述試劑盒、并借助七色流式細(xì)胞儀分析B細(xì)胞來源急性白血病治療前和治療后肝素抗凝骨髓細(xì)胞中，是否具有LAIP細(xì)胞、LAIP細(xì)胞的表型及LAIP細(xì)胞的數(shù)量。該分析基于下列患者(1)初診B-ALL的患者294例；(2)慢性髓細(xì)胞白血病(Chronicmyelocytic leukemia, CML) -B細(xì)胞急性變患者20例；(3)復(fù)發(fā)的B-ALL患者70例(20例無發(fā)病免疫表型結(jié)果)；(4)治療后MRD+患者146例。其中LAIP的表現(xiàn)包括⑶45和⑶38的弱表達(dá)或不表達(dá)KDlO的強(qiáng)表達(dá)；及在⑶34+TdT+⑶10+分化階段時(shí)不表達(dá)⑶10 ；⑶19、CD34、CD123、CD58強(qiáng)表達(dá)。結(jié)果表明294例初診B-ALL患者、20例CML-B細(xì)胞急性變、70例復(fù)發(fā)B-ALL患者中，LAIP陽性率占99. 22%、其中92. 2%患者的LAIP表現(xiàn)為兩種抗原的表達(dá)異常。上述結(jié)果表明采用本發(fā)明的試劑盒對LAIP的檢測具有較高的敏感性和特異性。在146例MRD+患者的328份標(biāo)本中均存在LAIP+，LAIP的表型特征與治療前的相似。充分證明本發(fā)明的試劑盒適用于99%以上初診的及治療后的B細(xì)胞來源的急性白血病患者LAIP表型的判斷和分析，為臨床檢測MRD提供依據(jù)。采用上述技術(shù)方案產(chǎn)生的有益效果在于(1)本發(fā)明的試劑盒首次采用7種標(biāo)記有不同熒光素的抗體組合，能夠同時(shí)分析7個(gè)抗原的特點(diǎn)，經(jīng)過大量的臨床驗(yàn)證證明，在B細(xì)胞來源的急性淋巴細(xì)胞白血病中LIAP的陽性率達(dá)到99%以上，可快速、準(zhǔn)確地檢測初診為B-ALL患者、CML-B細(xì)胞急性變、復(fù)發(fā)B-ALL患者和MRD+患者骨髓中LAIP細(xì)胞，為B淋巴細(xì)胞白血病LAIP分析提供了一種可靠的、新的熒光標(biāo)記的單克隆抗體組合；(2)本發(fā)明采用較少的抗體、能夠檢出較多的LAIP細(xì)胞，降低了試驗(yàn)成本和患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且單管中抗體的種類增多、增加了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性；(3)采用本發(fā)明的試劑盒可以不依賴于發(fā)病時(shí)的免疫表型資料，擴(kuò)大了 LAIP分析的范圍和能力，簡化了分析的前期條件，為臨床檢測MRD提供了更多的機(jī)會；(4)利用本試劑盒中的一組抗體組合，利于LAIP分析的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。


圖1是正常骨髓B組細(xì)胞表型示例 圖2 圖4分別列舉了 B-ALL治療后標(biāo)本中LAIP+細(xì)胞的三種示例具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒，其包括下列熒光標(biāo)記的單克隆抗體組合⑶58、⑶10、⑶34、⑶123、⑶38、⑶19和⑶45，依前后順序分別依次對應(yīng)下列熒光標(biāo)記FITC、PE、PerCP-CY5, 5、PE-CY7、APC, APC_Cy7 和 PacificBlue0各單克隆抗體的熒光標(biāo)記及成分等信息參見表I。表I流式單克隆抗體信息
權(quán)利要求
1.一種檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒，與七色流式細(xì)胞儀組成白血病相關(guān)免疫表型分類裝備，其特征在于該試劑盒中配置了下述單克隆抗體試劑CD58、 CD10、CD34、CD123、CD38、CD19 和 CD45。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒，其特征在于所述單克隆抗體試劑⑶58、⑶10、⑶34、⑶123、⑶38、⑶19和⑶45依前后排列順序依次進(jìn)行特異性熒光素標(biāo)記為FITC、PE、Percp-CY5. 5、PE_CY7、APC、APC_Cy7 和 Pacific Blue。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還設(shè)置了溶紅細(xì)胞液和PH為7. 2 . 4的10XPBS緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還設(shè)置了配套計(jì)量的小牛血清試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求廣4任意一項(xiàng)所述試劑盒在制備檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
6.借助于權(quán)利要求4所述的試劑盒和七色流式細(xì)胞儀對急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型進(jìn)行分析的方法，其特征在于該方法包括下述步驟步驟一、試劑配制1.1、配制pH為7. 2 7. 4的10XPBS緩沖液，并稀釋10倍成為I XPBS緩沖液，1. 2、取溶紅細(xì)胞液，并用IXPBS緩沖液稀釋10倍，.1.3、取小牛血清加入至I XPBS緩沖液中，制備含O. 5wt. 9T2wt. %血清的PBS ；步驟二、對骨髓標(biāo)本進(jìn)行熒光標(biāo)記，制備測試標(biāo)本.2.1在同一專用試管中，依次分別加入熒光標(biāo)記的單克隆抗體如下3μ L⑶58-FITC、 10 μ L CDlO-PEU μ L CD34_PerCP_CY5. 5、I μ L CD123_PE_CY7、2 μ L CD38_APC、5yL CD19-APC-Cy7和1. 3μ L CD45_Pacific Blue，然后再加入100 μ L骨髓標(biāo)本，混勻，室溫避光放置15分鐘孵育，.2.2、加入步驟1. 2中稀釋后的溶紅細(xì)胞液2mL，混勻后避光，室溫放置8分鐘，溶解紅細(xì)胞，.2.3、1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清液，加入步驟1. 3中2mL含O. 5wt. %"2wt. %血清的 PBS，混勻，.2.4、1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清液，加入步驟1.1中O. 3mLl X PBS緩沖液，混勻， 制成待測標(biāo)本；步驟三、按照七色流式細(xì)胞儀的操作要求對待測標(biāo)本進(jìn)行處理后檢測，獲得特異性熒光標(biāo)記的骨髓細(xì)胞數(shù)據(jù)，用MACSQuant分析軟件、在SSC/⑶19和⑶45/⑶19雙參數(shù)點(diǎn)圖中對⑶19+細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)兩次設(shè)門，并進(jìn)一步在⑶19+細(xì)胞中對⑶19+⑶38 +的漿細(xì)胞設(shè)門以去除漿細(xì)胞，最終的CD19+B細(xì)胞為待測的細(xì)胞，并與正常骨髓細(xì)胞CD19+B祖細(xì)胞表型進(jìn)行比較。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒，與七色流式細(xì)胞儀組成白血病相關(guān)免疫表型分類裝備，該試劑盒中配置了下述單克隆抗體試劑組合CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19和CD45，依前后順序分別標(biāo)準(zhǔn)熒光素為FITC、PE、PerCP-CY5,5、PE-CY7、APC、APC-Cy7和PacificBlue。采用本發(fā)明的試劑盒可以同時(shí)觀察7個(gè)標(biāo)志是否存在異常，增加了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性；而且可以不依賴于發(fā)病時(shí)的免疫表型資料，擴(kuò)大了LAIP分析的范圍和能力，簡化了分析的前期條件，為臨床檢測MRD提供了更多的機(jī)會。
文檔編號G01N33/577GK103018463SQ20121055752
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者劉艷榮, 王亞哲, 常艷, 郝樂, 黃曉軍 申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院