專利名稱：一種煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法。
背景技術(shù)：
阿維菌素(Avermectin,簡稱AVM)是從阿維鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出來的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對動、植物的寄生線蟲和節(jié)肢動物均有高效的驅(qū)殺作用，由于具有殺蟲活性強以及殺蟲譜廣，被廣泛用于蔬菜、果樹、水稻和煙草等作物的生產(chǎn)中。阿維菌素雖屬于微生物源農(nóng)藥，但它對大鼠的LD5tl為10mg/kg，屬高毒農(nóng)藥。因此，國際上對阿維菌素的最高殘留限量(MRL)要求非常嚴(yán)格，對其殘留的檢測十分重視，目前，國內(nèi)外都沒有煙草中阿維菌素農(nóng)藥殘留量的檢測方法。近年來，隨著阿維菌素及甲維鹽在 煙草生產(chǎn)中的使用量逐年增大，開展煙草及煙草制品中阿維菌素殘留量的測定，加強其殘留的監(jiān)控，對提高煙葉質(zhì)量安全性具有重大意義，因此建立煙草中阿維菌素殘留檢測方法顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，包括提取、凈化、衍生化反應(yīng)、檢測步驟，具體包括
A、提取準(zhǔn)確稱取煙葉樣品4.(Γ6. O g，置于離心管中，加入8^12ml提取溶劑，振蕩處理2 4min,加入4. 0 6. O g干燥劑,振蕩處理2 4min,離心分離8 12min,殘洛再用8 12ml提取溶劑重復(fù)提取廣2次，合并上清液備用；
B、凈化取凈化小柱，將A步驟所得上清液過柱，收集濾液至濃縮瓶中，接著用8 12mL洗脫劑洗脫，洗脫液收集于同一濃縮瓶中，將濃縮瓶中的濾液3(T50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后加入O. 5^1. 5ml乙腈，超聲處理f3min，使充分溶解得到凈化液，將其置于避光容器中備用；
C、衍生化反應(yīng)在避光、室溫環(huán)境條件下，取B步驟所得凈化液，取O.5^1ml至棕色瓶中加入O. Γ0. 2mL體積比為O. 5^1 :0. 5^1的甲基咪唑-乙腈衍生化試劑，混旋O. 5 lmin，再加入O. Γ0. 2mL體積比為O. 5 I Γ2的三氟乙酸酐-乙腈衍生化試劑，混旋O. 5 lmin，反應(yīng)15 20min后加入O. 2^0. 4mL甲醇，靜置反應(yīng)8 12h后，反應(yīng)液經(jīng)超微過濾后得試樣液備用；
D、檢測取C步驟所得試樣液注入高效液相色譜儀進行定量分析計算得到阿維菌素農(nóng)
藥殘留量。本發(fā)明采用堿性氧化鋁小柱凈化，熒光檢測器進行檢測；經(jīng)提取、凈化、衍生化反應(yīng)，根據(jù)樣品的保留時間進行定性分析，根據(jù)其峰面積進行定量分析。本發(fā)明靈敏度和準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，適宜煙草中阿維菌素殘留微量分析。


圖I為阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品色譜 圖2為添加O. 0 μδ/δ阿維菌素烤煙樣品色譜 圖3為煙草空白樣品色譜圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明包括提取、凈化、衍生化反應(yīng)、檢測步驟，具體包括
提取是準(zhǔn)確稱取煙葉樣品4. (Γ6. O g，置于離心管中，加入8^12ml提取溶劑，振蕩處理·2 4min,加入4. 0^6. O g干燥劑,振蕩處理2 4min,離心分離8 12min,殘洛再用8 12ml提取溶劑重復(fù)提取廣2次，合并上清液備用；
凈化是取凈化小柱，將A步驟所得上清液過柱，收集濾液至濃縮瓶中，接著用8 12mL洗脫劑洗脫，洗脫液收集于同一濃縮瓶中，將濃縮瓶中的濾液3(T50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后加入O. 5^1. 5ml乙腈，超聲處理f3min，使充分溶解得到凈化液，將其置于避光容器中備用；衍生化反應(yīng)是在避光、室溫環(huán)境條件下，取B步驟所得凈化液，取O. 5^1ml至棕色瓶中加入O. Γ0. 2mL體積比為O. 5^1 :0. 5^1的甲基咪唑-乙腈衍生化試劑，混旋O. 5 lmin，再加入O. Γ0. 2mL體積比為O. 5 I Γ2的三氟乙酸酐-乙腈衍生化試劑，混旋O. 5 lmin，反應(yīng)15 20min后加入O. 2^0. 4mL甲醇，靜置反應(yīng)8 12h后，反應(yīng)液經(jīng)超微過濾后得試樣液備用；
檢測是取衍生化反應(yīng)步驟所得試樣液注入高效液相色譜儀進行定量分析計算得到阿維菌素農(nóng)藥殘留量。所述的提取步驟中離心管為4(T60ml離心管；干燥劑為無水硫酸鈉或無水硫酸鎂，優(yōu)選無水硫酸鈉；提取溶劑為乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷、石油醚中的一種，優(yōu)選乙腈。所述的提取步驟中振蕩處理為漩渦振蕩、超聲振蕩中的一種。所述的提取步驟中離心轉(zhuǎn)速為3000 5000r/min,優(yōu)選為4000 r/min。所述的凈化步驟中在上清液過柱前在堿性氧化鋁小柱中加3 5g無水硫酸鈉或無水硫酸鎂，優(yōu)選無水硫酸鈉；加8^12mL乙腈進行預(yù)淋。所述的凈化步驟中凈化小柱為C18柱，硅膠柱、弗羅里硅土、中性氧化鋁或堿性氧化鋁中的一種，優(yōu)選堿性氧化鋁小柱；洗脫劑為乙腈、甲醇、丙酮中的一種，優(yōu)選乙腈。所述的衍生化反應(yīng)步驟中超微過濾為使用O. 22、. 45Mffl的聚四氟乙烯濾膜、尼龍濾膜、再生纖維素濾膜中的一種進行過濾。所述的檢測步驟中高效液相色譜柱為5Mm, 4. 6 X 150mm的Eclipse XDB-C18,柱溫為(T30°C，進樣量為1(Γ30μ ;流動相為體積比為94 96:4 6的乙腈-水，優(yōu)選為96:4，流速1 2ml/min,優(yōu)選為 I ml/min。所述的檢測步驟中高效液相色譜檢測器為熒光檢測器，發(fā)射波長為36(T370nm，優(yōu)選為365nm ;激發(fā)波長為470 480nm,優(yōu)選為475nm。所述的檢測步驟中定量方法為外標(biāo)法。本發(fā)明的特點I)采用堿性氧化鋁小柱凈化，熒光檢測器進行檢測。2)以乙腈-水為流動相；樣品經(jīng)乙腈萃取，振蕩提取3min，再4000r/min離心約5min，取上清液濃縮適量后過堿性氧化鋁小柱凈化，凈化后再氮吹濃縮至1ml，取O. 50 ml加衍生試劑(衍生試劑A:N —甲基咪唑與乙腈等體積混勻；衍生試劑B:三氟乙酸酐與乙腈按1:2 (V: V)混勻。)衍生化，再加甲醇使衍生產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的醇式結(jié)構(gòu)。3)根據(jù)樣品的保留時間進行定性分析，根據(jù)其峰面積進行定量分析。該發(fā)明的優(yōu)點在于靈敏度和準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，適宜煙草中阿維菌素殘留微量分析。實施例I
準(zhǔn)確稱取I號煙葉樣品4. O g，置于40ml塑料離心管中，加入O. 04μδ阿維菌素農(nóng)藥標(biāo) 準(zhǔn)品，加入8ml乙腈,振蕩2min,加入4. O g無水硫酸鈉,鏇潤振蕩2min,離心8min,殘洛再用8ml乙腈重復(fù)提取I次，合并上清液；取堿性氧化鋁小柱，加3g無水硫酸鈉，加8mL乙腈進行預(yù)淋，將上清液過柱，收集濾液至濃縮瓶中，接著用8mL乙腈洗脫，收集于同一濃縮瓶中，將濃縮瓶中的濾液30°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后加入O. 5ml乙腈，置于超聲波上超聲lmin，使充分溶解，取O. 5ml置于棕色瓶中備用；在避光、室溫環(huán)境條件下，取上述棕色瓶加入O. ImL體積比為O. 5 :1的甲基咪唑-乙腈衍生化試劑，混旋O. 5min,再加入O. ImL體積比為O. 5 :2的三氟乙酸酐-乙腈衍生化試劑，此時有大量白色霧氣，需立即將蓋子蓋緊，混旋O. 5min,反應(yīng)15min后加入O. 2mL甲醇，靜置反應(yīng)12h后，反應(yīng)液過O. 45Mm聚四氟乙烯濾膜后得試樣；取所得試樣注入高效液相色譜儀進行定量分析計算得到阿維菌素農(nóng)藥殘留量為O. 0087μδ/g°實施例2
準(zhǔn)確稱取2號煙葉樣品6. O g，置于60ml玻璃離心管中，加入O. 06μδ阿維菌素農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，加入12ml甲醇,振蕩4min,加入6. O g無水硫酸鎂,超聲振蕩4min,離心12min,殘洛再用12ml甲醇重復(fù)提取2次，合并上清液；取(18小柱，加5g無水硫酸鈉，加12mL甲醇進行預(yù)淋，將上清液過柱，收集濾液至濃縮瓶中，接著用12mL甲醇洗脫，收集于同一濃縮瓶中，將濃縮瓶中的濾50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后加入I. 5ml乙腈，置于超聲波上超聲3min，使充分溶解，取Iml置于棕色瓶中備用；在避光、室溫環(huán)境條件下，取上述棕色瓶加入O. 2mL體積比為I :0. 5的甲基咪唑-乙腈衍生化試劑，混旋lmin，再加入O. 2mL體積比為I :1的三氟乙酸酐-乙腈衍生化試劑，此時有大量白色霧氣，需立即將蓋子蓋緊，混旋lmin，反應(yīng)20min后加入O. 4mL甲醇，靜置反應(yīng)I Ih后，反應(yīng)液過O. 22ΜΠ1尼龍濾膜后得試樣；取所得試樣注入高效液相色譜儀進行定量分析計算得到阿維菌素農(nóng)藥殘留量為O. 0093Pg/g。實施例3
準(zhǔn)確稱取3號煙葉樣品5. O g，加入O. 05μδ阿維菌素農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，置于50ml玻璃、塑料離心管中，加入IOml 二氯甲燒,鏇潤振蕩3min,加入5. Og無水硫酸鎂,振蕩3min,離心IOmin,殘洛再用IOml 二氯甲燒重復(fù)提取I次,合并上清液；取娃膠小柱，加4g無水硫酸鈉，加IOmL丙酮進行預(yù)淋，將上清液過柱，收集濾液至濃縮瓶中，接著用IOmL丙酮洗脫，收集于同一濃縮瓶中，將濃縮瓶中的濾液40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后加入Iml乙腈，置于超聲波上超聲2min，使充分溶解，取O. 8ml置于棕色瓶中備用；在避光、室溫環(huán)境條件下，取上述棕色瓶加入O. 15mL體積比為I :1的甲基咪唑-乙腈衍生化試劑,混旋lmin,再加入O. 15mL體積比為I :2的三氟乙酸酐-乙腈衍生化試劑，此時有大量白色霧氣，需立即將蓋子蓋緊，混旋lmin,反應(yīng)15min后加入O. 3mL甲醇,靜置反應(yīng)IOh后，反應(yīng)液過O. 45Mm再生纖維素濾膜后得試樣；取所得試樣注入高效液相色譜儀進行定量分析計算得到阿維菌素農(nóng)藥殘留量為O. 0103M-g/go實施例4
準(zhǔn)確稱取4號煙葉樣品4. O g，加入O. 04μδ阿維菌素農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，置于60ml玻璃、塑料離心管中，加入9ml丙酮,鏇潤振蕩3min,加入6. O g無水硫酸鈉,振蕩2min,離心8min,殘渣再用8ml丙酮重復(fù)提取I次，合并上清液；取弗羅里硅土小柱,加5g無水硫酸鈉，力口9mL乙腈進行預(yù)淋，將上清液過柱，收集濾液至濃縮瓶中，接著用SmL乙腈洗脫，收集于同一濃縮瓶中，將濃縮瓶中的濾液42°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后加入I. 2ml乙腈，置于超聲波上超聲2min，使充分溶解，取O. 5ml置于棕色瓶中備用；在避光、室溫環(huán)境條件下，取上述棕色瓶加入O. ImL體積比為I :1的甲基咪唑-乙腈衍生化試劑，混旋lmin，再加入O. 2mL體 積比為O. 5 1的三氟乙酸酐-乙腈衍生化試劑，此時有大量白色霧氣，需立即將蓋子蓋緊，混旋lmin,反應(yīng)16min后加入O. 3mL甲醇,靜置反應(yīng)9h后，反應(yīng)液過O. 22Mm尼龍濾膜后得試樣；取所得試樣注入高效液相色譜儀進行定量分析計算得到阿維菌素農(nóng)藥殘留量為O.00957Kg/g。實施例5
準(zhǔn)確稱取5號煙葉樣品6. O g，加入O. 06μδ阿維菌素農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，置于60ml玻璃、塑料離心管中，加入12ml石油醚,超聲振蕩4min,加入6. O g無水硫酸鈉,振蕩2min,離心9min,殘渣再用IOml石油醚重復(fù)提取2次，合并上清液；取中性氧化鋁小柱，加4g無水硫酸鈉，力口IOmL甲醇進行預(yù)淋，將上清液過柱，收集濾液至濃縮瓶中，接著用9mL甲醇洗脫，收集于同一濃縮瓶中，將濃縮瓶中的濾液38°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后加入Iml乙腈，置于超聲波上超聲3min，使充分溶解，取Iml置于棕色瓶中備用；在避光、室溫環(huán)境條件下，取上述棕色瓶加入
O.2mL體積比為I :1的甲基咪唑-乙腈衍生化試劑，混旋lmin，再加入O. 2mL體積比為I :2的三氟乙酸酐-乙腈衍生化試劑，此時有大量白色霧氣，需立即將蓋子蓋緊，混旋lmin，反應(yīng)20min后加入O. 4mL甲醇,靜置反應(yīng)8h后，反應(yīng)液過O. 45Mm再生纖維素濾膜后得試樣；取所得試樣注入高效液相色譜儀進行定量分析計算得到阿維菌素農(nóng)藥殘留量為O. 0105μδ/g°試驗例I
I、提取準(zhǔn)確稱取煙葉樣品5. O g，置于50ml塑料離心管中，加入IOml乙腈，漩渦振蕩3min,加入5. Og無水硫酸鈉,鏇潤振蕩3min, 4000r/min離心lOmin。殘洛再用IOml乙腈重復(fù)提取I次，合并兩次上清液，待凈化。2、凈化取堿性氧化鋁小柱，加4g無水硫酸鈉。加IOmL乙腈預(yù)淋，將上清液過柱，收集濾液至濃縮瓶中，接著用IOmL乙腈洗脫，收集于同一濃縮瓶中。將濃縮瓶中的濾液42°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后加入Iml乙腈，置于超聲波上超聲lmin，使充分溶解，取O. 5ml至2ml棕色瓶中待衍生化。3、衍生化反應(yīng)避光、室溫環(huán)境條件下，在裝有O. 5ml待衍生化樣品的棕色瓶中先加入O. ImL衍生化試劑A，混旋O. 5min，再加入O. 15mL衍生化試劑B，此時有大量白色霧氣，需立即將蓋子蓋緊,混旋O. 5min,反應(yīng)15min后加入O. 25mL甲醇,靜置反應(yīng)8h后，反應(yīng)液過O. 45Mm濾膜后進高效液相色譜儀分析。4、檢測處理好的試樣用高效液相色譜儀定性定量測定阿維菌素農(nóng)藥殘留，色譜條件色譜柱-Eclipse XDB-C18 (5Mm,4. 6x150mm);柱溫室溫；進樣量20μ ;流動相乙腈水(96:4);流速1. 5ml/min ;檢測器突光檢測器，發(fā)射波長365nm 激發(fā)波長475nm ;定量方法-外標(biāo)法(峰面積)。一、結(jié)果討論
I、檢測波長的選擇
對阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品衍生產(chǎn)物的激發(fā)和發(fā)射波長進行掃描，結(jié)果顯示，在激發(fā)和發(fā)射波長分別為365 nm和475 nm時，阿維菌素衍生產(chǎn)物在熒光檢測器上的響應(yīng)值最大。2、流動相組成、流速的選擇 試驗比較了甲醇一水和乙腈一水兩種流動相，此兩種流動相對阿維菌素衍產(chǎn)物的分離效果和峰型都很理想，試驗發(fā)現(xiàn)無論選擇甲醇或者乙腈作為流動相，有機相的體積分數(shù)都不能低于90%，否則保留時間顯著延長，峰變寬，但乙腈一水流動相中的衍生產(chǎn)物在熒光檢測器上的響應(yīng)值要比在甲醇一流動相的高，故選擇乙腈一水作為流動相。其它條件不變的情況下，對流動相流速(O. 5 I. 5 ml/min)進行試驗,確定流速為I. 5ml/min分離效果和峰型最理想。3、提取溶劑的選擇
農(nóng)藥殘留分析中對使用的溶劑要求是非常高的，即要求提取回收率高、雜質(zhì)干擾小、經(jīng)濟等，煙草是基質(zhì)復(fù)雜的樣品，提取溶劑的選擇直接影響到提取效果的好壞，選擇并比較了丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯和乙腈幾種溶劑的提取效果。結(jié)果表明用乙酸乙酯提取不到目標(biāo)化合物，用丙酮、甲醇和二氯甲烷提取，色素和脂溶性物質(zhì)有等雜質(zhì)較多，這些雜質(zhì)會影響目標(biāo)物的分離和定量分析，乙腈作為提取溶劑能獲得較高的添加回收率，且干擾相對較低，但仍有較多的基質(zhì)成分被提取，因此必須對提取液凈化，最終確定乙腈作為阿維菌素類藥物殘留分析的提取溶劑。4、凈化條件的選擇
本試驗研究比較了 C18小柱、中性氧化鋁小柱、堿性氧化鋁小柱和弗羅里硅土柱的凈化效果。分別添加O. 01 μ g/g的農(nóng)藥，每種柱子做5個平行，計算每種柱子的平均收回率。實驗得出中性氧化鋁和弗羅里硅土除雜效果不理想，而且對目標(biāo)化合物的回收率分別為76. 48%和64. 33%，堿性氧化鋁小柱凈化效果最好，回收率為97. 69%，C18小柱對雜質(zhì)去除效果較好，回收率為89. 53%，，因此本方法選擇堿性氧化鋁固相萃取柱。二、衍生條件的選擇
I、光線對衍生化反應(yīng)影響
本試驗在研究不同太陽光強度下衍生化反應(yīng)時也發(fā)現(xiàn)，光線強度越高，其處理對應(yīng)的峰響應(yīng)值越低，說明光線對衍生反應(yīng)有抑制作用，光強越大，抑制作用越明顯，故衍生化反應(yīng)需避光進行。2、衍生化反應(yīng)時間的選擇
將同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在衍生化反應(yīng)不同時間后進樣測定，結(jié)果表明，衍生反應(yīng)15min左右，峰面積達到最大并趨于穩(wěn)定，故衍生化反應(yīng)時間確定為15min。三、衍生反應(yīng)中水和醇類的影響AVMs的衍生反應(yīng)產(chǎn)物是一個含4，2 —三氟乙酰基的熒光衍生物(酯式)，當(dāng)它碰到水或醇類羥基物質(zhì)時極不穩(wěn)定，酯鍵易發(fā)生斷裂，水解為醇式結(jié)構(gòu)，色譜圖上將多出現(xiàn)一個醇式結(jié)構(gòu)產(chǎn)物的色譜峰，同時酯式衍生產(chǎn)物的峰值降低，其中醇式結(jié)構(gòu)產(chǎn)物的保留時間更短，出峰時間早。本實驗在加入衍生反應(yīng)完成后，再加入一定量甲醇并放置一定時間，使酯式結(jié)構(gòu)產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的醇式結(jié)構(gòu)。在數(shù)據(jù)處理時只需對醇式結(jié)構(gòu)產(chǎn)物的峰值進行積分就能準(zhǔn)確測定阿維菌素量。四、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性試驗
將加入甲醇后的衍生溶液放置 Omin, 15min, 30mim, 45min, lh、2h、4h、8h、12h、ld、2d、3d，4d, 5d后測定，結(jié)果表明，常溫下，隨著放置時間的延長，醇式結(jié)構(gòu)的峰面積不斷增加，酯式結(jié)構(gòu)峰面積不斷減少，放置8h的時候酯式結(jié)構(gòu)產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)換為醇式結(jié)構(gòu)，放置12h，衍生產(chǎn)物峰面積無顯著性變化，當(dāng)放置到Id時，峰面積開始下降，而在4°C時保存4d內(nèi)沒有出 現(xiàn)降解現(xiàn)象，第5d時，峰面積有所下降。因此，柱前衍生化好的樣品放置時間不應(yīng)超過24h，不能立即進行測定時，應(yīng)放在4°C冰箱中避光保存。五、回歸方程和檢出限
用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋稱取阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別用乙腈稀釋配制成O. 002、O. 005,0. 01,0. 02,0. 05,0. 1,0. 2μδ / mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，取O. 5ml標(biāo)樣到棕色瓶中，力口入O. ImL衍生化試劑A，混旋O. 5min,再加入O. 15mL衍生化試劑B，立即將蓋子蓋緊，混旋
O.5min,反應(yīng)15min后加入O. 25mL甲醇，靜置反應(yīng)8h后，反應(yīng)液過O. 45Mm濾膜后進高效液相色譜儀分析后建立阿維菌素濃度與峰面積的回歸方程，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果得出在O. 002 O. 2 μ g/mL范圍內(nèi)，各標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積值均有良好的線性關(guān)系，阿維菌素的回歸方程為Y=438. 13Χ + O. 07 (R2 =0.9999)，該方法的檢出限能達到I μ g/kg，完全滿足阿維菌素殘留分析要求。六、方法回收率和精密度
為考察方法可靠性，進行了精密度和回收率實驗。分別在O. 001 mg/kg、0. 01 mg/kg、
0.1 mg/kg 3個添加水平下對烤煙樣品進行加標(biāo)回收試驗，每個濃度進行5次平行實驗，得到方法精密度，以RSD表示，結(jié)果如表I。在3個加標(biāo)水平上，阿維菌素農(nóng)藥的平均回收率在89. 37% 102. 84%之間，精密度小于4. 05%，方法的重復(fù)性較好，說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度能夠滿煙草中阿維菌素殘留量的測定要求。表I方法的回收率和精密度
Tab. I spiked recoveries and precision
權(quán)利要求
1.一種煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法，其特征在于包括提取、凈化、衍生化反應(yīng)、檢測步驟，具體包括 A、提取準(zhǔn)確稱取煙葉樣品4.(Γ6. O g，置于離心管中，加入8 12ml提取溶劑，振蕩處理2 4min,加入4. 0 6. O g干燥劑,振蕩處理2 4min,離心分離8 12min,殘洛再用8 12ml提取溶劑重復(fù)提取廣2次，合并上清液備用； B、凈化取凈化小柱，將A步驟所得上清液過柱，收集濾液至濃縮瓶中，接著用8 12mL洗脫劑洗脫，洗脫液收集于同一濃縮瓶中，將濃縮瓶中的濾液3(T50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后加入O. 5^1. 5ml乙腈，超聲處理f3min，使充分溶解得到凈化液，將其置于避光容器中備用； C、衍生化反應(yīng)在避光、室溫環(huán)境條件下，取B步驟所得凈化液，取O.5^1ml至棕色瓶中加入O. Γ0. 2mL體積比為O. 5^1 :0. 5^1的甲基咪唑-乙腈衍生化試劑，混旋O. 5 lmin，再加入O. Γ0. 2mL體積比為O. 5 I Γ2的三氟乙酸酐-乙腈衍生化試劑，混旋O. 5 lmin，反應(yīng)15 20min后加入O. 2^0. 4mL甲醇，靜置反應(yīng)8 12h后，反應(yīng)液經(jīng)超微過濾后得試樣液備用； D、檢測取C步驟所得試樣液注入高效液相色譜儀進行定量分析計算得到阿維菌素農(nóng)藥殘留量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法，其特征在于所述的A步驟中離心管為4(T60ml離心管；干燥劑為無水硫酸鈉或無水硫酸鎂；提取溶劑為乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷、石油醚中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法，其特征在于所述的A步驟中振蕩處理為漩渦振蕩、超聲振蕩中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法，其特征在于所述的A步驟中離心轉(zhuǎn)速為300(T5000r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法，其特征在于所述的B步驟中在上清液過柱前在凈化小柱中加3 5g無水硫酸鈉或無水硫酸鎂，加8 12mL洗脫劑進行預(yù)淋。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或5所述的煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法，其特征在于所述的凈化小柱為C18柱，硅膠柱、弗羅里硅土、中性氧化鋁或堿性氧化鋁中的一種；洗脫劑為乙腈、甲醇、丙酮中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法，其特征在于所述的C步驟中超微過濾為使用O. 22、. 45Mffl的聚四氟乙烯濾膜、尼龍濾膜、再生纖維素濾膜中的一種進行過濾。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法，其特征在于所述的D步驟中高效液相色譜柱為5Mm，4. 6X 150mm的Eclipse XDB-C18，柱溫為(T30°C，進樣量為1(Γ30μ ;流動相為體積比為94 96:4 6的乙腈-水，流速1 2ml/min。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法，其特征在于所述的D步驟中高效液相色譜檢測器為熒光檢測器，發(fā)射波長為36(T370nm，激發(fā)波長為47(T480nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法，其特征在于所述的D步驟中定量方法為外標(biāo)法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙草中阿維菌素殘留量的檢測方法，包括提取、凈化、衍生化反應(yīng)、檢測步驟，具體包括準(zhǔn)確稱取煙葉樣品置于離心管中，加入乙腈，振蕩，再加入無水硫酸鈉，振蕩，離心，殘渣再用乙腈重復(fù)提取，合并上清液；取堿性氧化鋁小柱，將上清液過柱，收集濾液至濃縮瓶中，用有機溶劑洗脫,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入有機溶劑，置于超聲波上超聲使充分溶解，取0.5~2ml置于棕色瓶中；在避光、室溫環(huán)境條件下，在棕色瓶中加入衍生化試劑混旋，反應(yīng)完后加入甲醇，靜置反應(yīng)，反應(yīng)液過濾膜后注入高效液相色譜儀進行定量分析計算得到阿維菌素農(nóng)藥殘留量。本發(fā)明靈敏度和準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，適宜煙草中阿維菌素殘留微量分析。
文檔編號G01N30/02GK102890130SQ201210397100
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者師君麗, 逄濤, 孔光輝, 李勇, 劉彥紅 申請人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院