一種熒光分析方法和裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種熒光分析方法和裝置，具體地，本發(fā)明公開了一種用于定量檢測樣品中的待測物的滲漏檢測裝置，所述裝置包括(1)包含檢測區(qū)的多孔膜和(2)位于多孔膜下方的吸收墊。本發(fā)明還公開了一種基于所述滲漏檢測裝置的定量檢測待測物的檢測方法和一種基于所述檢測方法的檢測裝置。
【專利說明】一種熒光分析方法和裝置
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于體外檢測【技術領域】，具體地涉及一種基于測量熒光強度的分析方法和
>J-U裝直。
【背景技術】
[0002]在免疫檢測領域中，常常需要對各類抗原或抗體進行定性或定量檢測?，F(xiàn)有技術中，以“競爭抑制和雙抗夾心”為基礎衍生出多種免疫反應分析方法，如:放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、化學發(fā)光法、時間分辨熒光法和熒光免疫法等，可用于確定病原微生物，對人體的特異性蛋白定量檢測，從而對疾病進行輔助診斷或監(jiān)測等等，用途非常廣泛。這類免疫反應分析方法，通常將捕獲抗體固定于固相載體，然后與抗原(目標蛋白)反應，洗滌后再與標記抗體反應，洗滌，最后檢測放射性強度、溶液吸光度或光信號等，從而報告檢測樣本中目標蛋白的濃度。上述方法的自動化免去了人工洗滌的煩瑣，但正因為自動化，使得儀器體積龐大價格昂貴，一般只在大型實驗室使用。
[0003]斑點金免疫滲濾技術(dotimmunogold filtration assay, DIGFA)是 Spielberg等最初于1989年通過檢測抗HIV建立，隨著膠體金技術、材料技術以及計算機的高速發(fā)展，斑點金免疫滲濾技術日臻完備，作為以膜為載體的膠體金快速診斷技術中的一種，具有檢測快速、便捷、不需要特殊設備、結果判斷直觀等優(yōu)點。由于該方法只需肉眼觀察即可，非專業(yè)人士也可操作，使急診、基層醫(yī)院、病人床邊和現(xiàn)場等遠離大型實驗室的地方開展相關檢測成為可能，所以應用范圍相當廣泛。如:已應用于多種寄生蟲病標志物、心臟病標志物、傳染性疾病標志物、毒物、性傳播疾病和其他生化指標的檢測等，在其他領域如食品衛(wèi)生、環(huán)境保護等領域都有報道。
[0004]DIGFA法已經超過20年的發(fā)展，但其基本的工作原理并未改變，這決定了到目前為止，它只用于定性或半定量檢測且靈敏度也不如前述的定量免疫分析方法，進一步的應用遇到了瓶頸。因此，本領域急需對現(xiàn)有的DIGFA方法進行變革，在賦予其高靈敏度和定量準確的新優(yōu)勢的同時，保持其快捷、簡便、成本低廉等特點，從而進一步擴展其應用領域。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供了一種滲漏檢測裝置，用于定量檢測樣品中的待測物。
[0006]本發(fā)明提供了一種定量檢測待測物的檢測方法，所述方法靈敏度高，定量準確。
[0007]本發(fā)明還提供了 一種定量檢測待測物的檢測裝置。
[0008]在本發(fā)明第一方面中，提供了一種滲漏檢測裝置，該滲漏檢測裝置包括:
[0009](I)包含檢測區(qū)的多孔膜，其中，所述的檢測區(qū)包含被熒光物質標記的固定化檢測齊U，并且
[0010](al)所述固定化檢測劑能與樣品中的待測物結合，從而形成“檢測劑一待測物”復合物；其中所述待測物還可與結合劑結合，從而當檢測區(qū)接觸含待測物的樣品和結合劑后，在檢測區(qū)形成“檢測劑一待測物一結合劑”復合物；[0011]或者
[0012](bl)所述固定化檢測劑能與結合劑結合，從而形成“檢測劑一結合劑”復合物；其中所述結合劑還可與待測物結合，從而當檢測區(qū)接觸含待測物和結合劑的混合溶液后，在檢測區(qū)形成“檢測劑一結合劑”復合物；
[0013]其中，所述結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述熒光物質的熒光強度；
[0014](2)位于多孔膜下方的吸收墊，所述吸收墊具有吸收能力，使得加至檢測區(qū)的樣品和液體透過多孔膜并被吸收墊吸收。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的檢測區(qū)包含有一種或多種固定化檢測劑；較佳地，所述的結合劑數(shù)量為一種或多種，從而可同時用于檢測一種或多種待測物。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的滲漏檢測裝置是定量檢測裝置。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的待測物為抗原或抗體。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的待測物是抗原，則所述的結合劑和檢測劑是可同時結合于所述抗原的抗體；或者所述的待測物是抗體，則所述的檢測劑和結合劑是可同時結合于所述抗體的抗原或所述抗體的抗體(抗抗體)。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的待測物是抗原，則所述的結合劑是可結合于所述抗原的抗體，所述檢測劑是所述抗原的等同物；或者所述的待測物是抗體，則所述的結合劑是可結合于所述抗體的抗原或所述抗體的抗體(抗抗體)，所述檢測劑是所述抗體的等同物。
[0020]在本發(fā)明第二方面中，提供了一種滲漏檢測裝置，該滲漏檢測裝置包括:
[0021](I)包含檢測區(qū)的多孔膜，其中，所述的檢測區(qū)包含固定的第一檢測劑，其中，所述第一檢測劑被熒光物質標記，能與可流動的第二檢測劑形成復合檢測劑，并且
[0022](a2)所述復合檢測劑能與樣品中的待測物結合，從而形成“復合檢測劑一待測物”復合物；所述待測物可與結合劑結合，從而當檢測區(qū)接觸含待測物的樣品和結合劑后，在檢測區(qū)形成“復合檢測劑一待測物一結合劑”復合物；
[0023]或者
[0024](b2)所述復合檢測劑能與結合劑結合，從而形成“復合檢測劑一結合劑”復合物；其中所述結合劑還可與待測物結合，從而當檢測區(qū)接觸含待測物和結合劑的混合溶液后，在檢測區(qū)形成“復合檢測劑一結合劑”復合物；
[0025]其中，所述結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述熒光物質的熒光強度；
[0026](2)位于多孔膜下方的吸收墊，所述吸收墊具有吸收能力，使得加至檢測區(qū)的樣品和液體透過多孔膜并被吸收墊吸收。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的第二檢測劑的數(shù)量為一種或多種；較佳地，所述的結合劑數(shù)量為一種或多種，從而可同時用于檢測一種或多種待測物。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述復合檢測劑為“第一檢測劑一第二檢測劑”復合物。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述“復合檢測劑一待測物”復合物為“第一檢測劑一第二檢測劑一待測物”復合物。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述“復合檢測劑一待測物一結合劑”復合物為“第一檢測劑一第二檢測劑一待測物一結合劑”復合物。[0031]在另一優(yōu)選例中，所述“復合檢測劑一結合劑”復合物為“第一檢測劑一第二檢測劑一結合劑”復合物。
[0032]在另一優(yōu)選例中，所述的滲漏檢測裝置是定量檢測裝置。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述待測物為抗原或抗體。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的待測物是抗原，則所述的結合劑和第二檢測劑是可同時結合于所述抗原的抗體；或者所述的待測物是抗體，則所述的第二檢測劑和結合劑是可同時結合于所述抗體的抗原或所述抗體的抗體(抗抗體)。
[0035]在另一優(yōu)選例中，所述的待測物是抗原，則所述的結合劑是可結合于所述抗原的抗體，所述第二檢測劑是所述抗原的等同物；或者所述的待測物是抗體，則所述的結合劑是可結合于所述抗體的抗原或所述抗體的抗體(抗抗體)，所述第二檢測劑是所述抗體的等同物。
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述第一檢測劑為標記熒光物質的鏈親和素(SA)，則所述第二檢測劑被生物素(biotin)標記。
[0037]在另一優(yōu)選例中，該滲漏檢測裝置還包括:
[0038]在吸收墊下方存在一底部裝置；
[0039]在多孔膜上方存在一蓋部裝置，所述蓋部裝置上具有可供加入樣品的開孔，且所述多孔膜位于該開孔下方。
[0040]在另一優(yōu)選例中，所述熒光物質的激發(fā)或發(fā)射光譜與所述吸光物質的吸收光譜全部或部分重疊。
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述的待測物包括:蛋白、核酸或小分子化合物。
[0042]在另一優(yōu)選例中，所述的待測物是液相(溶液)、懸浮液或固相。
[0043]在另一優(yōu)選例中，所述的熒光物質選自下組:熒光素、羧基熒光素、2-甲氧基熒光素、4，5_ 二甲氧基熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點、或稀土元素離子或其螯合物。
[0044]在另一優(yōu)選例中，所述的吸光物質選自下組:膠體金、納米金棒、納米銀棒或其組
八
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[0045]在另一優(yōu)選例中，所述的吸光物質為納米金棒。
[0046]在另一優(yōu)選例中，所述的納米金棒的縱橫比為1.5-10，較佳地為1.5-5。
[0047]在另一優(yōu)選例中，所述的納米金棒的長度為10-200nm，較佳地為20-100nm。
[0048]在另一優(yōu)選例中，所述的膠體金是平均粒徑為10_70nm的膠體金顆粒。
[0049]在另一優(yōu)選例中，所述多孔膜上還包括不同于檢測區(qū)的對照區(qū)，所述對照區(qū)含有固定化的對照劑，其中，所述對照劑用于特異性結合被吸光物質標記的結合劑。
[0050]在另一優(yōu)選例中，所述對照區(qū)用于顯示待測物的檢測結果的有效性。
[0051]在本發(fā)明第三方面中，提供了一種定量檢測待測物的熒光分析方法，包括步驟:
[0052](I)包括:
[0053](al)將待測物樣品和結合劑分別添加于滲漏檢測裝置的檢測區(qū)，或將待測物樣品和結合劑的混合物添加于所述的檢測區(qū)，
[0054]其中，所述的檢測區(qū)包含被熒光物質標記的固定化檢測劑，并且所述固定化檢測劑能與樣品中的待測物結合，從而形成“檢測劑一待測物”復合物；其中所述待測物可與結合劑結合，從而當檢測區(qū)接觸含待測物的樣品和結合劑后，在檢測區(qū)形成“檢測劑一待測物一結合劑”復合物；
[0055]或者
[0056](a2)將第二檢測劑、待測物樣品和結合劑分別添加于滲漏檢測裝置的檢測區(qū)，或將第二檢測劑、待測物樣品和結合劑的混合物添加于所述的檢測區(qū)，
[0057]其中，所述的檢測區(qū)包含固定的第一檢測劑，其中，所述第一檢測劑被熒光物質標記，能與可流動的第二檢測劑形成復合檢測劑，并且所述復合檢測劑能與樣品中的待測物結合，從而形成“復合檢測劑一待測物”復合物；所述待測物可與結合劑結合，從而當檢測區(qū)接觸第二檢測劑、含待測物的樣品和結合劑后，在檢測區(qū)形成“復合檢測劑一待測物一結合齊U”復合物；
[0058]并且，所述結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述熒光物質的熒光強度；
[0059](2):檢測所述檢測區(qū)的熒光強度F，從而測得待測物的存在與否或數(shù)量。
[0060]在本發(fā)明第四方面中，提供了一種定量檢測待測物的熒光分析方法，包括步驟:
[0061](I)包括:
[0062](bl)將待測物樣品和結合劑依次添加于滲漏檢測裝置的檢測區(qū)，或者將待測物樣品和結合劑的混合物添加于所述的檢測區(qū)，
[0063]其中，所述的檢測區(qū)包含被熒光物質標記的固定化檢測劑，并且所述固定化檢測劑能與結合劑結合，從而形成“檢測劑一結合劑”復合物；其中所述結合劑還可與待測物結合，從而當檢測區(qū)接觸待測物樣品和結合劑后，在檢測區(qū)形成“檢測劑一結合劑”復合物；
[0064]或者
[0065](b2)將待測物樣品、第二檢測劑和結合劑依次添加于滲漏檢測裝置的檢測區(qū)，
[0066]或者
[0067]首先提供一將待測物樣品和第二檢測劑的第一混合物，然后將結合劑和第一混合物依次添加于所述的檢測區(qū)，或者將結合劑和第一混合物所形成的第二混合物添加于所述的檢測區(qū)，
[0068]或者
[0069]首先提供一待測物樣品和結合劑的第三混合物，然后將第二檢測劑和第三混合物依次添加于所述的檢測區(qū)，或者將第二檢測劑與第三混合物所形成的第四混合物添加于所述的檢測區(qū)，
[0070]其中，所述的檢測區(qū)包含固定的第一檢測劑，其中，所述第一檢測劑被熒光物質標記，能與可流動的第二檢測劑形成復合檢測劑，并且所述復合檢測劑能與結合劑結合，從而形成“復合檢測劑一結合劑”復合物；其中所述結合劑可與待測物結合，從而當檢測區(qū)接觸待測物樣品、第二檢測劑和結合劑后，在檢測區(qū)形成“復合檢測劑一結合劑”復合物；
[0071]并且，所述結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述熒光物質的熒光強度；
[0072](2)檢測所述檢測區(qū)的熒光強度F，從而測得待測物的存在與否或數(shù)量。
[0073]在另一優(yōu)選例中，所述步驟(2)包括:將檢測區(qū)的熒光強度F和標準曲線或者與未加樣的初始熒光強度I7O進行比較，從而確定待測物的存在與否或數(shù)量。
[0074]在另一優(yōu)選例中，所述的待測物是液相(溶液)、懸浮液或固相。[0075]在另一優(yōu)選例中，當待測物為固相時，步驟(I)還包括加入溶劑(如水或緩沖液)
[0076]在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括用已知濃度的待測物標準品進行測量，從而制作標準曲線的步驟。
[0077]在本發(fā)明第五方面中，提供了一種定量檢測待測物的熒光檢測裝置，所述的裝置包括:
[0078](a) 一本發(fā)明第一方面或第二方面所述的滲漏檢測裝置；和
[0079](b) 一用于檢測熒光強度的檢測器。
[0080]在另一優(yōu)選例中，所述裝置還包括光源和計算機。
[0081]所述光源照射到檢測區(qū)處，激發(fā)出的熒光進入檢測器，由計算機進行數(shù)據(jù)處理和分析。
[0082]應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0083]圖1A是滲漏檢測裝置示意圖。
[0084]圖1B是滲漏檢測裝置示意圖。
[0085]圖2是檢測裝置示意圖。
[0086]圖3是實施例1的AFP標準系列濃度(IgC)與相應熒光強度(IgF)標準曲線圖。
[0087]圖4是實施例2的AFP標準系列濃度(IgC)與相應熒光強度(IgF)標準曲線圖。
[0088]圖5是實施例3的CRP標準系列濃度(C)與相應熒光強度(F)標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0089]本發(fā)明人通過長期而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了一種基于熒光淬滅原理的檢測方法，所述方法采用固定化的被熒光物質標記的檢測劑，不僅可以通過目測檢測區(qū)的顏色來判斷是否含有待測物，還可以通過測量檢測區(qū)處熒光強度的方式來定量檢測待測物。所述方法不僅具有靈敏度高，定量準確的優(yōu)點，而且操作仍然十分簡便、快捷、且成本低廉。所述方法是基于本發(fā)明提供的一種滲濾測試裝置，通過一種含有光源和檢測器的裝置實現(xiàn)了對待測物的定量檢測。在此基礎上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0090]滲漏檢測裝置
[0091]現(xiàn)在更詳細地描述用于制造本發(fā)明滲漏檢測裝置的方法和材料。應注意，滲漏檢測裝置的具體構造可以變化，這取決于意圖用滲漏檢測裝置來進行的具體測試。在實施例之外制造滲漏檢測裝置的變動方法，也落于本發(fā)明范圍之中。
[0092]滲漏檢測裝置可包括蓋部裝置1，所述蓋部裝置具有一個用于加樣的開孔11，所述開孔可以是圓形、方形等多種形狀。
[0093]多孔膜2 (或微孔膜)位于蓋部裝置I的開孔下方，所述多孔膜包括:檢測區(qū)和優(yōu)選的設置有對照區(qū)，且通常對照區(qū)與檢測區(qū)之間有適當?shù)目臻g。
[0094]吸收墊3位于多孔膜下方。
[0095]位于吸收墊下方還具有一底部裝置4。[0096]按圖1B所示，分別將多孔膜2、吸收墊3、蓋部裝置I和底部裝置4裝配成滲濾測試裝置，其中，多孔膜上已固定了被熒光物質標記的檢測劑。
[0097]所述滲漏檢測裝置可以是多種形式存在，例如板，片或盒等。以盒為例，所述蓋部裝置為盒蓋，所述底部裝置為盒底，可以將多孔膜安放在盒蓋開孔(如0.4?0.8cm的圓孔)正下方，吸收墊在多孔膜的正下方，緊密閉合蓋、底，使多孔膜貼緊吸收墊，即制備成圖1A所示的滲漏檢測裝置。
[0098]所述蓋部裝置和底部裝置可以用任何穩(wěn)定的、無孔的材料制成。因為許多測定用水作為擴散介質，因此底部裝置較佳地是基本上不透水的，且其強度應足以支承粘于其的滲漏檢測裝置。在一個優(yōu)選例中，背襯片是用聚合物物(如塑料)制成的。
[0099]所述吸收墊可以用任何能吸收作為樣品和緩沖液的液體的材料制成。吸收墊片的吸收能力應足夠大，以便吸收添加至滲漏檢測裝置的液體。適用于吸收墊片的材料的例子包括纖維素和玻璃纖維。
[0100]所述多孔膜可以用任何材料制成，只要該材料有足夠孔隙度從而允許在表面和內部發(fā)生流體的毛細管作用。多孔膜應有足夠的孔隙度，從而允許涂有抗體或抗原的顆粒移動。多孔膜還可被含待檢測分析物的樣品中所用的液體潤濕(例如，對于水性液體具有親水性，對于有機溶劑具有疏水性)。通過例如在美國專利N0.4，340, 482或N0.4，618，533中所述的方法(這些方法描述了將疏水表面轉變成親水表面)，可以改變其疏水性從而使其具有親水性以便用于水性液體?？捎糜谥圃於嗫啄さ牟牧侠影?聚脂膜、纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一優(yōu)選例中,所述多孔膜為硝酸纖維素膜片
[0101]檢測方法
[0102]本發(fā)明滲漏檢測裝置可用于大量不同的滲漏分析方法，而這些分析方法涉及一種或多種可流動結合劑、一種固定化檢測劑和任選地涉及一種或多種可流動的第二檢測劑。所述的固定化檢測劑被熒光物質標記，至少一種結合劑被吸光物質標記，當熒光物質標記的檢測劑和吸光物質標記的結合劑結合后，可形成含有吸光物質和熒光物質的復合物。具體地，當所述吸光物質影響(部分淬滅或全部淬滅)所述熒光物質的熒光強度時，本發(fā)明的檢測方法即可通過檢測熒光物質的熒光強度來測定待測物的數(shù)量。
[0103]如本文所用，術語“待測物”、“其等同物”或“分析物”指待用滲漏檢測裝置檢測以及可任選地被定量測定的、樣品中的任何組份，待測物或其等同物或分析物的例子包括:蛋白質，如激素或其他分泌蛋白質、酶和細胞表面蛋白；糖蛋白；肽；小分子；多糖；抗體(包括單克隆抗體或多克隆抗體及其片段)；核酸；藥物(包括地高辛等強心甙類藥物)；毒素；病毒或病毒顆粒；細胞壁組份；或其他具有表位的化合物。
[0104]優(yōu)選地，所述的待測物包括腫瘤標志物、心肌標志物等特異性的蛋白，所述腫瘤標志物選自下組:甲胎蛋白(AFP)、C-反應蛋白(CRP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125 (CA125)、糖抗原19-9 (CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、或人絨毛膜促性腺激素(3 -HCG)。
[0105]結合劑
[0106]本發(fā)明所用的結合劑可以是任何能夠結合于待測物或其等同物的物質。具體地，為特異性結合待測物或其等同物的物質。
[0107]有各種不同類型的分子可用作分析物結合劑，其中包括例如:寡核苷酸、抗體、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(該抗原具有分析物結合位點)的異源混合物的裂解物。P.Holliger 等人，Trends in Biotechnology 13:7-9 (1995) ; S.M.Chamow 等人，Trends inBiotechnology 14:52-60(1996)。如果待檢測分析物是配體,那么可使用結合于該配體的受體，反之亦然。
[0108]檢測劑
[0109]本發(fā)明所用的檢測劑可以是任何能與結合劑和/或樣品中的待測物或其等同物結合的物質，包括例如:抗體、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(該抗原具有分析物結合位點)的異源混合物的裂解物。
[0110]優(yōu)選地，可以通過抗原和抗體的結合或寡核苷酸與互補核酸單鏈特異性結合的方式將含有熒光標記的物質與含有吸光物質標記的物質結合；還可以通過生物素(biotin)和鏈親和素(Streptavidin，SA)的結合方式，從而將含有熒光標記的物質與含有吸光物質標記的物質結合。
[0111]標記物質
[0112]連于結合劑或檢測劑的可檢測標記物包括大量不同物質，只要標記物能夠被檢測?？蓹z測標記物的例子包括(但并不限于):顆粒、發(fā)光標記物；比色標記物、熒光標記物；化學標記物；酶；放射性標記物；或射頻標記物；金屬膠體；和化學發(fā)光標記物。常用檢測方法的例子包括(但并不限于):光學方法，如測量光散射、單反射、光度計或光電倍增管；放射性(用蓋革計數(shù)器等進行測量)；導電性或電介質(電容)；電化學法檢測所釋放的電活性物質，如銦、秘、鎵、締離子[如用Hayes等人(Analytical Chem.66:1860-1865 (1994)所述的方法]，或亞鐵氰化物[如用 Roberts 和 Durst (Analytical Chem.67:482-491 (1995)所提出的方法。其中通過在檢測區(qū)滴加洗滌劑，使包裹在脂質體中的亞鐵氰化物被釋放出，然后用電化學法檢測釋放的亞鐵氰化物]。其他常規(guī)方法只要合適，也可使用。
[0113]在一個優(yōu)選例中，可檢測標記物是顆粒。可使用的顆粒例子包括(但并不限于):膠體金顆粒；膠體硫顆粒；膠體硒顆粒；膠體硫酸鋇顆粒；膠體硫酸鐵顆粒；金屬碘酸鹽顆粒；鹵化銀顆粒；二氧化娃顆粒；膠體(水合)金屬氧化物顆粒；膠體金屬硫化物顆粒；膠體硒化鉛顆粒；膠體硒化鎘顆粒；膠體金屬磷酸鹽顆粒；膠體金屬鐵酸鹽顆粒；涂有有機或無機層的上述任一種膠體顆粒；蛋白質或肽分子；脂質體；或有機聚合物乳膠顆粒，例如聚苯乙烯乳膠珠。
[0114]用于檢測劑的標記物，本發(fā)明優(yōu)先選用熒光標記物(簡稱熒光物質)，用于結合劑的標記物，本發(fā)明優(yōu)先選用吸光物質標記物(簡稱吸光物質)。當熒光標記物和吸光標記物通過特定的方式結合后，當熒光物質的激發(fā)或發(fā)射光譜與吸光物質的吸收光譜部分或完全重疊時,吸光物質會影響(部分淬滅或全部淬滅)突光物質的突光，從而通過檢測突光物質的熒光強度來測定待測物的數(shù)量。
[0115]熒光物質和吸光物質的選擇
[0116]用于本發(fā)明標記的熒光物質和吸光物質應配合使用，基本原則是熒光物質的激發(fā)或發(fā)射光譜與吸光物質的吸收光譜部分或完全重疊。最優(yōu)的是完全重疊，如此會有較高的檢測靈敏度。[0117]代表性的突光物質包括(但并不限于):突光素、羧基突光素、2-甲氧基突光素、4,5-二甲氧基突光素、羅丹明、藻紅蛋白(Phycoerythrin, PE)、量子點、稀土元素離子(如Eu3+)及其螯合物等組合，只要所選熒光物質的激發(fā)或發(fā)射光譜與所選吸光物質的吸收光譜
有重疊即可。
[0118]代表性的吸光物質包括(但并不限于):膠體金、納米金棒、納米銀棒等組合，只要所選吸光物質的吸收光譜與所選熒光物質的激發(fā)或發(fā)射光譜重疊即可。
[0119]膠體金顆粒可用任何常規(guī)方法制造,例如總結于G.Frens, 1973 Nature PhysicalScience, 241:20(1973)中的方法。其他方法描述于美國專利N0.5，578，577,5, 141，850、4，775，636、4，853，335、4，859，612、5，079，172、5，202，267、5，514，602、5，616，467、5，681，775。
[0120]如本文所用，術語“納米金棒”指具有一定縱橫比、且橫軸和縱軸處于5-200納米范圍的金顆粒。
[0121]一種特別優(yōu)選的吸光物質是膠體金，尤其是粒徑為20-40nm的膠體金。
[0122]優(yōu)選地，本領域技術人員常用熒光標記物質包括PE，PE的吸收光譜在55(T650nm之間，最大發(fā)射波長為575nm,而30nm膠體金的吸收光譜在30(T800nm,較寬泛,最大吸收峰為525飛30nm處，與PE的發(fā)射光譜有部分重疊，所以選擇30nm膠體金作為相應的吸光物質。
[0123]熒光淬滅原理
[0124]含有熒光標記的物質與含有吸光物質標記的物質結合后，當熒光物質的激發(fā)或發(fā)射光譜與作為熒光淬滅劑的吸光物質的吸收光譜全部或部分重疊時，因共振能量轉移，吸光物質會對該熒光物質的熒光產生淬滅作用。
[0125]本發(fā)明中，引起熒光淬滅的原因包括兩個方面:一是復合物內部吸光物質對熒光物質的淬滅；二是堆積在一起的復合物之間的相互淬滅，如:復合物甲的吸光物質淬滅復合物乙的熒光，復合物乙的吸光物質淬滅復合物丙的熒光，復合物丙的吸光物質淬滅復合物甲的熒光，依此類推。
[0126]工作原理
[0127]現(xiàn)結合圖1A和圖1B和具體的實施方式說明本發(fā)明檢測方法的工作原理:
[0128]方法一、
[0129](1.1)選擇一檢測劑，所述檢測劑是對待測物特異性結合的物質(如待測物為抗原，則檢測劑為該抗原的一抗體，記為Abl)，并預先對該檢測劑進行熒光物質標記，生成經熒光物質標記的檢測劑(記為F-Abl)，然后將其固定在多孔膜上。要求該熒光物質的激發(fā)與發(fā)射光譜和吸光物質(如膠體金)的吸收光譜全部或部分重疊。
[0130](1.2)通過加樣孔11，將含有待測物(如抗原，記為Ag)的樣品和結合劑(如抗原的膠體金標記第二抗體，簡稱為抗原的金標抗體，記為Ab2-G)加在多孔膜上，樣品中的待測物和結合劑與固定在此的熒光物質標記的針對抗原的檢測劑(F-Abl)結合，形成3元復合物，即“F-Abl-Ag-Ab2-G”夾心復合物，其中的金淬滅檢測區(qū)處的熒光物質的熒光。
[0131](1.3)游離金標抗體被對照區(qū)的對照劑(如抗金標抗體的抗體)捕獲，呈現(xiàn)紅色，說明檢測有效。
[0132](1.4)測定檢測區(qū)處熒光物質的熒光強度，熒光越強說明待測物濃度越低，反之則越高；如樣本中無抗原時，不能形成“夾心復合物”，則檢測區(qū)處的熒光強度為原始熒光強度。
[0133]方法二、
[0134]檢測區(qū)處也可固定其他能捕獲“夾心復合物”的熒光標記物質。
[0135](2.1)將含有待測物(如抗原，記為Ag)的樣品和兩種結合劑(如抗原的兩種抗體:膠體金標記的抗體，也稱為抗原的金標抗體，記為Ab2-G ；以及biotin標記的抗體，記為Abl-biotin)混合后，待測物、金標抗體和biotin標記的抗體完全復溶后，形成如G-Ab2-Ag-Ab1-biotin 的 3 兀復合物。
[0136](2.2)通過加樣孔11，將所述3元復合物加在多孔膜上，固定在此的熒光標記的能與biotin結合的檢測劑(如突光標記的SA,記為F-SA)捕獲上述3元復合物，形成如G-Ab2-Ag-Abl-biotin-SA-F的4元復合物，其中的金淬滅檢測區(qū)處的熒光物質的熒光。
[0137](2.3)游離金標抗體被對照劑(如抗金標抗體的抗體)捕獲，呈現(xiàn)紅色，說明檢測有效。
[0138](2.4)測定檢測區(qū)處熒光物質的熒光強度，熒光越強說明待測物濃度越低，反之則越高；如樣本中無抗原時，不能形成“夾心復合物”，則檢測區(qū)處的熒光強度為原始熒光強度。
[0139]本發(fā)明還適用于競爭抑制法:
[0140]方法三、
[0141](3.1)將待測物的等同物(如待測物為抗原，該等同物為其標準抗原，記為AgO)標記熒光，生成被熒光物質標記的檢測劑(記為F-AgO)，然后將其固定在圖1B的多孔膜上。
[0142](3.2)先將含有待測物(如抗原，記為Ag)的樣品、結合劑(如抗原的金標抗體，記為Abl-G)混勻，形成含Ag-Abl-G的復合物的混合物，當Abl-G的含量大于待測物的含量時，Abl-G會剩余。
[0143](3.3)通過加樣孔11，將步驟(3.2)的混合物滴加至多孔膜上(如滴加2?3滴，待完全滲入，可再通過加樣孔11滴加洗滌液2?3滴，待完全滲入)。固定在此的熒光標記的檢測劑(如F-AgO)捕獲上述混合液中剩余的Abl-G，形成如F-AgO-Abl-G的復合物，其中的金淬滅檢測區(qū)處的熒光物質的熒光。
[0144](3.4)測定檢測區(qū)處熒光物質的熒光強度，熒光越強，待測物濃度越高，反之，則待測物的濃度越低；若樣本中無待測物，則多孔膜上檢測區(qū)處形成的“F-Ag0-Abl-G”最多，相應地，熒光最弱。
[0145]方法四、
[0146](4.1)將待測物的等同物(如待測物為抗原，該等同物為其標準抗原，記為AgO)標記biotin(記為biotin-AgO),而圖1B的多孔膜上固定標記了突光物質的檢測劑(記為F-SA)。
[0147](4.2)將含有待測物(如抗原，記為Ag)的樣品、結合劑(如抗原的金標抗體，記為Abl-G)和標記有biotin的待測物等同物混勻，形成含biotin-Ag0_Abl-G的復合物的混合物。
[0148]另一優(yōu)選例中，先將含有待測物的樣品、結合劑混勻，形成如Ag-Abl-G的復合物，當Abl-G的含量大于Ag的含量時，Abl-G會剩余。再和標記有biotin的待測物等同物混合，復溶，形成含biotin-AgO-Abl-G的復合物的混合物。
[0149]另一優(yōu)選例中，先將含有待測物的樣品和標記有biotin的待測物等同物混勻，再和結合劑混合，復溶，形成含biotin-AgO-Abl-G的復合物的混合物。
[0150](4.3)通過加樣孔11，將步驟(4.2)得到的混合物滴加至多孔膜上(如滴加2~3滴，待完全滲入，可再通過加樣孔11滴加洗滌液2~3滴，待完全滲入)。固定在此的熒光標記的檢測劑(如F-SA)捕獲上述混合液中biotin-AgO-Abl-G的復合物，形成如F-SA-biotin-AgO-Abl-G的復合物，其中的金淬滅檢測區(qū)處的熒光物質的熒光。
[0151](4.4)測定檢測區(qū)處熒光物質的熒光強度，熒光越強，待測物濃度越高，反之，則待測物的濃度越低；若樣本中無待測物，則多孔膜上檢測區(qū)處形成的“F-AgO-Abl-G”最多，相應地，熒光最弱。
[0152]檢測裝置
[0153]現(xiàn)結合圖2說明本發(fā)明的檢測裝置:
[0154]如圖2所示，所述裝置可以包括:滲漏檢測裝置、檢測器、光源、光導纖維和計算機。還可以包括一份檢測方法的使用說明。其中滲漏檢測裝置的工作原理如上所述，熒光強度的檢測方法可以如下所述(但不僅限于此)，任何可用于檢測熒光強度的方法均可用于本發(fā)明的檢測裝置。
[0155]激發(fā)光通過Y型光導纖維的I個分支照射到多孔膜的檢測區(qū)處，激發(fā)出的熒光通過Y型光導纖維的另I分支進入檢測器，由計算機進行數(shù)據(jù)處理和分析。
[0156]本發(fā)明中，光源用于提供某一發(fā)射波長的光線，從而激發(fā)突光物質發(fā)出突光?？蛇x用任何可以提供合適波長的光·源，包括(但不限于):LED、氙燈、鹵鎢燈、激光等。一種優(yōu)選的光源是激光光源，激光光源可用本領域常規(guī)的方法和設備(如激光器)產生。代表性的激光器包括(但并不限于):半導體激光器、氦氖激光器、氬離子激光器、還包括波長可選的激光器、多波長激光器和雙波長激光器等。
[0157]激光器產生的激光波長與激光介質有關，常見的激光波長見下表:
[0158]
【權利要求】
1.一種滲漏檢測裝置，其特征在于，該滲漏檢測裝置包括: (1)包含檢測區(qū)的多孔膜，其中，所述的檢測區(qū)包含被熒光物質標記的固定化檢測劑，并且 (al)所述固定化檢測劑能與樣品中的待測物結合，從而形成“檢測劑一待測物”復合物；其中所述待測物還可與結合劑結合，從而當檢測區(qū)接觸含待測物的樣品和結合劑后，在檢測區(qū)形成“檢測劑一待測物一結合劑”復合物； 或者(bl)所述固定化檢測劑能與結合劑結合，從而形成“檢測劑一結合劑”復合物；其中所述結合劑還可與待測物結合，從而當檢測區(qū)接觸含待測物和結合劑的混合溶液后，在檢測區(qū)形成“檢測劑一結合劑”復合物； 其中，所述結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述熒光物質的熒光強度； (2)位于多孔膜下方的吸收墊，所述吸收墊具有吸收能力，使得加至檢測區(qū)的樣品和液體透過多孔膜并被吸收墊吸收。
2.一種滲漏檢測裝置，其特征在于，該滲漏檢測裝置包括: (1)包含檢測區(qū)的多孔膜，其中，所述的檢測區(qū)包含固定的第一檢測劑，其中，所述第一檢測劑被熒光物質標記，能與可流動的第二檢測劑形成復合檢測劑，并且 (a2)所述復合檢測劑能與樣品中的待測物結合，從而形成“復合檢測劑一待測物”復合物；所述待測物可與結合劑結合，從而當檢測區(qū)接觸含待測物的樣品和結合劑后，在檢測區(qū)形成“復合檢測劑一待測物一結合劑”復合物； 或者(b2)所述復合檢測劑能·與結合劑結合，從而形成“復合檢測劑一結合劑”復合物；其中所述結合劑還可與待測物結合，從而當檢測區(qū)接觸含待測物和結合劑的混合溶液后，在檢測區(qū)形成“復合檢測劑一結合劑”復合物； 其中，所述結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述熒光物質的熒光強度； (2)位于多孔膜下方的吸收墊，所述吸收墊具有吸收能力，使得加至檢測區(qū)的樣品和液體透過多孔膜并被吸收墊吸收。
3.如權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置，其特征在于，該滲漏檢測裝置還包括: 在吸收墊下方存在一底部裝置； 在多孔膜上方存在一蓋部裝置，所述蓋部裝置上具有可供加入樣品的開孔，且所述多孔膜位于該開孔下方。
4.如權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置，其特征在于，所述熒光物質的激發(fā)或發(fā)射光譜與所述吸光物質的吸收光譜全部或部分重疊。
5.如權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置，其特征在于，所述的待測物包括:蛋白、核酸或小分子化合物。
6.如權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置，其特征在于，所述的熒光物質選自下組:熒光素、羧基熒光素、2-甲氧基熒光素、4,5- 二甲氧基熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點、或稀土元素離子或其螯合物。
7.如權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置，其特征在于，所述的吸光物質選自下組:膠體金、納米金棒、納米銀棒或其組合。
8.如權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置，其特征在于，所述多孔膜上還包括不同于檢測區(qū)的對照區(qū)，所述對照區(qū)含有固定化的對照劑，其中，所述對照劑用于特異性結合被吸光物質標記的結合劑。
9.一種定量檢測待測物的熒光分析方法，其特征在于，包括步驟: (1)包括: (al)將待測物樣品和結合劑分別添加于滲漏檢測裝置的檢測區(qū)，或將待測物樣品和結合劑的混合物添加于所述的檢測區(qū)， 其中，所述的檢測區(qū)包含被熒光物質標記的固定化檢測劑，并且所述固定化檢測劑能與樣品中的待測物結合，從而形成“檢測劑一待測物”復合物；其中所述待測物可與結合劑結合，從而當檢測區(qū)接觸含待測物的樣品和結合劑后，在檢測區(qū)形成“檢測劑一待測物一結合劑”復合物； 或者(a2)將第二檢測劑、待測物樣品和結合劑分別添加于滲漏檢測裝置的檢測區(qū)，或將第二檢測劑、待測物樣品和結合劑的混合物添加于所述的檢測區(qū)， 其中，所述的檢測區(qū)包含固定的第一檢測劑，其中，所述第一檢測劑被熒光物質標記，能與可流動的第二檢測劑形成復合檢測劑，并且所述復合檢測劑能與樣品中的待測物結合，從而形成“復合檢測劑一待測物”復合物；所述待測物可與結合劑結合，從而當檢測區(qū)接觸第二檢測劑、含待測物的樣品和結合劑后，在檢測區(qū)形成“復合檢測劑一待測物一結合劑，，復合物; 并且，所述結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述熒光物質的熒光強度； (2):檢測所述檢測區(qū)的熒光強度F，從而測得待測物的存在與否或數(shù)量。
10.一種定量檢測待測物的熒光分析方法，其特征在于，包括步驟: (1)包括: (bl)將待測物樣品和結合劑依次添加于滲漏檢測裝置的檢測區(qū)，或者將待測物樣品和結合劑的混合物添加于所述的檢測區(qū)， 其中，所述的檢測區(qū)包含被熒光物質標記的固定化檢測劑，并且所述固定化檢測劑能與結合劑結合，從而形成“檢測劑一結合劑”復合物；其中所述結合劑還可與待測物結合，從而當檢測區(qū)接觸待測物樣品和結合劑后，在檢測區(qū)形成“檢測劑一結合劑”復合物； 或者 (b2)將待測物樣品、第二檢測劑和結合劑依次添加于滲漏檢測裝置的檢測區(qū)， 或者首先提供一將待測物樣品和第二檢測劑的第一混合物，然后將結合劑和第一混合物依次添加于所述的檢測區(qū)，或者將結合劑和第一混合物所形成的第二混合物添加于所述的檢測區(qū)， 或者首先提供一待測物樣品和結合劑的第三混合物，然后將第二檢測劑和第三混合物依次添加于所述的檢測區(qū)，或者將第二檢測劑與第三混合物所形成的第四混合物添加于所述的檢測區(qū)， 其中，所述的檢測區(qū)包含固定的第一檢測劑，其中，所述第一檢測劑被熒光物質標記，能與可流動的第二檢測劑形成復合檢測劑，并且所述復合檢測劑能與結合劑結合，從而形成“復合檢測劑一結合劑”復合物；其中所述結合劑可與待測物結合，從而當檢測區(qū)接觸待測物樣品、第二檢測劑和結合劑后，在檢測區(qū)形成“復合檢測劑一結合劑”復合物； 并且，所述結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述熒光物質的熒光強度； (2)檢測所述檢測區(qū)的熒光強度F，從而測得待測物的存在與否或數(shù)量。
11.如權利要求9或10所述的方法，其特征在于，步驟(2)包括:將檢測區(qū)的熒光強度F和標準曲線或者與未加樣的初始熒光強度進行比較，從而確定待測物的存在與否或數(shù)量。
12.一種定量檢測待測物的熒光檢測裝置，其特征在于，所述的裝置包括: (a)一權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置；和 (b)一用于檢測熒光強度的檢測 器。
【文檔編號】G01N33/564GK103713126SQ201210378333
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年9月29日 優(yōu)先權日:2012年9月29日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:龐磊