檢測方法、微陣列的分析方法及熒光讀取裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及檢測微陣列的表面的凹凸形狀的高度的差異的檢測方法、微陣列的分 析方法W及巧光讀取裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 1990年W來，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)方面被稱為微陣列的技術(shù)的開發(fā)進展，逐漸被 利用。微陣列在玻璃、塑料等基板上固定有數(shù)十~數(shù)萬探針，將被巧光分子等標(biāo)記了的樣品 (祀）應(yīng)用于該基板，W巧光等檢測探針與樣品的結(jié)合反應(yīng)。微陣列能夠一次進行網(wǎng)羅性測 定，今后期待成為定制醫(yī)療所需。
[000引 W主，已知將DNA作為探針而固定于基板的DNA微陣列（W下，DNA巧片）、將蛋白 質(zhì)作為探針而固定于基板的蛋白質(zhì)微陣列、將多個微小標(biāo)本作為探針而固定化于基板的組 織微陣列、將多個低分子化合物作為探針固定化于基板的化合物微陣列等。
[0004] 其中，DNA巧片的實用化最發(fā)展，與疾病相關(guān)的基因的探索、使用該基因進行檢查、 診斷的研究活躍地進行，一部分已實用化。
[000引 W下對作為微陣列的一方式的DNA巧片，進行詳細地說明。
[0006] DNA巧片在由玻璃、樹脂等構(gòu)成的基板上網(wǎng)格狀地點樣（固定化）有DNA。在DNA 巧片上，作為能夠與被標(biāo)記的DNA樣品特異性反應(yīng)的探針，點樣有單鏈的DNA值NA探針）。另 外，DNA探針使用序列已知的探針。另一方面，對于應(yīng)當(dāng)分析的未知序列的DNA樣品（單鏈 DNA)，預(yù)先附上能夠進行光學(xué)檢測的發(fā)光或巧光標(biāo)記。該樣一來，在將應(yīng)當(dāng)分析的未知序列 的DNA樣品注入至DNA巧片上的情況下，如果該DNA樣品的序列與DM探針的序列存在互 補關(guān)系，則DNA探針與DNA樣品結(jié)合而成為雙鏈的DNA。因此，如果將未與DNA探針結(jié)合的 DNA樣品全部洗掉，使殘存于DNA巧片上的想要判定的DNA樣品發(fā)光，通過讀取裝置（掃描 儀）來讀取該發(fā)光，則能夠作為圖像來觀察成為了雙鏈的DNA的狀況。目P，通過分析在DNA 巧片上發(fā)光的標(biāo)記的分布，可W分析所尋求的基因的存在、是否表達某基因、或W何種程度 表達某基因。該樣，通過在DNA巧片上構(gòu)成具有已知序列的DNA探針組，將各自不同的序列 的DNA探針搭載于DNA巧片上，從而可W檢測基因的變異、基因的表達量等。
[0007] W下，圖13中示出DNA巧片分析的一系列處理工序的詳細內(nèi)容。
[000引在圖13所示的前處理工序中，將從檢體提取的DNA樣品中所包含的未知的DNA擴 增，對該些DNA附與巧光標(biāo)記（例如，切3、切5等）（步驟S201)。
[0009] 接下來在雜交工序中，在搭載有多種DNA探針的DNA巧片的基板上，滴加附與了巧 光標(biāo)記的DNA樣品。該里，如果DNA樣品與被點樣了的DNA探針存在互補關(guān)系，則結(jié)合而成 為雙鏈（步驟S202)。
[0010] 接下來，在洗漆工序中，利用規(guī)定的洗漆液，將被雜交了的DNA巧片進行洗漆（步 驟S203)。由此，未與網(wǎng)格狀地配置的DNA探針結(jié)合的DNA樣品全部被洗掉。
[001U接著，對洗漆后的DNA巧片照射光進行掃描（步驟S204)。在掃描工序中，將適于 激發(fā)巧光標(biāo)記的波長的激光照射至DNA巧片，取得來自與各DNA探針分別結(jié)合了（雜交了） 的DM樣品的巧光作為電信號。由此，可W測定對與被點樣了的各DM探針（基因）結(jié)合 了的DNA樣品附與的巧光標(biāo)記的發(fā)光量，基于此進行分析處理，獲得巧光圖像數(shù)據(jù)。
[0012]在分析工序中，對于所得的巧光圖像數(shù)據(jù)，利用模板來算出各點的巧光強度，執(zhí)行 各種分析（步驟S205)。
[001引該里，圖14顯示DNA巧片分析所使用的DNA巧片100的一例。圖14所示的DNA巧片100形成具有凹凸形狀的矩形板狀。DNA巧片100具有板面被分割成格子狀的多個塊 101。在該塊101的上面形成有多個點102,所述多個點102形成大致圓柱狀或平截頭臺狀 地進行設(shè)置，固定多個與各個基因?qū)?yīng)的DNA探針，在行方向和列方向上W規(guī)定數(shù)、矩陣狀 地排列。此外，多個塊101形成于棱柱狀地凹陷而成的凹部103的底部。另外，點102上所 配置的DNA探針分別對應(yīng)于已經(jīng)破譯了其堿基序列的彼此不同的基因，塊101上的其配置 位置已預(yù)先確定。
[0014] 此外，圖15顯示對于DNA巧片的巧光圖像數(shù)據(jù)適用的模板的一例。如圖15所示， 模板分割成多個（例如，在圖15中為32個）塊（與塊101對應(yīng)），在各塊內(nèi)設(shè)置有m行n 列（在圖15中為22X22)的配置成矩陣狀的檢測區(qū)域（與DM巧片100的各個點102對 應(yīng)）。
[0015] 在上述分析工序中，對讀取到的DNA巧片的巧光圖像數(shù)據(jù)中的各個點102,擬合 (對準(zhǔn)）分析工具所提供的模板的檢測區(qū)域，算出在該檢測區(qū)域中各點102的巧光強度。此 時，為了執(zhí)行準(zhǔn)確的分析，需要準(zhǔn)確地執(zhí)行對準(zhǔn)處理，對圖像上的各個點102正確地設(shè)定模 板的各個檢測區(qū)域。
[0016] 作為該對準(zhǔn)的方法，有W塊單元進行對準(zhǔn)的圖案匹配法、投影法等。而且，也可如 專利文獻1所公開的技術(shù)那樣，嘗試使用點樣有被稱為陽性對照的巧光物質(zhì)、任何檢體中 都包含的持家基因的巧片，準(zhǔn)確地進行對準(zhǔn)。
[0017] 進一步，還考察了如專利文獻2所公開的技術(shù)那樣，W來自基板的反射光、散射光 將凹凸形狀圖像化，由該圖像進行對準(zhǔn)的方法。
[0018] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0019] 專利文獻
[0020] 專利文獻1 ;日本特開2005-172840號公報
[0021] 專利文獻2 ;日本特開2005-24532號公報

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 發(fā)明所要解決的課題
[002引然而，W塊單元進行對準(zhǔn)的典型的圖案匹配法、投影法中，都是雜交了的樣品DNA的量多，如果各塊101中發(fā)出充分強度的巧光的點102不存在1/4至半數(shù)左右，則不能正確 地對準(zhǔn)。因此，在由檢體提取的樣品中所包含的DNA量少的情況下，有時不能正常地進行對 準(zhǔn)。
[0024] 另一方面，在將巧光物質(zhì)進行點樣來配置的方法中，雖然有即使發(fā)出充分強度的 巧光的點少也可進行對準(zhǔn)該樣的優(yōu)點，但有可在點102上配置的DNA數(shù)減少，巧片制造時的 成本上升等問題。此外，在將巧光物質(zhì)進行點樣的情況下，在雜交中它們游離，會將陽性對 照的周邊污染，有可能得不到數(shù)據(jù)。
[0025] 本發(fā)明是鑒于上述情況而提出的，其目的在于提供能夠取得準(zhǔn)確地檢測基板的高 度的差異的圖像的檢測方法、微陣列的分析方法W及巧光讀取裝置。
[0026] 用于解決課題的方法
[0027] 為了解決上述課題，實現(xiàn)目的，本發(fā)明所設(shè)及的檢測方法的特征在于，是將通過透 鏡而被聚光后的激光照射于具有凹凸形狀的基板，取得來自該基板的反射光和/或散射光 的光強度作為圖像數(shù)據(jù)，檢測上述凹凸形狀的高度的差異的檢測方法，在與上述透鏡的焦 點位置相比靠近上述透鏡的位置配置上述基板的光照射面，接收來自該光照射面的反射光 和/或散射光作為檢測光，基于該接收到的光的強度的變化，檢測上述基板的高度的差異。 [002引此外，本發(fā)明所設(shè)及的檢測方法的特征在于，在上述發(fā)明中，使用在將上述基板的 光照射面配置于上述焦點位置的情況下，將來自該光照射面的正反射光從上述檢測光中分 離的光學(xué)系統(tǒng)，進行上述基板的高度的檢